CN104706554A

CN104706554A - 一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN104706554A
Application number: CN201510072718.6A
Authority: CN
Inventors: 陈海佳; 王一飞; 葛啸虎; 吴子杰; 戴国胜
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2015-02-11
Filing date: 2015-02-11
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2035-02-11
Also published as: CN104706554B

Abstract

本发明公开了一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法及其应用，制备方法具体包括如下步骤：(1)获取莲叶细胞株：对无菌莲叶采用纤维素酶和果胶酶进行联合消化得到莲叶细胞株；(2)大量培养莲叶细胞：1)采用I号灭菌培养基进行初步培养；2)采用Ⅱ号灭菌培养基进行悬浮培养得到莲叶细胞培养物；(3)收集莲叶细胞培养物制备莲叶细胞次生代谢物冻干粉并应用于抗衰老护肤品中。本发明采用莲叶细胞培养法，通过纤维素酶和果胶酶的联合运用，最后收集培养物中的次生代谢物，不仅简化生产工艺，还提高了莲叶细胞培养效率和质量；同时产品安全性高还可长期稳定生产；运用于化妆品中具有抗衰老的作用。

Description

一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于植物细胞培养和化妆品领域，具体涉及一种植物细胞培养法，通过剪碎代替打浆减少对细胞的损失，采用果胶酶和纤维素酶联合消化缩短消化时间的改进，来获得莲叶细胞的次生代谢物，制作成冻干粉，作为抗衰老化妆品。

背景技术

莲叶为睡莲科植物莲，又名荷叶，藕叶。《本草纲目》记载，“荷叶服之令人瘦劣。单服可以消阳水浮之气。能生发元气，裨助脾胃，涩精浊，散癖血，消肿痛，发痘疮。莲叶中化学成分主要为黄酮类化合物和莲叶碱，二者具有较高的生物活性，其中的黄酮类化合物作为一种过氧化自由基的清除剂，能有效防止脂质过氧化反应对生物机体组织损伤，这种损伤导致许多疾病的发生和组织的衰老。而随着年龄的增长，机体内清除自由基的能力逐渐下降，通过向机体组织添加这种自由基清除剂可以达到到抵延缓衰老的目的。目前莲叶中的化学成分提取及药用价值研究颇多，而很少将其抗衰老作用应用于化妆品中。

目前莲叶中的黄酮类化合物均用化学提取法，主要步骤：莲叶清洗干净后烘干，粉碎，置于70-80％的乙醇中回流提取，将提取液浓缩至原体积1/3，过滤得到初提液，将初提液用大孔树脂吸附，然后经过洗脱，抽滤，浓缩，萃取，静置，过滤，干燥的步骤后，得到成品。而植物细胞培养法目前并没有应用于莲叶，该方法主要步骤(以人参为例)：将人参浸泡在10％次氯酸钠中20分钟进行灭菌，然后用无菌水洗人参至次氯化钠无残留，将洁净后的人参放入打浆机加入MS培养基，打浆。打浆液加入纤维素酶100mg/kg，放置3-5小时，用50-80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液用低速离心机分离，去除上清液和杂志，莲叶细胞转移至改良MS培养基中，调pH 5-6，90-120r/min搅拌，避光培养，获得大量人参细胞培养液。化学提取法要经过预处理，初提，大孔吸附树脂分离，有机溶剂纯化，后处理五个环节，生产工艺复杂；同时其安全性低，生产过程中使用大量有机溶剂，极易残留在成品中，不利于身体健康；会造成环境污染，生产过程中会对环境中排放大量有机溶剂；受限于莲叶的生长季节，影响成品的产量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了全新的莲叶细胞培养法，替代化学提取法，通过纤维素酶和果胶酶的联合作用，减少了细胞的培养时间，简化了生产工艺，同时产品安全性高还可长期稳定生产；运用于化妆品中具有抗衰老的作用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，包括如下步骤：

(1)获取莲叶细胞株：在每0.5g-3.0g无菌莲叶中加入5-30mlMurashige and Skoog培养基及0.025-0.30ml质量分数为0.2-0.3％纤维素酶溶液和0.025-0.30ml质量分数为0.2-0.3％果胶酶溶液进行消化；将消化后所得消化液过滤、离心除去上清液后得到莲叶细胞株；

(2)大量培养莲叶细胞：

1)初步培养：采用I号灭菌培养基将莲叶细胞株配制成(0.5-5)×10⁴个/ml密度的莲叶细胞液，将所述莲叶细胞液置于旋转式摇床上，在24-27℃的环境下和转速为150-180rpm/min的条件下培养；

2)悬浮培养：将经过初步培养后的莲叶细胞培养液去除上清液，采用Ⅱ号灭菌培养基将莲叶细胞配制成(0.5-5)×10⁵个/ml密度的莲叶细胞液并置于发酵罐中，通入速率为0.01-0.05m³/s的过滤空气，在24-27℃的环境下和转速为120-150rpm/min的条件下进行悬浮培养得到莲叶细胞培养物；

(3)制备莲叶细胞次生代谢物冻干粉：收集莲叶细胞培养物对其过滤、浓缩和冻干处理后得到莲叶细胞次生代谢物冻干粉。

优选的，步骤(1)中选取新鲜莲叶进行消毒。

优选的，步骤(1)中将莲叶在质量分数为15％-20％的次氯酸钠溶液中消毒，消毒后采用无菌去离子水清洗。

优选的，步骤(1)中所述无菌莲叶在加入Murashige and Skoog培养基前为碎片，且碎片面积大小≤1mm²；所述纤维素酶溶液与果胶酶溶液体积为1:1。

优选的，步骤(1)中采用200目无菌网筛对消化液进行过滤，将过滤液加入到Countstar细胞计数器中，过滤液再250g的离心力下离心10min。

优选的，步骤(2)中初步培养时每100ml莲叶细胞液培养14天。

优选的，步骤(3)所述莲叶细胞培养物采用孔径小于0.45μM的滤膜过滤；浓缩上清液至浓缩液中蛋白浓度为50±0.5μg/ml；浓缩上清液采用孔径小于0.22μM的滤膜过滤。所述冻干处理时冻干温度为(-20℃)-(-35℃)，真空度为50-200Pa，冻干时间为24-36小时，即得到莲叶细胞次生代谢物冻干粉。

本发明所述的莲叶细胞次生代谢物冻干粉在抗衰老护肤品中应用。

所述抗衰老扶护品为面膜、爽肤水、面霜、乳液、眼霜、洗面乳。

所述莲叶细胞次生代谢物冻干粉在抗衰老扶护品中的添加量为300-800μg/ml。

本发明采用植物细胞培养法，通过剪碎代替打浆减少对细胞的损失，采用果胶酶和纤维素酶联合消化缩短消化时间的改进，来获得莲叶细胞的次生代谢物，制作成冻干粉，作为抗衰老化妆品。

有益效果：

1.简化生产工艺，提供工作效率。将对原料进行预处理、初提、大孔吸附树脂分离、有机溶剂纯化和后处理的五个环节简化了获取细胞株、细胞培养和细胞培养物收集冻干的三个环节，大大简化生产步骤。

2.提高了莲叶细胞培养效率和质量。通过使用果胶酶和纤维素酶联合消化，缩短细胞培养时间，同时使用剪刀代替搅拌机对莲叶进行分解，提高原始莲叶细胞株的质量，减少莲叶细胞株的损伤。

3.产品生产量不受限于原材料的生产地区和季节，可长期稳定生产。

4.产品安全性高。培养全过程为无菌操作，也不使用有机溶剂，冻干粉中不会残留任何化学物质和病菌。

5、产品具有抗衰老效果。收集莲叶细胞培养液并进行冻干制备，有效保存莲叶细胞的次生代谢物中的黄酮成分，改冻干粉可应用至化妆品，达到抗衰老的功效。

附图说明

附图1为硝酸铝-亚硝酸钠比色法绘制芦丁标准曲线

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例1

1.获取莲叶细胞株

1)取1kg新鲜莲叶进行清洗消毒，浸在10L质量分数为15％次氯酸钠中20分钟。在无菌条件下，轻轻倒出莲叶，每次使用2L无菌去离子水清洗，共三次，每次清洗过程中轻轻搅动。

2)在无菌的条件下，将消毒后的莲叶用灭菌后的剪刀剪碎，每片碎片大小≤1mm²。

将莲叶碎片转移至无菌干净的烧杯中，每1.0g碎片加入10ml MS(Murashige and Skoog)培养基，一级0.05ml质量分数为0.2纤维素酶和0.05ml质量分数为0.2果胶酶，消化3小时。

3)用200目无菌网筛对消化液进行过滤，除去杂质，抽取20ul莲叶细胞过滤液，加进Countstar细胞计数器中，过滤液在250g的离心力下离心10min后，除去上清液，获得莲叶细胞株。

2.莲叶细胞大量培养

1)加入I号灭菌培养基将莲叶细胞株配制成1-x10⁴个/ml密度的莲叶细胞液，取100ml

莲叶细胞液加入250ml无菌三角烧瓶中，在旋转式摇床上，在25℃的环境下和转速为160rpm/min的条件下培养14天。

2)经过初步培养后，250g离心10min去除上清液，加入Ⅱ号灭菌培养基将莲叶细胞配制成1x10⁵个/ml密度的莲叶细胞液置于发酵罐中进行悬浮培养，通入过滤空气且速率为0.01m³/s，在25℃的环境下和转速为130rpm/min的条件下培养9天。

表1 I号培养基的配方(1L MS培养基中)

名称	含量	名称	含量
				2,4-D	0.5mg/L	6-BA	1.2mg/L

注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素

表2 Ⅱ号灭菌培养基的配方(1L MS培养基中)

名称	含量	名称	含量
				2,4-D	0.3mg/L	6-BA	0.4mg/L
葡萄糖	1g/L

注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素

3.莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备

1)收集莲叶细胞培养物，用0.45μM的滤膜对其进行过滤，浓缩。

2)采用蛋白质定量试剂盒(BCA)检测浓缩上清的蛋白浓度，调整浓缩液中蛋白浓度为50±0.5μg/ml。

将得到的浓缩上清用0.22μM过滤除菌。

3)除菌后进行冻干处理，冻干温度为-20℃，真空度为50Pa，冻干时间为24小时，即得到莲叶细胞的次生代谢物冻干粉。将冻干粉分装成1ml/支。

4.次生代谢物冻干粉中黄酮含量的测定

检测冻干粉中具有抗衰老作用的黄酮含量，采用硝酸铝—亚硝酸钠比色法，以芦丁为标准品绘制标准曲线(见附图1)。将提取液定容至50mL。再从中吸取1mL样品置于25mL容量瓶内，加0.7mL的5％亚硝酸钠溶液，混匀后放置5min，注入0.7mL的10％硝酸铝溶液，混匀后放置5min，加1mol/L氢氧化钠溶液5mL，定容至25mL。放置10min后在510nm处测定吸光度，计算黄酮得率e，其计算公式为

e＝aVYW

式中a—稀释倍数；

V—原提取液体积，mL；

Y—黄酮类物质的质量浓度，mg/mL；

W—提取用荷叶的质量，mg。

测得的数据绘制标准曲线图1，经计算得回归方程为y＝11.53x+0.0075，r2＝0.9995，其中x为芦丁含量，mg/mL；y为波长510nm处测定吸光值。结果表明芦丁含量在所测定的浓度范围内与吸光值的线性关系良好。

抽取三个批次的3支莲叶细胞次生代谢物冻干粉，检测其黄酮含量，得到的数据如下

表3 三个批次莲叶次生代鞋物冻干粉黄酮含量(％，x±SD，n＝3)

以上结果数据证明每批次莲叶次生代谢物冻干粉中都具有黄酮化合物，且每批次含量无差别(P＞0.05)，说明生产质量稳定，而黄酮含量平均为12％-13％，证明该冻干粉中含有抗衰老的功效。

实施例2

1.获取莲叶细胞株

1)取1kg新鲜莲叶进行清洗消毒，浸在10L质量分数为20％次氯酸钠中20分钟。在无菌条件下，轻轻倒出莲叶，每次使用2L无菌去离子水清洗，共三次，每次清洗过程中轻轻搅动。

将莲叶碎片转移至无菌干净的烧杯中，每1.0g碎片加入10ml MS(Murashige and Skoog)培养基，一级0.05ml质量分数为0.3％纤维素酶和0.05ml质量分数为0.3％果胶酶，消化3小时。

3)用200目无菌网筛对消化液进行过滤，除去杂质，抽取20ul莲叶细胞过滤液，加进Countstar细胞计数器中，过滤液在250g离心力下离心10min后，除去上清液，获得莲叶细胞株。

2.莲叶细胞大量培养

1)加入I号灭菌培养基将莲叶细胞株配制成2x10⁴/ml密度的莲叶细胞液，取100ml莲叶细胞液加入250ml无菌三角烧瓶中，在旋转式摇床上，在26℃的环境下和转速为160-170rpm/min的条件下培养14天。

2)经过初步培养后，250g离心10min去除上清液，加入Ⅱ号灭菌培养基将莲叶细胞配制成2x10⁵个/ml密度的莲叶细胞液置于发酵罐中进行悬浮培养，通入过滤空气且速率为0.05m³/s，在26℃的环境下和转速为140rpm/min的条件下培养9天。

表1 I号培养基的配方(1L MS培养基中)

名称	含量	名称	含量
				2,4-D	0.5mg/L	6-BA	1.2mg/L

注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素

表2 Ⅱ号灭菌培养基的配方(1L MS培养基中)

名称	含量	名称	含量
				2,4-D	0.3mg/L	6-BA	0.4mg/L

葡萄糖

1g/L

注：2,4-D为生长素，6-BA为细胞分裂素

3.莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备

将得到的浓缩上清用0.22μM过滤除菌。

3)除菌后进行冻干处理，冻干温度为-35℃，真空度为200Pa，冻干时间为36小时，即得到莲叶细胞的次生代谢物冻干粉。将冻干粉分装成1ml/支。

4.测试实施例2制备的莲叶次生代谢物冻干粉对大白鼠皮肤组织匀浆中MDA生成量的影响。自由基形成后，其代谢产物丙二醛(MDA)含量明显增高，MDA为极活泼的交联剂，它能使真皮结构发生大分子交联，使真皮纤维扭曲增粗紊乱，使人的皮肤在外观上日见衰老，MDA含量的高低可间接表征物质的抗脂质过氧化(即抗MDA生成)活性，MDA含量越小，表明物质的抗脂质过氧化能力越强；反之，则抗脂质过氧化能力越弱。

1)将40只大白鼠分成4组，每组10只，去其背部被毛，暴露面积约为6cm。，

2)取同一批次的莲叶细胞次生代谢物冻干粉，涂抹前将与其配对的2ml溶酶完全倒入冻干粉中，充分混匀，将2ml混合物全部均匀地涂抹至小鼠暴露的背部，每两天涂抹一次。

3)第一组，连续涂抹5次后处死，取背部皮肤组织匀浆，制作为10％的匀浆。第二组，连续涂抹10次后处死，取背部皮肤组织匀浆，制作为10％的匀浆。第三组，连续涂抹15次后处死，取背部皮肤组织匀浆，制作为10％的匀浆。第四组不涂抹莲叶次生代谢物冻干粉，30天后处死，取背部皮肤组织匀浆，制作为10％的匀浆。

4)标准管取0.2ml 10mol/ml标准品、标准空白管取0.2ml无水乙醇、测定管取0.2ml测试样品，然后三管均加入0.2ml试剂一，混匀后，均加入3ml试剂二和1ml试剂三。

5)旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，刺一小孔，95℃水浴40分钟，取出后流水冷却，然后3500转/分，离心10分钟。取上清，532mm处，1cm光径，蒸馏水调零，比色测各管吸光度值。

注：步骤2和3均是参考购买说明书，并不知道试剂一、二、三的成分。

4)组织中MDA含量计算公式

表4 莲叶细胞冻干粉对大白鼠皮肤组织匀浆中MDA生成量的影响(％，x±SD，n＝3)

从上表可看出，与空白对照对比，随着涂抹次数的增加，MDA的生成量显著减少,与不涂抹的相比，差异均达到极显著水平(P＜0.01)，表现出良好的涂抹次数－MDA生成的线性关系，可见莲叶细胞次生代谢物具有抑制MDA生成的功效，且随着不断坚持涂抹，其抑制MDA的效果越明显。

5.测试实施例2制备的莲叶次生代谢物冻干粉对人体的抗衰老作用：本发明选取莲叶次生代谢物冻干粉来对人抗衰老作用进行研究。

1)受试物A：溶酶，即为溶解冻干粉的制剂，作为对照组；

受试物B：莲叶次生代谢物冻干粉

2)受试对象：按自愿原则选择年龄在29-56，无严重心、肝、肾脏等主要脏器疾患的脸部有明显皱纹者为受试者，共36例，全部为女性，平均年龄35岁。分为A、B两组，每组18人，A组使用受试物A，B组使用受试物B。

3)使用方法：

A组：取同一批次的莲叶细胞次生代谢物冻干粉，涂抹前将与其配对的2ml溶酶完全倒入冻干粉中，充分混匀，将2ml混合物全部均匀地涂抹至人脸部，每两天涂抹一次，连续涂抹15次，试验期间停止使用脸部有关化妆品。

B组：取同一批次的莲叶细胞次生代谢物冻干粉配对的溶酶，将2ml溶酶全部均匀地涂抹至人脸部，每两天涂抹一次，连续涂抹15次，试验期间停止使用脸部有关化妆品。

4)判断标准：使用前后对比脸谱仪测试光线下面部皮肤表面皱纹度(数值越小代表皱纹程度越轻)。

表5 两种冻干粉使用前后皱纹度(x±SD，n＝1)

从结果来看，A组作为阴性对照，使用前后变化无差别(P＞0.05)，而莲叶次生代谢物冻干粉使用前后变化有明显差异(P＜0.05)，证明莲叶次生代谢物冻干粉连续使用15天后，对于皮肤上的皱纹有所改善，具有抗衰老的功效。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims

1.一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)获取莲叶细胞株：在每0.5g-3.0g无菌莲叶中加入5-30ml Murashige and Skoog培养基及0.025-0.30ml质量分数为0.2-0.3％纤维素酶溶液和0.025-0.30ml质量分数为0.2-0.3％果胶酶溶液进行消化；将消化后所得消化液过滤、离心除去上清液后得到莲叶细胞株；

(2)大量培养莲叶细胞：

2.根据权利要求1所述的一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中选取新鲜莲叶进行消毒。

3.根据权利要求1所述的一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中将莲叶在质量分数为15％-20％的次氯酸钠溶液中消毒，消毒后采用无菌去离子水清洗。

4.根据权利要求1所述的一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述无菌莲叶在加入Murashige and Skoog培养基前为碎片，且碎片面积大小≤1mm²；所述纤维素酶溶液与果胶酶溶液体积为1:1。

5.根据权利要求1所述的一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)中采用200目无菌网筛对消化液进行过滤，将过滤液加入到Countstar细胞计数器中，过滤液在250g的离心力下离心10min。

6.根据权利要求1所述的一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(2)中初步培养时每100ml莲叶细胞液培养14天。

7.根据权利要求1所述的一种莲叶细胞次生代谢物冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述莲叶细胞培养物采用孔径小于0.45μM的滤膜过滤；浓缩上清液至浓缩液中蛋白浓度为50±0.5μg/ml；浓缩上清液采用孔径小于0.22μM的滤膜过滤。所述冻干处理时冻干温度为(-20℃)-(-35℃)，真空度为50-200Pa，冻干时间为24-36小时，即得到莲叶细胞次生代谢物冻干粉。

8.权利要求1所述的制备方法制得的莲叶细胞次生代谢物冻干粉在抗衰老护肤品中应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗衰老扶护品为面膜、爽肤水、面霜、乳液、眼霜、洗面乳。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述莲叶细胞次生代谢物冻干粉在抗衰老扶护品中的添加量为300-800μg/ml。