CN112516308B - 一种近红外ii区激光控释药物纳米脂质体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种近红外ii区激光控释药物纳米脂质体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体及其制备方法与应用，属于食品、医药技术领域。近红外II区控释药物纳米脂质体的制备方法，包括：(1)预热的磷脂溶液和脂肪酸混合溶液；(2)制备IR‑1061溶液、NO供体溶液和前体药物溶液的脂肪酸混合溶液中，再加入预热的磷脂溶液中，得到浑浊溶液；升温，过滤，洗涤，即得纳米脂质体。本发明提供了一种能够同时储存NO和烷基自由基，并对近红外II区响应精准释放NO和烷基自由基的多功能纳米脂质体；该纳米脂质体粒径均一，响应敏感，生物相容性良好，抗肿瘤效果明显，在抗肿瘤方面显示出重要的应用前景。

Description

一种近红外II区激光控释药物纳米脂质体及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于食品、医药技术领域，特别涉及一种具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体及其制备方法与应用。
背景技术
一氧化氮(NO)是一种重要的内源性细胞信号分子，在心血管系统、免疫系统及中枢神经系统中均具有调节功能。近年来，由于其绿色安全、低毒副作用、不易产生耐药性及治疗的高效性等优势，在肿瘤治疗研究领域受到极大关注，并取得一定的成效。然而，NO供体在生理条件下存在难储存、易释放和易被清除等缺陷，极大限制了其在临床医学上的转化应用。因此，NO的高效递送和生物体内的可控释放，成为提高其治疗效果的关键。目前，已有多种纳米材料被设计合成用于NO的递送和可控释放研究。这些纳米体系能够利用外源性或内源性的刺激条件(紫外光、近红外光、X-射线、超声、pH、GSH及H2O2等)实现NO的控释。其中，近红外激光(NIR)触发的NO释放，是一个简便、有效且易实现临床转化应用的方式。然而，目前大多数激光控释NO纳米体系用的是近红外I区(600nm-900nm)激光，虽然I区激光具有一定的生物安全性，但其组织穿透深度有限，且对正常组织也还会有一定程度的损伤。相比之下，近红外II区(>900nm)激光具有更好的穿透深及灵敏度，能够透过正常组织且不造成伤害，并具有很好的生物相容性。因此，开发具有近红外II激光控释NO的纳米材料将更有利于推动NO纳米体系在临床医学的转化应用。
此外，NO疗法虽在肿瘤治疗研究中取得了一定的成效，但单一的NO疗法的还不能完全抑制肿瘤。近年来，基于自由基(单线态氧、羟基自由基和超氧自由基等)的治疗方法也被广泛用于肿瘤的治疗研究。然而，上述自由基的产生除了借助于适当的物理响应性刺激，在形成过程中还需要消耗大量的氧气，而这容易加重肿瘤的乏氧环境，使肿瘤细胞的抵抗性增强，从而不利于其肿瘤的持续、有效治疗。最新的研究发现，烷基自由基不同于常规的自由基，是一种非氧依赖的自由基。烷基自由基可在热刺激条件下由前体物质如2'2-氮杂双(2-咪唑啉)二盐酸盐(AIPH)产生，该分解过程不需要氧气。该过程产生的烷基自由可以直接氧化细胞成分，继而诱导细胞凋亡，达到有效抗肿瘤的效果。因此，基于烷基自由基的治疗方法是一种更能适应肿瘤乏氧微环境、更为有效的抗肿瘤方法。与光控NO释放纳米体系一样，目前烷基自由基的控制释放基本都由近红外I区激光所激发，仍然存在组织穿透深度有限，且对正常组织也还会有一定程度的损伤的问题，因此，开发近红外II激光控释烷基自由基的纳米体系及其抗肿瘤活性研究，在纳米医学领域具有一定的意义和临床应用前景。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体。
本发明的再一目的在于提供上述具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种近红外II区激光控释药物纳米脂质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将卵磷脂和DSPE-PEG-C(RGDyk)溶解于乙醇水溶液中，然后搅拌均匀，预热，得到预热的磷脂溶液；将月桂酸和硬脂酸以质量比4:1溶于有机溶剂中，使其充分溶解，得到脂肪酸混合溶液；
(2)将近红外II区荧光染料IR-1061溶解到有机溶液中，得到IR-1061溶液；将NO供体溶解到有机溶剂中，得到NO供体溶液；将烷基自由基的前体药物溶解到有机溶剂溶液中，得到前体药物溶液；分别将上述IR-1061溶液、NO供体溶液和前体药物溶液依次加入到步骤(1)得到的脂肪酸混合溶液中，轻轻摇晃，使其混合均匀，即得到混合溶液；将混合溶液逐滴添加到步骤(1)得到的预热的磷脂溶液中，涡旋，冷却，得到浑浊溶液；将浑浊溶液取出并升温至环境温度，过滤，取滤液离心去除未包裹的分子和有机溶剂，洗涤，即得具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体。
步骤(1)中所述的卵磷脂和DSPE-PEG-C(RGDyk)按质量比为2～6:1混合。
步骤(1)中所述的乙醇水溶液中乙醇的含量为0～4％(v/v)。
步骤(1)中所述的卵磷脂与乙醇水溶液优选按质量(mg)体积(mL)比为0.5～2:1。
步骤(1)中所述的搅拌的转速为100～600rpm，时间为10～30min。
步骤(1)中所述的预热的温度优选为40～60℃。
步骤(1)中所述的预热优选在水浴锅中进行。
步骤(1)中所述的预热的磷脂溶液中卵磷脂的浓度优选为0.5～2mg/mL。
步骤(1)中所述的月桂酸与有机溶剂按质量(mg)体积(mL)比0.8～4.8:1计算。
步骤(1)中所述的有机溶剂优选包括N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、甲醇、异丙醇、乙二醇、四氢呋喃和二甲基亚砜(DMSO)中的至少一种。
步骤(1)中所述的脂肪酸混合溶液中脂肪酸的含量优选为2～6mg/mL。
步骤(2)中所述的IR-1061溶液中近红外II区荧光染料IR-1061的浓度为1～9mg/mL；进一步优选为1～5mg/mL；更优选为3mg/mL。
步骤(2)中所述的NO供体优选包括N,N′-二-仲丁基-N,N′-二硝基-1,4-苯二胺(BNN6)、N-亚硝胺、金属-NO络合物、鲁辛黑盐(RBS)和双N-亚硝基化合物(BNNs)中的至少一种。
步骤(2)中所述的NO供体溶液中NO供体的浓度为3～9mg/mL；进一步优选为3～8mg/mL；更优选为3mg/mL。
步骤(2)中所述的烷基自由基的前体药物优选包括2,2'-氮杂双(2-咪唑啉)二盐酸盐(AIPH)。
步骤(2)中所述的前体药物溶液中烷基自由基的前体药物的浓度为3～9mg/mL；进一步优选为3～8mg/mL；更优选为3mg/mL。
步骤(2)中所述的有机溶剂优选包括N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮、甲醇、异丙醇、乙二醇、四氢呋喃和二甲基亚砜(DMSO)中的至少一种。
步骤(2)中所述的IR-1061溶液、NO供体溶液、前体药物溶液和脂肪酸混合溶液优选按体积比1～3:1～3:1～3:6～12计算。
步骤(2)中所述的混合溶液与预热的磷脂溶液按体积比0.9:3～6计算。
步骤(2)中所述的涡旋的时间优选为1～5min；更优选为2min。
步骤(2)中所述的冷却优选为在冰水中冷却。
步骤(2)中所述的冷却的时间优选为1～5min。
步骤(2)中所述的升温优选为加热升温。
步骤(2)中所述的过滤优选为用醋酸纤维素膜过滤；更优选为用0.22μm的醋酸纤维素膜过滤。
步骤(2)中所述的离心优选为通过超滤离心管离心。
步骤(2)中所述的洗涤优选为用水清洗；更优选为用纯水清洗。
所述的用纯水清洗的次数优选为2～5次；更优选为3次。
步骤(2)中制得的具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体优选在2～8℃进行保存。
一种具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体，通过上述制备方法制备得到。
所述的具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体在生物医学工程材料中的应用。
具体地，所述的具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的抗肿瘤药物优选包括抑制肿瘤细胞生长和繁殖的药物。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了在近红外II区光照射下释放一氧化氮和烷基自由基的纳米脂质体的制备方法，该方法通过纳米沉淀法制备出近红外II区控释的纳米脂质体；本发明首先将近红外II区荧光染料IR-1061，烷基自由基的前体药物和NO供体载入到天然脂肪酸共晶混合物中；然后以卵磷脂和两亲性化合物与为包埋材料，将上述混合物载入其中，获得近红外II区控释的多功能纳米脂质体。在单次近红外II区激光照射下，精准释放一氧化氮与烷基自由基，实现协同、高效的抗肿瘤效果。
(2)本发明采用天然脂肪酸共晶混合物作为热响应门控材料，其熔点为39℃，接近人体温度，在较窄的温度范围内可表现出可逆的固液相变，且具有较好的生物相容性。
(3)本发明采用近红外II区荧光染料作为光热材料，其能够在近红外II区激光条件下升高温度，精准释放一氧化氮和烷基自由基，且该材料能够透过正常组织且对正常组织不造成伤害，具有很好的生物相容性。
(4)本发明提供了一种能够同时储存一氧化氮和烷基自由基，并对近红外II区响应精准释放一氧化氮和烷基自由基的多功能纳米脂质体；该纳米脂质体粒径均一，响应敏感，生物相容性良好，抗肿瘤效果明显，在抗肿瘤方面显示出重要的应用前景。
(5)本发明得到的多功能纳米脂质体在近红外II区激光的作用下，可同时释放一氧化氮和烷基自由基，达到联合高效抗肿瘤的作用，为抗肿瘤纳米体系提供了一个新的平台，在肿瘤安全、高效治疗研究中具有重大的意义。
附图说明
图1为近红外II区激光触发纳米脂质体释放药物的示意图。
图2为实施例6的纳米脂质体及其粒径分布图；其中图a为纳米脂质体的粒径分布图；图b为纳米脂质体的实物图。
图3为实施例7中含不同浓度IR1061的纳米脂质体经近红外II区照射后的升温曲线结果图。
图4为实施例8中的纳米脂质体在不同时间点经近红外II区照射的可控释放结果图。
图5为实施例9中不同纳米粒子的诱导细胞凋亡的流式细胞图。
图6为实施例10中不同纳米粒子的体内抗肿瘤效果图。
图7为实施例11中不同纳米粒子的组织病理切片结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的试剂和原料若无特别说明，均可通过市购得到。
DSPE-PEG-C(RGDyk)购于上海拓旸生物科技有限公司；卵磷脂购于上海麦克林生化科技有限公司；近红外II区荧光染料IR-1061购于Sigma-Aldrich公司；烷基自由基的前体药物AIPH购于上海麦克林生化科技有限公司；NO供体BNN6按照Shihua Li,XiaorongSong et al.Light-Switchable Yolk-Mesoporous Shell UCNPs@MgSiO3 for NitricOxide-Evoked Multidrug Resistance Reversal in Cancer Therapy[J].ACS AppliedMaterials&Interfaces,2020,12,27:30066-30076.中记载的方法制备得到。
实施例1：近红外II区控释药物纳米脂质体的制备
(1)将22.5mg卵磷脂和7.5mg DSPE-PEG-C(RGDyk)以质量比3:1溶解于30mL的4％(v/v)乙醇溶液中，然后在200rpm下搅拌20min，使其均匀分散，并放置于45℃水浴锅中进行预热，得到约1mg/mL预热的磷脂溶液；将32mg月桂酸和8mg硬脂酸以质量比4:1溶于甲醇(纯度>99％)中，使其充分溶解，得到约4mg/mL脂肪酸混合溶液；
(2)将6mg的近红外II区荧光染料IR-1061溶解到2mL的DMSO中，得到约3mg/mL的IR-1061溶液；将6mg的NO供体(BNN6)溶解到2mL的DMSO中，得到约3mg/mL的NO供体溶液；将6mg的烷基自由基的前体药物(AIPH)溶解到2mL的DMSO中，得到约3mg/mL的前体药物(AIPH)溶液；分别将上述IR-1061溶液、NO供体溶液和前体药物溶液各100μL依次加入到600μL步骤(1)得到的脂肪酸混合溶液中，混合均匀，得到混合溶液；将混合溶液逐滴添加到3mL步骤(1)得到的预热的磷脂溶液中，随后进行剧烈涡旋2min，再放入冰水中冷却2min，得到浑浊溶液；将浑浊溶液取出并加热至环境温度，然后通过0.22μm的醋酸纤维素膜进行过滤，得到的滤液再通过超滤离心管(MWCO＝10kDa)离心去除未包裹的分子和有机溶剂，并用纯水清洗三次，即得具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体。
实施例2：近红外II区控释药物纳米脂质体的制备
(1)将25.72mg卵磷脂和4.28mg DSPE-PEG-C(RGDyk)溶解于30mL的4％(v/v)乙醇溶液中，然后在200rpm下搅拌20min，使其均匀分散，并放置于45℃水浴锅中进行预热，得到约1mg/mL预热的磷脂溶液；将32mg月桂酸和8mg硬脂酸以质量比4:1溶于甲醇(纯度>99％)中，使其充分溶解，得到约4mg/mL脂肪酸混合溶液；
(2)将6mg的近红外II区荧光染料IR-1061溶解到2mL的DMSO中，得到约3mg/mL的IR-1061溶液；将6mg的NO供体(BNN6)溶解到2mL的DMSO中，得到约3mg/mL的NO供体溶液；将6mg的烷基自由基的前体药物(AIPH)溶解到2mL的DMSO溶液中，得到约3mg/mL的前体药物溶液；分别将上述IR-1061溶液、NO供体溶液和前体药物溶液各300μL依次加入到600μL步骤(1)得到的脂肪酸混合溶液中，混合均匀，得到混合溶液；将混合溶液逐滴添加到3mL步骤(1)得到的预热的磷脂溶液中，随后进行剧烈涡旋2min，再放入冰水中冷却2min，得到浑浊溶液；将浑浊溶液取出并加热至环境温度，然后通过0.22μm的醋酸纤维素膜进行过滤，得到的滤液再通过超滤离心管(MWCO＝10kDa)离心去除未包裹的分子和有机溶剂，并用纯水清洗三次，即得具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体。
实施例3：近红外II区控释药物纳米脂质体的制备
(1)将20mg卵磷脂和10mg DSPE-PEG-C(RGDyk)溶解于30mL的4％(v/v)乙醇溶液中，然后在200rpm下搅拌20min，使其均匀分散，并放置于45℃水浴锅中进行预热，得到约1mg/mL预热的磷脂溶液；将32mg月桂酸和8mg硬脂酸以质量比4:1溶于甲醇(纯度>99％)中，使其充分溶解，得到约4mg/mL脂肪酸混合溶液；
(2)将6mg的近红外II区荧光染料IR-1061溶解到2mL的DMSO中，得到约3mg/mL的IR-1061溶液；将6mg的NO供体(BNN6)溶解到2mL的DMSO中，得到约3mg/mL的NO供体溶液；将6mg的烷基自由基的前体药物(AIPH)溶解到2mL的DMSO溶液中，得到约3mg/mL的前体药物(AIPH)溶液；分别将上述IR-1061溶液、NO供体溶液和前体药物溶液各300μL依次加入到1.2mL步骤(1)得到的脂肪酸混合溶液中，混合均匀，得到混合溶液；将混合溶液逐滴添加到6mL步骤(1)得到的预热的磷脂溶液中，随后进行剧烈涡旋2min，再放入冰水中冷却2min，得到浑浊溶液；将浑浊溶液取出并加热至环境温度，然后通过0.22μm的醋酸纤维素膜进行过滤，得到的滤液再通过超滤离心管(MWCO＝10kDa)离心去除未包裹的分子和有机溶剂，并用纯水清洗三次，即得具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体。
实施例4：
(1)将22.5mg卵磷脂和7.5mg DSPE-PEG-C(RGDyk)溶解于30mL的4％(v/v)乙醇溶液中，然后在200rpm下搅拌20min，使其均匀分散，并放置于45℃水浴锅中进行预热，得到约1mg/mL预热的磷脂溶液；将32mg月桂酸和8mg硬脂酸以质量比4:1溶于甲醇(纯度>99％)中，使其充分溶解，得到约4mg/mL脂肪酸混合溶液；
(2)将18mg的近红外II区荧光染料IR-1061溶解到2mL的DMSO中，得到约9mg/mL的IR-1061溶液；将18mg的NO供体(BNN6)溶解到2mL的DMSO中，得到约9mg/mL的NO供体溶液；将18mg的烷基自由基的前体药物(AIPH)溶解到2mL的DMSO溶液中，得到约9mg/mL的前体药物溶液；分别将上述IR-1061溶液、NO供体溶液和前体药物溶液各300μL依次加入到1.2mL步骤(1)得到的脂肪酸混合溶液中，混合均匀，得到混合溶液；将混合溶液逐滴添加到6mL步骤(1)得到的预热的磷脂溶液中，随后进行剧烈涡旋2min，再放入冰水中冷却2min，得到浑浊溶液；将浑浊溶液取出并加热至环境温度，然后通过0.22μm的醋酸纤维素膜进行过滤，得到的滤液再通过超滤离心管(MWCO＝10kDa)离心去除未包裹的分子和有机溶剂，并用纯水清洗三次，即得具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体。
实施例5：
(1)将22.5mg卵磷脂和7.5mg DSPE-PEG-C(RGDyk)溶解于30mL的4％(v/v)乙醇溶液中，然后在200rpm下搅拌20min，使其均匀分散，并放置于45℃水浴锅中进行预热，得到约1mg/mL预热的磷脂溶液；将32mg月桂酸和8mg硬脂酸以质量比4:1溶于甲醇(纯度>99％)中，使其充分溶解，得到约4mg/mL脂肪酸混合溶液；
(2)将6mg的近红外II区荧光染料IR-1061溶解到2mL的无水乙醇(纯度>99％)中，得到约3mg/mL的IR-1061溶液；将6mg的NO供体(N-亚硝胺)溶解到2mL的无水乙醇中，得到约9mg/mL的NO供体溶液；将6mg的烷基自由基的前体药物(AIPH)溶解到2mL的DMSO溶液中，得到约3mg/mL的前体药物溶液；分别将上述IR-1061溶液、NO供体溶液和前体药物溶液各300μL依次加入到1.2mL步骤(1)得到的脂肪酸混合溶液中，混合均匀，得到混合溶液；将混合溶液逐滴添加到6mL步骤(1)得到的预热的磷脂溶液中，随后进行剧烈涡旋2min，再放入冰水中冷却2min，得到浑浊溶液；将浑浊溶液取出并加热至环境温度，然后通过0.22μm的醋酸纤维素膜进行过滤，得到的滤液再通过超滤离心管(MWCO＝10kDa)离心去除未包裹的分子和有机溶剂，并用纯水清洗三次，即得具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体。
实施例6：实施例2制得的近红外II区激光控释药物纳米脂质体的性能测试
称取实施例2所得近红外II区激光控释药物纳米脂质体1mL加入到2mL的纯水中，混合均匀，然后进行粒径分布观察。
结果如图2所示，得到的纳米脂质体的粒径约为113.4nm，且其可均匀分散在在水中，具有较好的稳定性。
实施例7：实施例3制得的近红外II区激光控释药物纳米脂质体的性能测试
将实施例3所得的纳米脂质体用超纯水稀释成纳米脂质体溶液，使纳米脂质体溶液中IR1061的浓度分别为：20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL；纳米脂质体溶液中IR1061含量通过紫外分光光度计测定。每个浓度下各取出200μL纳米脂质体溶液，在1064nm近红外II区下0.8W照射5min，每5s测定相应的温度，绘制升温曲线。
实验结果如图3所示，发现随着纳米脂质体中IR1061浓度的增加，在照射相同时间条件下，纳米脂质体中IR1061浓度越大升温程度越大，说明纳米脂质体有着良好的光热效果。
实施例8：实施例3制得的近红外II区激光控释药物纳米脂质体的性能测试
首先，取100μL、3mg/mL的实施例3所得纳米脂质体放入100μL去离子水中，然后在指定的时间点，即0min、10min、20min、30min、40min和50min时用1064nm近红外II区激光(0.8W/cm2)照射去离子水中的纳米脂质体5min，并用紫外分光光度法检测各时间点纳米脂质体中的IR-1061、NO和AIPH的浓度。同时，在5min、15min、25min、35min、45min和55min的指定时间点，停止照射5min，5min后，用紫外分光光度法检测各时间点纳米脂质体中的IR-1061、NO和AIPH的浓度。同时以60min内均无近红外II区激光照射的纳米脂质体为对照进行上述实验，然后绘制在有、无近红外II区激光照射下，纳米脂质体中IR-1061、NO和AIPH的释放情况。
实验结果如图4所示，在无激光处理的情况下，各成分均没有明显的释放；而当近红外II区激光以“开-关”模式照射的情况下，纳米脂质体表现出明显的“开-关”释放特征，响应于近红外II区激光照射，这说明纳米脂质体具有良好的控释能力。
实施例9：
以4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞；购于ATCC)为模型，将细胞进行铺板并培养24小时，然后用实施例4所得到的纳米脂质体对细胞进行处理，纳米脂质体的浓度为300μg/mL(即纳米体系组)，并有4个平行，分别为pH＝7.4、0.01mol/L的PBS缓冲液空白对照组、IR-1061纳米粒子(即IR NPs组)、BNN6纳米粒子(即BNN6 NPs组)、AIPH纳米粒子(即AIPH组)，处理方法同纳米脂质体(即纳米体系组)。然后，利用1064nm激光器对肿瘤细胞进行照射处理5min(光热治疗过程)，并继续孵育24h。利用流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI双染法)对联合治疗组细胞的凋亡进行测定分析，评价其烷基自由基/NO联合抗肿瘤细胞活性。
实验结果如图5所示，该纳米脂质体相比于其他对照组，具有更强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力，这说明烷基自由基/NO的联合作用相比单一的NO疗法或自由基疗法，其具有更加显著的肿瘤抑制作用。
实施例10：
构建4T1乳腺癌细胞及移植瘤模型，研究在近红外II区激光的作用下，纳米脂质体对小鼠肿瘤生长的抑制作用。本实验采用SPF级BALB/C裸鼠(4-5周龄，雌性；购于北京维通利华实验动物技术有限公司)进行实验。在进行实验前，所有的小鼠需要在动物房饲养观察10天，进行体重，尿液、粪便等指标测试，指标合格后再进行动物实验。小鼠4T1肿瘤模型建立步骤具体如下：将预先培养好的乳腺癌细胞(4T1，购于ATCC)用胰酶(购于东恒华道生物科技有限责任公司)消化后，用适量pH＝7.4、0.1mol/L PBS缓冲液重悬，然后以1.0×106个/100μL的细胞密度接种到BALB/C裸鼠的右侧大腿上，每天观察肿瘤大小。当小鼠的肿瘤体积均达100mm3左右时，进行治疗。将建立肿瘤模型的裸鼠随机分为7组，每组6只。治疗组分别为：①PBS(pH＝7.4、0.1mol/L，静脉注射)；②IR-1061纳米粒子(即IR1061 NPs组，肿瘤内注射+NIR(0.8W/cm2,5min)处理)；③BNN6纳米粒子(即BNN6 NPs组，肿瘤内注射+NIR(0.8W/cm2,5min)处理)；④AIPH纳米粒子(即AIPH NPs组，肿瘤内注射+NIR(0.8W/cm2,5min)处理)；⑤纳米脂质体(即纳米体系组，静脉注射+NIR(0.8W/cm2,5min)处理；即纳米体系-静脉+NIR组)；⑥纳米脂质体(肿瘤内注射，无NIR处理；即纳米体系-无激光组)；⑦纳米脂质体(肿瘤内注射+NIR(0.8W/cm2,5min)处理；即纳米体系+NIR组)。按照磷脂浓度2mg/kg(按照小鼠体积计算)给药，注射体积为100μL。每两天给药一次，总治疗时间为21天，同时，每两天记录肿瘤体积和小鼠体重。治疗21天后，对所有小鼠实施安乐死，收集肿瘤，称重并拍照。
实验结果如图6所示，从图6可以看出，经⑦肿瘤内注射+NIR(0.8W/cm2,5min)处理，即纳米体系+NIR组的肿瘤相比于其他治疗组，具有更强的抑制肿瘤生长的能力，这说明烷基自由基/NO的联合作用相比单一的NO疗法或自由基疗法，具有更加显著的肿瘤抑制作用。
实施例11：
对实施例10中经各组药物治疗后的小鼠实施安乐死后，收集心脏，肝脏，脾脏，肺脏和肾脏的主要器官，浸入组织固定剂中，进行常规石蜡包埋，组织切片。然后将切片用苏木精和曙红染色，并使用荧光显微镜拍照。
实验结果如图7所示，不同治疗组处理的裸鼠主要器官的H&E图像，与PBS组相比，所有治疗组中没有观察到各内脏器官的组织形态和器官结构的损伤，表明实验所用的材料不会对小鼠产生任何的生理毒性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种近红外II区激光控释药物纳米脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将卵磷脂和DSPE-PEG-C（RGDyk）溶解于乙醇含量为4%v/v的乙醇水溶液中，然后于100～600 rpm的转速搅拌10～30 min，于40～60℃的温度预热，得到预热的磷脂溶液；将月桂酸和硬脂酸以质量比4:1溶于甲醇中，使其充分溶解，得到脂肪酸混合溶液；
（2）将近红外II区荧光染料IR-1061溶解到二甲基亚砜中，得到浓度为1～9 mg/mL的IR-1061溶液；将NO供体溶解到二甲基亚砜中，得到浓度为3～9 mg/mL的NO供体溶液；将烷基自由基的前体药物溶解到二甲基亚砜中，得到浓度为3～9 mg/mL的前体药物溶液；分别将上述IR-1061溶液、NO供体溶液和前体药物溶液依次加入到步骤（1）得到的脂肪酸混合溶液中，轻轻摇晃，使其混合均匀，即得到混合溶液；将混合溶液逐滴添加到步骤（1）得到的预热的磷脂溶液中，涡旋1～5 min，冰水中冷却1～5 min，得到浑浊溶液；将浑浊溶液取出并升温至环境温度，过滤，取滤液离心去除未包裹的分子和有机溶剂，洗涤，即得具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体；
步骤（1）中所述的卵磷脂和DSPE-PEG-C（RGDyk）按质量比为2～6:1混合；
步骤（1）中所述的预热的磷脂溶液中卵磷脂的浓度为0.5～2 mg/mL；
步骤（1）中所述的月桂酸与甲醇按质量mg体积mL比0.8～4.8 : 1计算；
步骤（1）中所述的脂肪酸混合溶液中脂肪酸的含量为2～6 mg/mL；
步骤（2）中所述的NO供体包括N, N′-二-仲丁基-N, N′-二硝基-1, 4-苯二胺、N-亚硝胺、金属-NO络合物、鲁辛黑盐和双N-亚硝基化合物中的至少一种；
步骤（2）中所述的烷基自由基的前体药物为2, 2'-氮杂双(2-咪唑啉)二盐酸盐；
步骤（2）中所述的IR-1061溶液、NO供体溶液、前体药物溶液和脂肪酸混合溶液按体积比1～3 : 1～3 : 1～3 : 6～12计算；
步骤（2）中所述的混合溶液与预热的磷脂溶液按体积比0.9 : 3～6计算。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的预热在水浴锅中进行。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述的升温为加热升温；
步骤（2）中所述的过滤为用醋酸纤维素膜过滤；
步骤（2）中所述的离心为通过超滤离心管离心；
步骤（2）中所述的洗涤为用水清洗。
4.一种具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体，其特征在于，通过权利要求1～3任意一项所述的制备方法制备得到。
5.权利要求4所述的具有一氧化氮/烷基自由基协同抗肿瘤作用的近红外II区激光控释药物纳米脂质体在制备抗乳腺癌药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抗乳腺癌药物包括抑制乳腺癌细胞生长和繁殖的药物。
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