CN111249526A - 一种兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架及其制备方法 - Google Patents

一种兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架及其制备方法，属于生物医学材料技术领域。该方法以表面修饰有硅层的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒、聚己内酯、明胶和六氟异丙醇为原料，通过静电纺丝制备该支架。该静电纺丝支架中的亚铁离子博来霉素络合物能够靶向黑色素瘤细胞，从而促进黑色素瘤细胞内亚铁离子的积累，诱导高毒性自由基的产生，同时能够促进博来霉素介导DNA的断裂，达到治疗黑色素瘤的目的。另外，该静电纺丝支架降解后，所释放的Ca2+和明胶能够促进皮肤细胞的迁移、血管相关因子的表达和胶原的沉积，从而达到修复损伤组织的目的。本发明中静电纺丝支架制备方法简单，易操作，适合扩大化生产。

Description

一种兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架 及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架及其制备方法。
背景技术
近年来组织工程在生物医学领域快速发展，特别在组织损伤修复和药物研究实验的应用上。在材料方面，明胶、透明质酸、壳聚糖等生物相容性好的天然高分子材料被广泛运用，碳酸钙作为一种可降解、无毒的生物材料具有广泛的生物学应用，无定型的碳酸钙(ACC)具有载药量高、形貌可控等特性，是很好的药物递送工具，同时Ca和明胶能够促进皮肤细胞的迁移，血管相关因子的表达和胶原沉积，具有良好的损伤修复效果。
黑色素瘤是恶性程度最高，最难治疗的皮肤癌之一，目前手术切除是治疗实体瘤的重要手段之一，但是术后复发仍然是一个极大的缺陷。而放疗和化疗容易导致组织损伤和治疗的耐受问题。因此，迫切需要一种能够用于肿瘤术后治疗残余的肿瘤细胞和修复损伤组织的生物材料。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架的制备方法；目的之二在于提供一种兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)制备载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒
将无水氯化钙、博来霉素、无水氯化亚铁加入无水乙醇中，混匀后置于带有若干个出气孔的容器中，然后置于装有碳酸氢铵的干燥器中，室温下反应2-3d后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后，制得载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒；
(2)制备表面修饰有硅层的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒
将步骤(1)中制备的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒分散于无水乙醇中，然后加入乙二胺四乙酸、氨水，以400-800rpm的速度搅拌15min后加入正硅酸乙酯，继续以400-800rpm的速度搅拌15min后再加入水，搅拌反应12-24h后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后，制得表面修饰有硅层的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒；
(3)制备兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架
将聚己内酯、明胶、步骤(2)中制备的表面修饰有硅层的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒加入六氟异丙醇中，搅拌12-24h后获得混合溶液，将所述混合溶液转移至注射器中，通过静电纺丝制得兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架。
优选的，步骤(1)中，所述无水氯化钙、博来霉素、无水氯化亚铁和无水乙醇的质量体积比为150:15:1.26:100，所述质量体积比的单位为mg:mg:mg:mL。
优选的，步骤(2)中，所述载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒、无水乙醇、乙二胺四乙酸、氨水、正硅酸乙酯和水的质量体积比为2:20:25:400:30:400，所述质量体积比的单位为mg:mL:μL:μL:μL:μL，所述氨水的体积分数为25％。
优选的，步骤(3)中，所述聚己内酯、明胶、表面修饰有硅层的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒和六氟异丙醇的质量体积比为125:125:100:5，所述质量体积比的单位为mg:mg:mg:mL。
优选的，步骤(1)和步骤(2)中，所述离心的速度均为8000-10000rpm。
优选的，步骤(1)和步骤(2)中，所述洗涤具体为以无水乙醇为洗涤液在8000-10000rpm的速度下离心洗涤2-3遍。
优选的，步骤(3)中，所述静电纺丝参数具体为：所述注射器的喷头与接收板之间距离为10-20cm，电压为10-15kV，所述注射器的出液速率为0.5-2mL/h。
2、由所述的方法制备的兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架及其制备方法，该静电纺丝支架中的亚铁离子博来霉素络合物能够靶向黑色素瘤细胞，从而促进黑色素瘤细胞内亚铁离子的积累，诱导高毒性自由基的产生，同时能够促进博来霉素介导DNA的断裂，达到治疗黑色素瘤的目的。另外，该静电纺丝支架降解后，所释放的Ca2+和明胶能够促进皮肤细胞的迁移、血管相关因子的表达和胶原的沉积，从而达到修复损伤组织的目的。本发明中静电纺丝支架制备方法简单，易操作，适合扩大化生产。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为实施例1中制备的ACC@Fe2+BLM的SEM图；
图2为实施例1中制备的ACC@Fe2+BLM-CaSi的SEM图；
图3为实施例1中制备的ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP的SEM图(图3中A为1000倍下的SEM图，图3中B为2500倍下的SEM图)；
图4为激光共聚焦法检测黑色素瘤细胞经TCPS(空白培养基)、GP、ACC-CaSi-GP、ACC@BLM-CaSi-GP、ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP各材料处理后细胞凋亡测试结果图(图4中a为TCPS中细胞凋亡测试结果图，图4中b为经GP处理后细胞凋亡测试结果图，图4中c为经ACC-CaSi-GP处理后细胞凋亡测试结果图，图4中d为经ACC@BLM-CaSi-GP处理后细胞凋亡测试结果图，图4中e为经ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP处理后细胞凋亡测试结果图)；
图5为DNA ladder检测法检测黑色素瘤细胞经TCPS(空白培养基)、GP、ACC-CaSi-GP、ACC@BLM-CaSi-GP、ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP各材料处理后细胞凋亡测试结果图(图5中a为TCPS中细胞凋亡测试结果图，图5中b为经GP处理后细胞凋亡测试结果图，图5中c为经ACC-CaSi-GP处理后细胞凋亡测试结果图，图5中d为经ACC@BLM-CaSi-GP处理后细胞凋亡测试结果图，图5中e为经ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP处理后细胞凋亡测试结果图)；
图6为ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP支架体内肿瘤治疗和修复作用测试结果图(图6中a为对照组的治疗修复效果图，图6中b为ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP支架的治疗修复效果图)。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
制备兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架
(1)制备载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒(ACC@Fe2+BLM)
将150mg无水氯化钙、15mg博来霉素、1.26mg无水氯化亚铁加入100mL无水乙醇中，混匀后置于带有若干个出气孔的容器中，然后置于装有碳酸氢铵的干燥器中，室温下反应2.5d后以8000rpm的速度离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇为洗涤液在8000rpm的速度下离心洗涤2遍后，制得载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒；
(2)制备表面修饰有硅层的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒(ACC@Fe2+BLM-CaSi)
将2mg步骤(1)中制备的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒分散于20mL无水乙醇中，然后加入25μL乙二胺四乙酸、400μL体积分数为25％的氨水，以400rpm的速度搅拌15min后加入30μL正硅酸乙酯，继续以400rpm的速度搅拌15min后再加入400μL水，搅拌反应24h后以8000rpm的速度离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇为洗涤液在8000rpm的速度下离心洗涤2遍后，制得表面修饰有硅层的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒；
(3)制备兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架(ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP，G代表明胶，P代表聚己内脂)
将125mg聚己内酯、125mg明胶、100mg步骤(2)中制备的表面修饰有硅层的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒加入5mL六氟异丙醇中，搅拌24h后获得混合溶液，将该混合溶液转移至注射器中，设置静电纺丝参数，即注射器的喷头与接收板之间距离为15cm，电压为15kV，该注射器的出液速率为1mL/h，然后推注混合溶液，在接收板上形成静电纺丝支架，从而制得兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架。
图1为实施例1中制备的ACC@Fe2+BLM的SEM图，由图1可知，ACC@Fe2+BLM粒径大约80nm，具有良好的分散性和均一性。
图2为实施例1中制备的ACC@Fe2+BLM-CaSi的SEM图，由图2可知，ACC@Fe2+BLM表面包裹复合硅层后粒径增加到约95nm，仍保持良好的分散性。
图3为实施例1中制备的ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP的SEM图，其中，图3中A为1000倍下的SEM图，图3中B为2500倍下的SEM图，由图3可知，该混合溶液在高电压作用下能够形成形貌均一的电纺丝支架，且ACC@Fe2+BLM成功掺杂到电纺丝支架中。
实施例2
检测黑色素瘤细胞经TCPS(空白培养基)、GP、ACC-CaSi-GP、ACC@BLM-CaSi-GP、ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP各材料处理后细胞凋亡情况
1、激光共聚焦法检测
(1)制备GP
将125mg聚己内酯和125mg明胶加入5mL六氟异丙醇中，搅拌24h后获得混合溶液，将该混合溶液转移至注射器中，设置静电纺丝参数，即注射器的喷头与接收板之间距离为15cm，电压为15kV，该注射器的出液速率为1mL/h，然后推注混合溶液，在接收板上形成静电纺丝支架，从而制得GP。
(2)制备ACC-CaSi-GP
将150mg无水氯化钙加入100mL无水乙醇中，混匀后置于带有若干个出气孔的容器中，然后置于装有碳酸氢铵的干燥器中，室温下反应2.5d后以8000rpm的速度离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇为洗涤液在8000rpm的速度下离心洗涤2遍后，制得无定型碳酸钙纳米颗粒；
将2mg无定型碳酸钙纳米颗粒分散于20mL无水乙醇中，然后加入25μL乙二胺四乙酸、400μL体积分数为25％的氨水，以400rpm的速度搅拌15min后加入30μL正硅酸乙酯，继续以400rpm的速度搅拌15min后再加入400μL水，搅拌反应24h后以8000rpm的速度离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇为洗涤液在8000rpm的速度下离心洗涤2遍后，制得表面修饰有硅层的无定型碳酸钙纳米颗粒；
将125mg聚己内酯、125mg明胶、100mg表面修饰有硅层的无定型碳酸钙纳米颗粒加入5mL六氟异丙醇中，搅拌24h后获得混合溶液，将该混合溶液转移至注射器中，设置静电纺丝参数，即注射器的喷头与接收板之间距离为15cm，电压为15kV，该注射器的出液速率为1mL/h，然后推注混合溶液，在接收板上形成静电纺丝支架，从而制得ACC-CaSi-GP。
(3)制备ACC@BLM-CaSi-GP
将150mg无水氯化钙和15mg博来霉素加入100mL无水乙醇中，混匀后置于带有若干个出气孔的容器中，然后置于装有碳酸氢铵的干燥器中，室温下反应2.5d后以8000rpm的速度离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇为洗涤液在8000rpm的速度下离心洗涤2遍后，制得载博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒；
将2mg载博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒分散于20mL无水乙醇中，然后加入25μL乙二胺四乙酸、400μL体积分数为25％的氨水，以400rpm的速度搅拌15min后加入30μL正硅酸乙酯，继续以400rpm的速度搅拌15min后再加入400μL水，搅拌反应24h后以8000rpm的速度离心取沉淀，将沉淀以无水乙醇为洗涤液在8000rpm的速度下离心洗涤2遍后，制得表面修饰有硅层的载博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒；
将125mg聚己内酯、125mg明胶、100mg表面修饰有硅层的载博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒加入5mL六氟异丙醇中，搅拌24h后获得混合溶液，将该混合溶液转移至注射器中，设置静电纺丝参数，即注射器的喷头与接收板之间距离为15cm，电压为15kV，该注射器的出液速率为1mL/h，然后推注混合溶液，在接收板上形成静电纺丝支架，从而ACC@BLM-CaSi-GP。
将B16F10黑色素瘤细胞接在共聚焦皿中，接1×105个细胞加0.5mL培养基，在37℃，5％CO2培养箱培养过夜(细胞生长至占共聚焦皿面积的70％)，分别加入TCPS(空白培养基)、GP、ACC-CaSi-GP、ACC@BLM-CaSi-GP、ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP分别孵育，48h后利用激光共聚焦检测细胞凋亡情况，结果如图4所示，图4中FDA染的是活细胞，PI染的是死细胞中，图4中a为TCPS中细胞凋亡测试结果图，图4中b为经GP处理后细胞凋亡测试结果图，图4中c为经ACC-CaSi-GP处理后细胞凋亡测试结果图，图4中d为经ACC@BLM-CaSi-GP处理后细胞凋亡测试结果图，图4中e为经ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP处理后细胞凋亡测试结果图，由图4可知，图4中a、b、c具有明显的绿色荧光(FDA活细胞荧光染料)，几乎没有红色荧光出现(死细胞荧光染料)，说明GP和ACC-CaSi-GP对肿瘤细胞没有杀伤效果，而图4中d、e中活细胞数量减少(绿色荧光FDA)，凋亡细胞增加(红色荧光PI)，且图4中e和d相比，绿色荧光大大减少，红色荧光明显增加，说明博来霉素能够促进肿瘤细胞的凋亡，在博来霉素螯合亚铁离子后能够极大诱导细胞凋亡。
2、DNA ladder检测
将B16F10黑色素瘤细胞接在48孔板中，接3×104个细胞加0.5mL培养基，在37℃，5％CO2培养箱培养过夜(细胞生长至占共聚焦皿面积的70％)，分别加入TCPS(空白培养基)、GP、ACC-CaSi-GP、ACC@BLM-CaSi-GP、ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP分别孵育，48h后利用DNAladder凋亡检测试剂盒提取DNA并通过凝胶电泳检测细胞凋亡，结果如图5所示，图5中a为TCPS中细胞凋亡测试结果图，图5中b为经GP处理后细胞凋亡测试结果图，图5中c为经ACC-CaSi-GP处理后细胞凋亡测试结果图，图5中d为经ACC@BLM-CaSi-GP处理后细胞凋亡测试结果图，图5中e为经ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP处理后细胞凋亡测试结果图，由图5可知，图5中a、b、c的条带保持在初始位置，没有出现ladder，说明DNA未断裂，细胞没有发生凋亡，图5中d、e的条带中出现了明显的ladder，且图5中e的ladder要比图5中d的ladder多，说明博来霉素能够促进DNA的断裂诱导细胞的凋亡，螯合亚铁离子后能够显著增强细胞的凋亡。
实施例3
测试ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP支架体内肿瘤治疗和修复作用
C57BL/6小鼠通过皮下注射B16F10黑色素瘤细胞(1×106个/只)，待肿瘤生长到直径为8mm时，在肿瘤部位切出直径10mm的伤口，然后植入ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP支架，14天后观察小鼠的肿瘤生长和伤口的修复情况，以不植入静电纺丝支架作为对照，结果如图6所示，其中，图6中a为对照组的治疗修复效果图，图6中b为ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP支架的治疗修复效果图，和对照组相比，在植入ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP支架14天后，肿瘤生长受到明显抑制且伤口的面积显著减小，说明ACC@Fe2+BLM-CaSi-GP支架能够治疗皮肤瘤B16F10的同时，还能够促进皮肤伤口的修复。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒
将无水氯化钙、博来霉素、无水氯化亚铁加入无水乙醇中，混匀后置于带有若干个出气孔的容器中，然后置于装有碳酸氢铵的干燥器中，室温下反应2-3d后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后，制得载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒；
(2)制备表面修饰有硅层的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒
将步骤(1)中制备的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒分散于无水乙醇中，然后加入乙二胺四乙酸、氨水，以400-800rpm的速度搅拌15min后加入正硅酸乙酯，继续以400-800rpm的速度搅拌15min后再加入水，搅拌反应12-24h后离心取沉淀，将所述沉淀洗涤后，制得表面修饰有硅层的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒；
(3)制备兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架
将聚己内酯、明胶、步骤(2)中制备的表面修饰有硅层的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒加入六氟异丙醇中，搅拌12-24h后获得混合溶液，将所述混合溶液转移至注射器中，通过静电纺丝制得兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述无水氯化钙、博来霉素、无水氯化亚铁和无水乙醇的质量体积比为150:15:1.26:100，所述质量体积比的单位为mg:mg:mg:mL。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒、无水乙醇、乙二胺四乙酸、氨水、正硅酸乙酯和水的质量体积比为2:20:25:400:30:400，所述质量体积比的单位为mg:mL:μL:μL:μL:μL，所述氨水的体积分数为25％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述聚己内酯、明胶、表面修饰有硅层的载铁博来霉素无定型碳酸钙复合纳米颗粒和六氟异丙醇的质量体积比为125:125:100:5，所述质量体积比的单位为mg:mg:mg:mL。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所述离心的速度均为8000-10000rpm。
6.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所述洗涤具体为以无水乙醇为洗涤液在8000-10000rpm的速度下离心洗涤2-3遍。
7.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述静电纺丝参数具体为：所述注射器的喷头与接收板之间距离为10-20cm，电压为10-15kV，所述注射器的出液速率为0.5-2mL/h。
8.由权利要求1-7任一项所述的方法制备的兼具治疗黑色素瘤和修复损伤组织作用的静电纺丝支架。
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