CN109718393A - 一种用于肿瘤治疗和修复的纳米复合纤维膜及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明采用聚乳酸、聚己内脂以及硫化亚铜纳米颗粒为原料，利用图案化静电纺丝技术制备了一种兼具肿瘤治疗和创面修复双重功能的纳米复合纤维膜。所述纳米复合纤维膜在近红外光照射下可以迅速升温，从而有效杀死肿瘤细胞，抑制肿瘤的增长。而且，纤维膜能够持续释放铜离子，促进创伤区域的血管新生，显著提高皮肤创面的愈合速度。因此，本发明为临床上肿瘤的治疗和修复以及软组织伤口愈合提供了一种简单有效的方案，在肿瘤治疗和组织修复领域具有很好的应用前景。

Description

一种用于肿瘤治疗和修复的纳米复合纤维膜及其制备方法和 用途

技术领域

本发明涉及一种用于皮肤黑色素瘤治疗和皮肤创伤愈合的图案化复合纳米纤维膜及其制备方法和用途，具体涉及一种新型的含有Cu₂S纳米颗粒的静电纺丝材料及其制备方法和用途，属于组织工程材料技术领域。

背景技术

皮肤组织对人体非常重要，具有感受外界刺激以及保护身体内脏器官免受损伤的作用。皮肤疾病多样，其中黑色素瘤是常发于皮肤的死亡率最高的疾病。黑色素瘤是一种黑色素细胞的恶性肿瘤，它主要源于皮肤、粘膜、眼和中枢神经系统等色素沉着区域，主要分布于皮肤表面，多见于足底、外阴及肛门周围。黑色毒瘤恶性程度很高，被认为是侵袭能力较强且比较耐受的肿瘤之一，是死亡率最高的皮肤恶性肿瘤，由于环境因素以及工作压力等因素导致黑色素瘤在全球范围内发病率不断提高。目前手术切除仍然是最常用且首选治疗黑色素瘤的手段，但是如何在治疗过程中将黑色素瘤细胞完全去除以防止其复发是急需解决的临床问题，并且割除肿瘤后给患者带来的创伤是人们容易忽视的问题。目前为止，还没有一种治疗手段具有杀伤肿瘤细胞并且促进皮肤创面愈合的作用。所以，研发一种兼具杀伤黑色素瘤细胞且促进因肿瘤割除引起的皮肤创面愈合的双功能的组织工程材料具有重大的意义。

近年来，光热治疗(PTT)作为一种无创且副作用小的癌症治疗新方法得到广泛的研究。在探索将PTT用于癌症的治疗的过程中，光热转化材料发挥了非常重要的作用，它能够将近红外光(NIR,λ＝700‐1100nm)转化为热能，尤其是红外光在光热材料存在的情况下可以穿透几厘米深度的组织而受到极广泛关注。近年来，半导体硫化亚铜纳米粒子(如：Cu_2-xS,_14-16Cu₇S₄₁₇和Cu₉S₅)由于优异的近红外光吸收能力和光转换性能被认为是很有前景的光热转化材料。已有研究表明，半导体硫化亚铜纳米粒子能够在体外或者体内杀伤肿瘤细胞。将半导体硫化亚铜纳米粒子粉末直接施加到肿瘤部位是比较简易的做法，然后在近红外光的照射下杀伤肿瘤。然而，直接将粉末状的半导体硫化亚铜纳米粒子施加到肿瘤上，待肿瘤被外科手术割除后粉末易粘附在外科手术伤口表面。另外，直接将纳米粒子粉末施加到伤口表面会导致金属离子释放不可控，进而引发机体产生较强的免疫应答反应，对组织再生造成不良影响。因此，将半导体硫化亚铜纳米粒子与皮肤创伤修复相关的材料结合起来，研发新的具双功能的生物材料杀伤肿瘤以及由肿瘤割除引起的皮肤损伤具有重要意义。

近年来，静电纺丝纳米纤维膜因其微观结构被广泛应用于组织修复领域，利用简单的静电纺丝技术可以纺织出来多种微观形貌可控的纳米纤维膜。静电纺丝纳米纤维膜能够高度的模拟细胞外基质(ECM)的结构，具有高的比表面积，高的孔隙率以及良好的生物相容性，为细胞的增殖，粘附和迁移提供力学支撑。为了得到电纺丝性能和生物性能良好的电纺纤维膜，几种聚合物的共混溶液比单组分生物聚合物溶液更常用于制备电纺聚合物纤维。在静电纺丝的过程中，可以使药物嵌入电纺纤维丝内部或者表面，提高了电纺纤维丝的生物活性促进伤口愈合的效率。Zhao等研究发现，铜离子能够促内皮细胞的增殖和血管新生，将掺杂铜离子的生物活性玻璃与静电纺丝纳米纤维膜结合有利于血管生成进而加速伤口愈合。目前，基于Cu₂S的纳米粒子作为光热材料被广泛的应用到肿瘤治疗中去，但是，先前的研究主要集中在研究其光热的性能用于肿瘤的治疗。但是，目前没有关于将Cu₂S的纳米粒子作为组织修复材料的报道。所以，综合利用Cu₂S的纳米粒子的光热性能以及铜离子促进血管新生的作用，研发具有杀伤肿瘤效果和促进皮肤组织修复双功能的生物材料具有重要的意义。

发明内容

本发明采用图案化静电纺丝技术将聚乳酸和聚己内酯混合，突破常规思路，引入新型光热试剂硫化亚铜Cu₂S纳米颗粒(纳米花粉体)，以利用其光热性能和Cu离子的潜在促进血管性能生成的性能，利用图案化静电纺丝技术制备出一种具有序微图案的无机/有机纳米复合纤维膜。即，本发明用于兼具光热抗肿瘤和创面修复的双功能纳米复合纤维膜，所述纳米复合纤维膜为有机/无机复合的纳米纤维材料。当用于皮肤肿瘤切除导致的伤口时，在近红外光照射下可迅速升温，造成肿瘤部位局部过高热，从而有效杀死肿瘤细胞，清除残余的肿瘤细胞，抑制肿瘤的增长和复发。此外，当该材料施用于普通软组织伤口时，随着伤口部位复合膜的降解，铜离子会持续释放入细胞环境中，刺激促伤口愈合因子的释放，利用其本身的成血管特性加快伤口愈合的速度，而不需要额外添加促生长因子等，促进创伤区域的血管新生，显著提高皮肤创面的愈合速度。因此，本发明除了用于浅表层肿瘤的治疗及修复外，还可用于普通创面的愈合，尤其是促进糖尿病引起的软组织伤口的愈合。

本发明的目的之一是提供一种纳米复合纤维膜的制备方法，将聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)和硫化亚铜(Cu₂S)纳米颗粒组成的混合溶液通过图案化静电纺丝制备得到。

本发明纳米复合纤维膜的制备方法，所述方法包括：(1)将聚乳酸、聚己内酯和硫化亚铜纳米颗粒溶于有机溶剂中，搅拌得到混合悬浮液；(2)将所述混合悬浮液进行图案化静电纺丝，收集得到微图案纳米复合纤维膜；(3)将静电纺丝过程中收集的所述微图案纳米复合纤维膜进行真空干燥，去除残留溶剂，得到所述纳米复合纤维膜。

其中，步骤(1)中，所述聚乳酸：聚己内酯：硫化亚铜纳米颗粒的重量比为10-20：10-20：1-5；优选地，为10：10：1-5；进一步优选地，为10：10：1，10：10：4或10：10：2。

其中，步骤(1)中，所述硫化亚铜纳米颗粒由Cu(NO₃)₂·3H₂O，谷胱甘肽和溴化十六烷三甲基铵的混合水溶液经过水热法合成，其直径为200-600nm。

其中，步骤(1)中，所述有机溶剂为四氢呋喃(THF)和/或N，N-二甲基甲酰胺(DMF)；优选为THF：DMF的混合溶剂；当采用THF：DMF的混合溶剂时，优选地，所述THF：DMF溶剂体积比为1：(3-5)，进一步优选地，为1：(3-4)；更进一步优选地，为1：3.8或1：3.9。

其中，步骤(1)中，所述Cu₂S重量占聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)的总重量为10％-50％。

其中，步骤(1)中，所述搅拌优选在常温下进行；进一步优选以600rpm/min的转速常温搅拌6-18h。

其中，步骤(2)中，所述图案化静电纺丝过程优选在常温条件下进行。

其中，步骤(2)中，所述图案化静电纺丝过程所采用的电纺条件为：电压8-12Kv，流速0.01-0.04mL/min，间距为10-20cm，沉积时间为1-20min，相对湿度为40-70％。

优选地为，常温条件下，电压10Kv，流速0.015mL/min，间距为10-20cm，沉积时间为8-20min，相对湿度为40-70％；

进一步优选地为，常温条件下，电压10kV，流速0.015mL/min，间距为12cm，沉积时间为5min，相对湿度为60％。

其中，步骤(2)中，所述微图案纳米复合纤维膜为具有有序微米级图案的纳米复合纤维膜。

其中，步骤(2)中，图案化静电纺丝采用的接收器模板结构可为圆形、正方形、长方形或平行四边形的有序多孔金属网筛。优选地，所述模板结构为圆形、正方形或菱形，更进一步优选地，为圆形。

其中，步骤(3)中，将微图案纤维膜浸泡在戊二醛/乙醇溶液中进行固定后，置于真空干燥箱进行干燥，优选在常温下干燥24h。

在一个具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)将聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)和硫化亚铜纳米颗粒(Cu₂S)以10-20：10-20：1-5的重量比，溶解于四氢呋喃(THF)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)混合溶剂中，置于磁力搅拌器上以600rpm/min的转速常温搅拌6-18h得到均一的，Cu₂S重量相对高分子总重量10％-50％混合电纺溶液；

(2)将所制得均一的混合电纺溶液置于电纺丝装置上，设置电压为8-12Kv，流速为0.01-0.04ml/min，间距为10-20cm，沉积时间为1-20min，相对湿度为40-70％，在室温条件下进行电纺；并采用图案化模板进行收集；

(3)将图案化静电纺丝过程所收集的纤维膜置于真空干燥箱，常温干燥24h；得到所述纳米复合纤维膜。

本发明的另一个目的提供一种纳米复合纤维膜，所述纳米复合纤维膜包含聚乳酸、聚己内酯和硫化亚铜纳米颗粒。其中，所述复合纳米纤维膜通过对由聚乳酸、聚己内酯和硫化亚铜组成的混合液体进行图案化静电纺丝制备而成。

本发明的另一个目的是提供一种通过上述方法制备得到的纳米复合纤维膜。

本发明中，所述用于纳米复合纤维膜为无机、有机纳米复合纤维膜，具有整齐有序的多孔结构(优选为300μm圆孔图案)；孔内纤维密度较小，孔壁纤维密度较大，Cu₂S纳米颗粒在共纺的条件下均匀地纺入到纤维内部，所述用于硫化亚铜纳米复合纤维膜具有近红外激光照射下迅速升温的性质，可有效杀死肿瘤细胞。

本发明中，所述纳米复合纤维膜可以接种治疗性药物；所述药物是杀伤肿瘤的药物以及促进伤口愈合的细胞、细胞因子、抗生素。本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括所述纳米复合纤维膜和治疗性药物；所述药物是杀伤肿瘤的药物以及促进伤口愈合的细胞、细胞因子、抗生素。

本发明的另一个目的是提供所述纳米复合纤维膜在制备用于肿瘤的治疗、修复和促进伤口愈合的医疗产品中的应用。

其中，所述肿瘤包括浅表层肿瘤，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，胰腺癌，胃癌，肺癌等。所述肿瘤优选为浅表层肿瘤，进一步优选为皮肤癌，所述皮肤癌为皮肤表皮发生的恶性肿瘤，有基底细胞癌和鳞状细胞癌，尤其针对黑色素瘤等浅表层肿瘤。

其中，所述伤口优选为软组织伤口，包括皮肤或肌肉的烧伤、手术损伤、意外创伤等软组织伤口，或由疾病，例如癌症或肿瘤、糖尿病、溃疡引起的伤口，不包括硬组织伤口，例如骨组织及其附属细胞、粘膜的伤口，牙组织及其牙周细胞、粘膜的伤口。优选地，所述软组织伤口为皮肤癌临床治疗时切除肿瘤病灶引发的皮肤创面，或糖尿病引起的伤口，所述糖尿病包括I型、II型糖尿病。在更具体的实施方案中，所述肿瘤为黑色素瘤，伤口是去除黑色素瘤引起的皮肤破损。

优选地，本发明还提供了一种所述纳米复合纤维膜在用于人源黑色素瘤(A375)治疗和修复的医疗产品中的应用。

本发明还提供了一种所述纳米复合纤维膜在促进人皮肤真皮细胞和血管内皮细胞的增殖，粘附和迁移的医疗产品中的应用。优选地，所述纳米复合纤维膜用于促进人皮肤真皮细胞(HDFs)和血管内皮细胞(HUVECs)的增殖，粘附和迁移。

本发明中，所述用于纳米复合纤维膜可直接作用于肿瘤切除导致的伤口上，先利用近红外光照射材料使其升温杀死手术残余的肿瘤细胞，随后复合纤维逐渐降解，释放出具有成血管功能的铜离子，提高伤口愈合速度。

本发明的有益效果在于，本发明体外实验研究表明，在红外光照射下，该复合纳米纤维膜能够有效地杀死皮肤肿瘤细胞A375和B16F10，并且体内明显地抑制B16F10肿瘤的生长。同时，该复合纳米纤维膜能够有效地促进人皮肤真皮细胞(HDFs)和血管内皮细胞(HUVECs)的增殖，粘附和迁移。体内伤口愈合实验表明该材料具有促进伤口愈合的作用。因此，本发明为临床上肿瘤的治疗和修复以及软组织伤口愈合提供了一种简单有效的方案，在肿瘤治疗和组织修复领域具有很好的应用前景。

术语和定义

术语“硫化亚铜”，是一种含有Cu和S的化合物，分子式为Cu₂S。硫化亚铜中铜呈+1价，硫呈-2价。硫化亚铜只有很窄的化学计量变化范围：Cu_1.997S至Cu₂S。呈黑色或灰黑色，在自然界中形成辉铜矿。用作制防污涂料、固体润滑剂、催化剂、太阳电池等。本课题中硫化亚铜粉体是采用Cu(NO₃)₂·3H₂O，谷胱甘肽和溴化十六烷三甲基铵在水溶液体系下经过水热法合成的Cu₂S纳米颗粒。研究证明，该纳米颗粒具有在近红外激光照射下迅速升温的特性，同时含有治疗性离子Cu有助于血管的形成，性能尚处于科研阶段。

术语“图案化静电纺丝”，是一种采用多孔金属导电模板作为收集板，使得静电作用下丝线在不同区域沉积，从而得到多孔图案结构的纤维膜的新型材料制备技术。可用于制备某些对结构有特殊要求的功能材料，如皮肤组织工程等，目前尚处于科研阶段。

术语“水热合成法”，指温度为100～1000℃、压力为1MPa～1GPa条件下利用水溶液中物质化学反应所进行合成的方法。在亚临界和超临界水热条件下，由于反应处于分子水平，反应活性提高，因而水热反应可以替代某些高温固相反应。又由于水热反应的均相成核及非均相成核机理与固相反应的扩散机制不同，因而可以创造出其它方法无法制备的新化合物和新材料。本实验中，硫化亚铜颗粒水热制备过程为首先将0.2g Cu(NO₃)₂·3H₂O,0.307g谷胱甘肽和1.0g溴化十六烷三甲基铵混合溶解于30mL去离子水中，并在40℃下搅拌30min形成均一溶液，之后将溶液转移进聚四氟乙烯内胆的不锈钢高压釜内加热至120℃并持续24h。产物为深褐色粉体。

术语“10：10：1-5的重量份比例”，指三种成分按所述重量份进行比较，因此凡是使用其他比例的形式，例如质量或重量含量百分比，体积百分比等，只要换算成重量份之后落入上述范围，这种其他比例的形式都与该术语的含义相同。

附图说明

图1为实施例1中所制备得到的材料的微观形貌和元素组成表征。图1A和B、图1C和D、图1E和F、图1G和H、图1I和J、图1K和L分别为0CS-PLA/PCL、10CS-PLA/PCL、20CS-PLA/PCL、30CS-PLA/PCL、40CS-PLA/PCL和50CS-PLA/PCL纳米复合纤维膜不同倍数下的扫描电镜照片。图1M和O分别为0CS-、30CS-PLA/PCL纳米复合纤维膜的高分辨扫描电镜照片；图1N和P分别为0CS-、30CS-PLA/PCL纳米纤维膜的透射电镜照片。图1Q为30CS-PLA/PCL纳米纤维膜的背散射电子像；图1R和S分别为30CS-PLA/PCL纳米纤维膜中Cu和S元素的EDS元素面扫描结果；图1T为30CS-PLA/PCL纳米纤维膜的EDS元素定量能谱分析。以上图片表明CS-PLA/PCL纳米纤维膜表现出规整有序的多孔(300μm)的微图案结构；纳米复合纤维线的直径随着丝线内部Cu₂S纳米颗粒含量的增加呈现出减小的趋势。

图2为实施例1中所制备得到的材料的光热性能表征。图2A和C分别为干状态下CS-PLA/PCL纳米复合纤维膜在功率密度为0.50W·cm^-2的808nm近红外光连续照射5min过程中的实时红外热成像照片和光热升温曲线；图2B和D分别为湿状态下CS-PLA/PCL纳米纤维膜在以同样功率密度的808nm激光照射10min过程中的实时红外热成像照片和光热升温曲线。图2E为在湿状态下，不同Cu₂S含量的CS-PLA/PCL膜在不同功率密度的808nm激光辐照10min后的最终温度变化曲线。30CS-PLA/PCL膜可以在808nm激光照射下快速升温，显示出优越的光热转化性能。

图3为实施例1中所制备得到的材料的体外抗肿瘤作用的研究。图3A和B分别为生长在CS-PLA/PCL膜上的皮肤肿瘤细胞(即B16F10和A375细胞)，在激光照射(808nm，0.50W·cm^-2，15min)和未照射后的激光共聚焦图片，其中红色代表细胞骨架；蓝色代表细胞核。图3C为激光照射(808nm，0.50W·cm^-2，15min)和未照射的0CS-和30CS-PLA/PCL膜周围的B16F10细胞死活细胞染色荧光照片其中绿色代表活细胞，红色表示死细胞；图3D表示在激光辐照下(808nm，0.50W·cm^-2，15min)和非辐照下，0CS和30CS-PLA/PCL膜材料周围B16F10细胞和A375细胞存活率统计结果；图3E-G分别为以不同激光功率(即温度，808nm，15min)、光照次数(808nm，0.50W·cm^-2，15min)和光照时间(808nm，0.50W·cm^-2)的激光照射下，30CS-PLA/PCL膜周围细胞存活率的统计结果(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。以上数据表明30CS-PLA/PCL膜在808nm激光辐照下能有效杀死皮肤黑色素瘤细胞，表现出显著的体外抗肿瘤效果。

图4为实施例1中所制备得到的材料的体内抗肿瘤作用的研究。图4A和B分别为在808nm激光(0.40W·cm-2，15min)照射下，0CS-PLA/PCL和30CS-PLA/PCL膜贴附的皮下黑色素瘤裸鼠(B16F10，balb/c)的肿瘤附近温度分布的热成像照片及对应的升温曲线。图4C为经过不同处理后，裸鼠肿瘤在第0天和14天的照片；图4D为经过不同处理后，裸鼠黑色素瘤的生长曲线；图4E和F分别为经过不同处理后的裸鼠在第14天的黑色素瘤的质量统计结果及对应的实体图。以上研究结果显示近红外光照射下，30CS-PCL引发的过高热能有效抑制体内肿瘤的生长。

图5为实施例1中所制备得到的材料在体内抗肿瘤作用研究中的组织学分析。图5A为经过不同处理治疗后的各组肿瘤的HE染色、TUNEL凋亡免疫荧光(绿色：凋亡细胞；蓝色：细胞核)以及Ki67免疫组化的图片及统计(***P<0.001)。以上研究结果表明激光辐照处理下的30CS-PLA/PCL膜能明显抑制肿瘤细胞在体内的增殖，促进肿瘤细胞的坏死和凋亡。

图6为实施例1中所制备得到的材料修复肿瘤性皮肤创面的的伤口愈合效果研究。图6A展示的是治疗后14天时，正常小鼠、空白处理组、0CS-PLA/PCL处理组、30CS-PLA/PCL处理组和激光辐照下30CSPLA/PCL处理组各组的肿瘤去除后伤口处的血管生成状态。图6B是治疗后14天时，不同倍数下各处理组伤口处组织的HE染色图片。根据以上研究结果，我们可以看到经光热治疗后的30CS-PLA/PCL处理组的伤口处组织呈现出正常伤口的组织结构，由有序的成纤维细胞和微血管构成，而其他对照组的伤口处组织被肿瘤组织覆盖，表现为不完全的表皮及肿瘤组织特异性的丰富血管。

图7为实施例1中所制备得到的材料的体外组织再生活性的评估结果。图7A为在0CS-和30CS-PLA/PCL膜上的人真皮层成纤维细胞(HDFs)培养24小时后的扫描电镜形貌；图7B为HDFs与0CS-和30CS-PLA/PCL膜接触1，3，5天的细胞增殖直方图；图7C，D分别为利用0CS-和30CS-PLA/PCL膜处理后，内皮细胞HUVECs的划痕实验结果的照片及对应的伤口相对面积的统计结果。以上研究结果可以看出30CSPLA/PCL膜支持HDFs细胞的粘附和增殖，并能明显促进HUVECs的迁移(*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

图8为实施例1中所制备得到的材料促进糖尿病伤口愈合的研究。图8A，B分别为空白对照组、0CS-PLA/PCL、30CS-PLA/PCL处理组伤口在第0，4，8，12天的照片及对应的创口面积定量统计结果；图8C，D分别为手术后第12天时，各处理组伤口处的成血管情况以及伤口组织内的CD31免疫荧光染色照片(绿色：CD31阳性；蓝色：细胞核)及对应的CD31阳性血管的统计结果。以上实验结果表明30CS-PLA/PCL膜可以促进糖尿病伤口处的血管生成，提高创面的愈合速度(*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：制备本发明用于皮肤黑色素瘤及伤口愈合的含Cu₂S多孔图案化纤维膜CS-PLA/PCL

聚乳酸[Poly(D,L-lactic acid)(PDLLA,Mn＝1,750,000)]购于济南岱罡生物工程有限公司，聚己内酯[Poly(ε-caprolactone)(PCL,Mn＝80,000)]购于西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich，上海)贸易有限公司.N,N-二甲基酰胺[N-dimethylformamide(DMF)]，四氢呋喃[tetrahydrofuran(THF)]，三水合硝酸铜[Cu(NO3)2·3H2O]，谷胱甘肽[glutathione(GSH)]和分析纯的十六烷基三甲基溴化铵[cetyltrimethylammoniumbromide(CTAB)]购于国药集团化学试剂有限公司。以上试剂均用来制备微图案的CS-PLA/PCL纳米复合膜。

设置空白对照组，各组设置如下：

表1：

PLA/PCL溶液指PDLLA(0.25g)和PCL(0.25g)溶于DMF(3.9mL)和THF(1.1m L)的混合溶液

首先，通过水热合成法制得Cu₂S纳米粒子，Cu(NO3)2·3H2O(0.2g)，GSH(0.307g)和CTAB(1.0g)混合溶解于30mL去离子水中40℃下搅拌30min形成均一溶液，之后将溶液转移进聚四氟乙烯内胆的不锈钢高压釜内加热至120℃并持续24h。依次用去离子水和乙醇洗涤黑色产物，通过离心分离出黑色粉体，研磨，最终在60℃真空环境下烘干备用。不同Cu₂S含量的xCS-PLA/PCL(x＝10，20，30，40和50)复合膜的制备方法如下：首先将DMF(3.9mL)和THF(1.1mL)混合搅拌1h，将PDLLA(0.25g)和PCL(0.25g)溶于以上混合溶液中(4mL)继续在30℃搅拌1.5h从而获得均一且具有粘性的PLA/PCL溶液，与此同时将不同质量的Cu₂S纳米颗粒(0，10，20，30，40或50w.t.％相对于聚合物总量)分散于混合溶剂中(1mL)并且超声1.5h合成CS悬浮液。将PLA/PCL溶液和CS悬浮液混合，持续搅拌8h之后加入10ml注射器作为静电纺丝的纺织液。

静电纺丝参数设置如下：电压为8-12kV，流速为0.015mL/min，相对湿度为50-60％，间距为15cm，沉积时间为5min，喷头内径：0.7mm。在此过程中，一个特殊定制的不锈钢圆孔网筛(孔直径:300μm)作为接收装置，水平放置在导体板上。之后将微结构纳米膜轻轻从收集板上取下，并固定在铝箔上，裁成直径为10mm圆片待用。所有的膜置于真空烘箱内维持24h以挥发掉残留溶剂。

由图1可知CS-PLA/PCL纳米复合纤维膜表现出规整有序的多孔图案化结构；Cu₂S复合纳米纤维的直径随着Cu₂S纳米颗粒含量的增加呈现出减小的趋势。

实施例2：本发明用于皮肤癌的治疗和修复的Cu₂S纳米复合纤维膜CS-PLA/PCL的光热性能验证

图2为实施例1中所制备得到的材料的光热性能表征。图2A和C分别为干状态下CS-PLA/PCL纳米复合纤维膜在功率密度为0.50W·cm^-2的808nm近红外光连续照射5min过程中的实时红外热成像照片和光热升温曲线；图2B和D分别为湿状态下CS-PLA/PCL纳米纤维膜在以同样功率密度的808nm激光照射10min过程中的实时红外热成像照片和光热升温曲线。图2E为在湿状态下，不同Cu₂S含量的CS-PLA/PCL膜在不同功率密度的808nm激光辐照10min后的最终温度变化曲线。

图2表明30CS-PLA/PCL膜可以在808nm激光照射下快速升温，显示出优越的光热转化性能。

实施例3：研究本发明在体外实验中对皮肤黑色素瘤细胞的杀伤作用

将鼠源黑色素瘤细胞(B16F10)和人源黑色素瘤(A375)细胞系用含有10％胎牛血清DMEM培养在5％CO2，37℃培养箱内。圆形CS-PCL/PLA膜(直径：10mm)紫外照射过夜灭菌。细胞以5.0×10⁴每孔的密度接种于48孔板，之后将0CS-和30CS-PLA/PCL膜小心加入孔内，之后将光照组的细胞暴露于808nm激光(0.50W·cm^-2)下15min，空白对照组细胞不做任何处理，24h后用CCK8分析来检测细胞存活率。

为了评估不同温度对细胞存活率的影响，首先将B16F10细胞培养24h，之后将0CS-和30CS-PLA/PCL膜小心加入孔内并暴露在808nm激光下，将温度小心控制在37，41，45，49，53或57℃持续15min，之后进行CCK8测试。为了评估辐照次数对肿瘤细胞活性的影响，首先将B16F10细胞培养24h，之后将0CS-和30CS-PLA/PCL膜小心加入孔内并暴露在808nm激光(0.50W·cm^-2)下，光照15min，培养12h之后进行CCK8测试；随后以同样功率密度的激光再次辐照15min，培养12h后进行CCK8测试，；以同样功率密度的激光第三次辐照15min，培养12h后进行CCK8测试。

图3A和B分别为生长在CS-PLA/PCL膜上的皮肤肿瘤细胞(即B16F10和A375细胞)，在激光照射(808nm，0.50W·cm^-2，15min)和未照射后的激光共聚焦图片，其中红色代表细胞骨架；蓝色代表细胞核。图3C为激光照射(808nm，0.50W·cm^-2，15min)和未照射的0CS-和30CS-PLA/PCL膜周围的B16F10细胞死活细胞染色荧光照片其中绿色代表活细胞，红色表示死细胞；图3D表示在激光辐照下(808nm，0.50W·cm^-2，15min)和非辐照下，0CS和30CS-PLA/PCL膜材料周围B16F10细胞和A375细胞存活率统计结果；图3E-G分别为以不同激光功率(即温度，808nm，15min)、光照次数(808nm，0.50W·cm^-2，15min)和光照时间(808nm，0.50W·cm^-2)的激光照射下，30CS-PLA/PCL膜周围细胞存活率的统计结果(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。PLA/PCL如图3A，B所示，在激光辐照处理下的30CS-PLA/PCL膜上只能观察到少量肿瘤细胞且细胞形态严重受损。然而，无近红外辐照处理的30CS-PLA/PCL膜，和膜的表面上的肿瘤细胞均良好地分布并粘附在膜表面。PLA/PCL30CS-PLA/PCL肿瘤细胞的死/活细胞染色结果(图3C)显示在激光辐射后30CS-PLA/PCL膜处理下的B16F10细胞显示红色荧光，表明细胞膜完整性被破坏，其他组细胞均表现出正常活细胞状态呈现绿色荧光。CCK-8测定(图3D)显示，30CS-PLA/PCL和+laser组各处理组相比，30CS-PLA/PCL+激光组(51℃，15分钟，一次)的B16F10细胞和A375细胞的细胞活力分别明显下降到26.4％和23.1％。此外，如图3E-G所示30CS-PLA/PCL随着光热温度升高，照射次数增加和辐照持续时间延长，B16F10细胞的存活率显著降低((57℃下为14.7％；三次辐照后为8.7％；辐照20分钟为6.3％))。所有体外实验结果均表明体外细胞培养状态下，近红外照射的L30CS-PLA/PCL膜造成高温，可有效的杀死肿瘤细胞。。

实施例4：体内光热治疗效果及促进伤口处修复作用及相关组织化学分析

本研究中的所有动物实验均按照华东师范大学生物医学与生命科学学院动物调查委员会批准的方案进行，符合动物伦理要求。在每只Balb/c裸鼠(雌性，5-7周龄)的背部以每只2×10⁶/50mL PBS的细胞密度皮下注射B16F10细胞建立皮肤黑色素肿瘤模型。肿瘤接种7天(肿瘤体积≈70mm³)后，将小鼠随机分为6组(n＝5)，分别如下：(i)对照组，(ii)激光(Laser)组，(iii)0CS-PLA/PCL组，(iv)30CS-PLA/PCL组，(v)+激光(0CS-PLA/PCL+laser)组和(vi)30CS--PLA/PCL+激光(30CS-PLA/PCL+laser)组。在肿瘤上方制造直径为10mm左右的全层皮肤切除模型，CS-PLA/PCL组由0CS-或30CS-PLA/PCL膜覆盖肿瘤上方伤口部位。对于激光治疗组，每只小鼠暴露于808nm激光(0.40W·cm-²，15分钟/次，连续辐照四天(从第0天到第3天)。肿瘤表面温度和红外热图像通过红外热成像系统进行监测和记录。肿瘤大小为每两天用卡尺测量，计算如下：肿瘤体积(V)＝(肿瘤长度)×(肿瘤宽度)²/2。两周后处死小鼠，取下肿瘤，称重并拍照。

0CS-和30CS-PLA/PCL膜用于覆盖肿瘤中的伤口区域然后以0.40W·cm^-2的功率密度曝光于808nm激光15分钟(图4A)。温度仍然保持在41℃左右激光组(不含膜)和0CS-PLA/PCL+激光组，而30CS-PLA/PCL+激光组的温度迅速升高超过50℃(图4A，B)。经过4天治疗，实验组肿瘤体积明显下降，而其余5组肿瘤以不可控制的方式增加(图4D)。最重要的是，如图4C所示，肿瘤在30CS-PLA/PCL+激光组逐渐消失，肿瘤不再复发，原始伤口甚至在14天内逐渐愈合。各种治疗后6组肿瘤质量和照片显示在图4E，F。30CSPLA/PCL+激光组的平均肿瘤重量是所有组中最轻的，进一步证实近红外光照射下的30CS-PLA/PCL膜可以有效抑制肿瘤的生长。

以上实验结果均证明，激光辐射下30CS-PLC/PCL纳米纤维膜在体内具有良好的抗肿瘤作用，并且表现出促进组织修复的潜力。

实施例5：体内抗肿瘤研究中的组织化学分析。

将肿瘤组织固定在4％(v/v)多聚甲醛溶液中48H以上，梯度脱水后包埋在石蜡中，切成5μm厚度并固定在玻片上。使用苏木精和伊红(H&E)染色用于组织病理学分析。使用Ki67作为细胞增殖的标志蛋白进行免疫组织化学染色。首先将肿瘤组织载玻片在柠檬酸钠溶液中进行抗原修复，在吐温-磷酸盐缓冲液PBST)洗3遍后，在4℃下与特异性抗体孵育过夜，链亲和素(信号放大素)在避光条件下，反应20min后进行显色，封片观察。通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光染色来评估肿瘤细胞的凋亡。首先将肿瘤切片和蛋白酶K(1:1000)一起温育，用TUNEL稀释液染凋亡细胞，DAPI染细胞核，最终使用激光共聚焦显微镜观察，并使用Image-Pro Plus6.0完成定量分析。

如图5所示，30CS-PLA/PCL+激光治疗组的肿瘤组织内Ki67表达明显降低，表明光热治疗能明显抑制肿瘤细胞增殖。H&E图像显示大多数细胞死于坏死，表现为皱缩的核和大面积的坏死胞质。TUNEL免疫荧光染色表明30CS-PLA/PCL+激光治疗组的肿瘤细胞经照光热治疗后大部分凋亡，其余5组凋亡现象不明显。以上所有结果均表明，30CS-PLA/PCL膜诱导的过高热可以抑制体内肿瘤细胞的增殖，并诱导细胞的坏死和凋亡。

实施例6：体内抗肿瘤研究中伤口愈合情况

为了进一步研究CS-PLA/PCL膜在肿瘤小鼠中的促伤口愈合作用，我们取伤口上方及伤口周边直径约为10mm的组织进行取样、固定包埋及切片，通过体式纤维镜观察肿瘤上方及周边组织的血管分布，通过HE染色观察肿瘤上方及周边组织的病理学形态及血管分布状态。

如图6所示，30CS-PLA/PCL+激光组伤口处皮肤组织结构为规律排布的成纤维细胞和微血管，而其他治疗组伤口上方被肿瘤组织覆盖，表现为肿瘤组织的特异性结构和丰富的血管网络。

实施例7：皮肤细胞粘附，增殖和迁移测定。

将人真皮成纤维细胞(HDF，2～4代)以含10％胎牛血清的DMEM培养基在5％CO 2，37℃加湿培养箱中培养。将细胞接种在24孔板(1.0×104/孔，1mL培养基)中孵育24小时。装载有0CS或30CS-PLA/PCL膜的transwell(直径：10mm)轻轻转移到每个孔中，并将细胞孵育为1，3和5天，用CCK-8测定法定量细胞增殖

为了观察细胞形态和粘附情况，我们将HDFs(2×104/孔/500μ培养基)接种在含有0CS-或30CS-PLA/PCL膜(直径：10mm)48孔培养板内。24小时后，细胞样品用2.5％(v/v)戊二醛固定20分钟，在PBS中洗涤3次，在梯度乙醇中脱水(30，50，60，70，80，90，95，100％)之后在六甲基二硅氮烷(HDMS)中干燥，最后通过SEM观察。HDF细胞也用4％多聚甲醛固定细胞骨架和细胞核用罗丹明鬼笔环肽和DAPI染色(Cytoskeleton Inc.，USA)用于在荧光共焦显微镜下观察(TCS SP8，Leica，Germany)。

为了测定CS-PLA/PCL膜对HUVECs细胞迁移迁移的影响，我们首先将人脐静脉内皮细胞(HUVECs，2～4代)接种到24孔板(1.0×10⁵/孔，1mL培养基)中，培养24小时让细胞单层铺满孔底。然后使用灭菌的100ul枪头尖端垂直向下制造一条宽度均匀的划痕然后，之后每孔用1mL培养基洗涤去除多余细胞碎片使划痕边缘平整，将一个装有0CS-或将30CS-PLA/PCL膜(直径：10mm)的小室轻轻转移到各孔中并加入1mL新鲜的培养基。12h后，用4％多聚甲醛固定细胞，用结晶紫溶液对细胞进行染色，并使用显微镜(DMI3000，Leica，Germany)进行观察，划痕实验的定量方法如下：

相对伤口面积(％)＝A/A₀×100％

最初的伤口面积(A₀)和培养12小时后的伤口面积(A)使用ImageJ软件进行统计。

如图7A人皮肤成纤维细胞(HDFs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)在0CS和30CS-PLA/PCL膜上的粘附状态良好。CCK-8细胞活力测定测定(图7B)显示在培养5天后，30CS-PLA/PCL膜上的HDF细胞的增殖率显著高于对照组和0CS-PLA/PCL。

图7C进行体外划痕实验结果，如图所示制造划痕12小时后，30CS-PLA/PCL组的划痕几乎消失。与对照组(28.1％)相比，30CS-PLA/PCL组相对伤口面积(图7D)显著降低至5.1％，这表明30CS-PLA/PCL膜可以加速血管内皮细胞的迁移。

实施例8：糖尿病伤口模型验证CS-PLA/PCL具有促进组织修复作用

通过腹膜内注射链球菌素(STZ，SigmaAldrich，60mg·kg-1in在0.1M柠檬酸盐缓冲液)诱导糖尿病小鼠(雌性，C57BL/6)，其中糖尿病随机分为对照组(n＝8)，0CS-PLA/PCL组(n＝8)和30CS-PLA/PCL组(n＝8)。首先使用薇婷脱毛膏去除糖尿病小鼠背部毛发，24小时后标准全厚度伤口(直径：10mm)，用0CS-或30CS-PLA/PCL膜覆盖伤口并用Tegaderm TM(3M，St.Paul，MN，US)固定。每两天对伤口处进行拍照观察，并使用ImageJ软件测量创面面积。伤口尺寸计算如下：相对伤口面积＝At/A₀×100％。在这里，A₀是第0天的初始伤口面积，At为第t天的伤口面积(t＝0，2，4，6，8，10和12天)。为了评估伤口处组织中的新生血管，在手术后12天对伤口部位皮肤组织(2×2cm)进行切除用于皮肤活检。血管分布状态体视显微镜观察并用相机记录。

随后，皮肤组织样品用4％多聚甲醛溶液固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋然后切成5μm厚的切片。我们使用CD31免疫荧光来分析检查伤口组织内的新生血管，皮肤组织切片在柠檬酸钠缓冲液中再水化并煮沸约20分钟，然后与CD31抗体(Abcam，Cambridge，UK)在4℃孵育过夜，DAPI用于染色细胞核。最终用激光共聚焦显微镜来观察CD31的分布情况。

如图8A，B所示，30CS-PLA/PCL组的伤口愈合率显着高于对照组和0CS-PLA/PCL组。尽管在伤口愈合早期(第2，4和6天，图8B)没有表现出显着性差异，但在手术后8天，30CS-PLA/PCL组的伤口面积与其他组相比明显减少。第12天做伤口面积统计分析，对照组，0CS-PLA/PCL组和30CS-PLA/PCL组分别为28.9％、25.5％和13.6％。CD31免疫荧光染色(图8C)所示，与对照组和0CS-PLA/PCL组相比，30CS-PLA/PCL治疗组的CD31阳性细胞(绿色)显著增多。30CS-PLA/PCL组相对于空白对照组的CD31阳性细胞比例(138.6％)明显高于(74.8％)和对照组(100％)组(图8D)，表明30CS-PLA/PCL膜可能通过促进血管新生来促进伤口愈合。总之，以上研究结果表明30CS-PLA/PCL膜可促进糖尿病慢性皮肤伤口区域的血管生成，显著提高创面的愈合速度。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (16)

1.一种纳米复合纤维膜的制备方法，其特征在于，通过对聚乳酸、聚己内脂以及硫化亚铜纳米颗粒组成的混合溶液进行图案化静电纺丝，来制备所述纳米复合纤维膜。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将聚乳酸、聚己内脂以及硫化亚铜纳米颗粒溶于有机溶剂中，搅拌得到混合悬浮液；

(2)将所述混合悬浮液进行图案化静电纺丝，收集得到微图案纳米复合纤维膜；

(3)将静电纺丝过程中收集的所述微图案纳米复合纤维膜进行真空干燥，去除残留溶剂，得到所述纳米复合纤维膜。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述聚乳酸、聚己内脂以及硫化亚铜纳米颗粒的重量比为10-20：10-20：1-5。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机溶剂为四氢呋喃和/或N，N-二甲基甲酰胺；当采用四氢呋喃和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂时，所述四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1：(3-5)。

5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述硫化亚铜纳米颗粒由Cu(NO₃)₂·3H₂O，谷胱甘肽和溴化十六烷三甲基铵的混合水溶液经过水热法合成，所述硫化亚铜纳米颗粒的直径为200-600nm。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述电纺的条件为：电压为8-12kV，流速为0.01-0.04ml/min，相对湿度为40-70％，间距为10-20cm，沉积时间为1-20min。

7.一种纳米复合纤维膜，其特征在于，所述纳米复合纤维膜包含聚乳酸、聚己内脂以及硫化亚铜纳米颗粒。

8.一种纳米复合纤维膜，其特征在于，所述纳米复合纤维膜由权利要求1～6之任一项所述的方法制备得到。

9.如权利要求7或8所述的纳米复合纤维膜，其特征在于，所述纳米复合纤维膜具有整齐有序的多孔结构图案，硫化亚铜纳米颗粒在纤维内部均匀分布。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求7或8所述的纳米复合纤维膜和治疗性药物；所述药物是杀伤肿瘤的药物以及促进伤口愈合的细胞、细胞因子、抗生素。

11.如权利要求7或8所述的纳米复合纤维膜或如权利要求10所述的药物组合物在制备用于肿瘤的治疗、修复和促进伤口愈合的医疗产品的应用。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括浅表层肿瘤，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，胰腺癌，胃癌，肺癌。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述浅表层肿瘤为皮肤癌，包括基底细胞癌和鳞状细胞癌。

14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述皮肤癌为黑色素瘤。

15.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述伤口为软组织伤口，包括皮肤或肌肉的烧伤、手术损伤、意外创伤，或由疾病引起的伤口。

16.如权利要求7或8所述的纳米复合纤维膜或如权利要求10所述的药物组合物在制备促进人皮肤真皮细胞和血管内皮细胞的增殖，粘附和迁移的医疗产品中的应用。