CN105613285A - 一种快速提高丹参中迷迭香酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术和植物学技术领域，本发明提供了一种快速提高丹参中迷迭香酸含量的方法，是将外植体接种于MS基本培养基附加2,4-D、6-BA、NAA在一定条件下培养得到颜色有光泽呈鲜黄绿色，生长旺盛，疏松的丹参愈伤组织；将上述愈伤组织接种到于与上述所使用的MS固体培养基相同组分和含量的液体培养基中，一定条件下振荡培养，反复继代，得到分散性良好的悬浮细胞系并通过茉莉酸甲酯进行诱导培育出迷迭香酸含量高的丹参细胞系，实现人工培养，达到规模化生产的目的。

Description

一种快速提高丹参中迷迭香酸含量的方法

技术领域

本发明属于生物技术和植物学技术领域，特别涉及到一种快速提高丹参中迷迭香酸含量的方法。

背景技术

丹参(SalviamiltiorrhizaBunge)又名赤参、紫丹参，为唇形科鼠尾草属多年生草本植物丹参的根。丹参中的药用活性成分主要分为丹参酮和丹参酚酸两大类。丹参具有活血化淤、清热解毒、通经、凉血消肿、镇静安神之功效，广泛应用于心脑血管疾病的治疗。

丹参酮(tanshinone)是中药丹参的根的提取物，其中含有丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮ⅡB等40余种化合物。丹参酮对心血管系统具有广泛的作用，主要表现为内皮细胞保护作用、抗心肌缺血作用、改善血液代谢作用以及对心肌的保护作用。其作用机制研究证明，丹参酮对内细胞缺血再灌注性损伤有保护作用，可以抑制低密度脂蛋白的氧化，抑制脂制代谢酶的活性，改善脂质代谢过程，对于防治心血管疾病有良好作用(中国专利申请号：200610005271.1，公告号：CN100362993C，发明名称：一种丹参酮乳剂及其制备方法)。

丹参酚酸类化合物是存在于丹参或其同属植物中的酚酸类化合物，其中含有丹参酚酸A、丹参酚酸B(LAB)、迷迭香酸(RA)等多种化合物。丹参酚酸类化合物对于心脑血管具有保护作用。能够抗纤维化，抗肝损伤。可治疗消化性溃疡。还能杀伤癌细胞，增强抗癌药物的疗效，且不会相应增加抗癌药物的毒性。丹参酚类化合物没有明显的毒副作用(中国专利申请号:200510094596.7，公告号：CN1762341B，发明名称：治疗心脑血管疾病、肝脏疾病的丹参酚酸复合物及其应该用)。

迷迭香酸(Rosmarinicacid，简称RosA)是一种天然多功能酚酸类化合物。迷迭香酸具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏、抗氧化、抗血栓抗血小板聚集、防辐射和免疫抑制作用，迷迭香酸对神经系统有抗焦虑作用，对细胞损伤有保护作用，广泛应用于医药、食品、化妆品等方面。最新研究表明，丹参中迷迭香酸有抗艾滋病病毒(HIV)活性(参见文献：WilliamH，WilliamBL.Inhibitorsofhumanimmunodeficiencyvirustype1reversetranscriptasetargetdistinctphasesofearlyreversetranscription.Journalofvirology,2001，75：3095-3104)。

随着丹参有效成分及其药理活性的深入研究，近年来以丹参为主要原料的药品、制剂、化妆品和系列保健产品层出不穷，丹参资源供不应求。伴随着丹参药材需求的日益扩大和野生资源的逐渐减少，质量参差不齐，加剧了丹参的供需矛盾。目前提高丹参有效成份的方法有人工栽培配合茉莉酸诱导，毛状根培养，转基因毛状根培养，茉莉酸诱导毛状根，水杨酸诱导丹参培养细胞等等；提高的成份主要是丹参酮类(包括隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参酮I和二氢丹参酮I)和丹酚酸类(包括丹酚酸、丹酚酸B、迷迭香酸和丹酚酸K)。

因此提高丹参中有效成分的含量，尤其是迷迭香酸的含量，对培育优异的丹参资源具有重要意义。

目前尚无文献报道丹参细胞系悬浮细胞培养提高迷迭香酸含量的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速提高丹参中迷迭香酸含量的方法，是用丹参细胞系悬浮细胞培养方法，提高丹参中有效成分--迷迭香酸的含量。

本发明的主要技术方案是：通过将愈伤组织转接至液体培养基、反复继代，并通过茉莉酸甲酯进行诱导培育出迷迭香酸含量高的丹参细胞系，实现人工培养，达到规模化生产的目的。

本发明提供了一种快速提高丹参中迷迭香酸含量的方法，该方法主要由以下步骤组成：

A、外植体处理：取丹参种子作为外植体，进行清洗和消毒，将干燥的种子接种到MS空白培养基上，培养成为无菌苗，在无菌状态下将丹参无菌苗幼叶、茎、根分别剪下，将叶片制成块，茎及根制成段；

B、愈伤组织的诱导：选用MS作为丹参愈伤组织诱导的基本培养基，将步骤A制备好的外植体接种于MS培养基附加0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、0.5mg/L的萘乙酸(NAA),培养基的蔗糖浓度为3％，琼脂浓度为1％，pH值为5.0-6.5，在光照12小时/天，光照强度为3000Lux条件下培养30天，温度为25℃，得到颜色有光泽呈鲜黄绿色，生长旺盛，疏松的愈伤组织；

C、细胞的悬浮培养：将步骤B得到的愈伤组织接种到于与步骤B中所使用的MS培养基相同组分和含量的液体培养基中，培养温度28℃，黑暗条件下，120r/min振荡培养，每18-20天进行一次继代培养，继代培养3-15次后得到分散性良好的悬浮细胞系；

D、茉莉酸甲酯诱导丹参悬浮细胞：在无菌条件下，取新鲜继代5次以上得到丹参悬浮细胞，按悬浮细胞体积计算，将茉莉酸甲酯用无菌注射器通过无菌过滤膜注入悬浮细胞系中，终浓度为0.1mM/L，培养至12天以上较优为14天，即得到迷迭香酸含量高的丹参细胞系。

其中步骤A中，较优的，叶片制成0.5×0.5cm的块，茎及根制成1cm的段。

其中在步骤B中，较优的，培养基中还添加了0.1mg/L的Vc。

步骤B中，2,4-D母液的配置方法：取10mg2,4-D，先溶于95％乙醇中，然后加入去离子水加热溶解，定容至100mL，冷藏保存；

NAA母液的配置方法:取50mgNAA，先溶于少量lmol/L的氢氧化钠中，然后用去离子水定容至100mL，冷藏保存；

6-BA母液的配置方法：取50mg6-BA，先溶于少量lmol/L的氢氧化钠中，然后用去离子水定容至100mL，冷藏避光保存。

步骤B中，pH值较优为6.0-6.5。

步骤C中，所述的愈伤组织为颗粒细小、疏松易碎、外观湿润鲜艳的白色或淡黄色愈伤组织。

术语解释，本文中“外植体”指由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官。

MS空白培养基、MS、MS基本培养基、MS固体培养基，表示同一意思，是指MS培养基，固体的是添加有琼脂的MS培养基，液体是未添加琼脂的培养基，MS粉末(不含蔗糖)可直接购自上海前尘生物科技有限公司。

Lux条件是指光照强度。

液体培养基是指未添加琼脂的培养基。

继代培养是对来自于外植体所增殖的培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代的培养

悬浮细胞系是由单一细胞增殖产生的遗传背景一致的悬浮细胞。

本发明的方法克服了丹参作为常异交植物，种内变异较大，性状复杂；栽培丹参只种不选的状况使得各产地丹参质量参差不齐，品种退化严重，有效成分含量不稳定的问题。本发明经高效液相(HPLC)实验证明，有效成份4-香豆酸、肉桂酸、L-苯丙氨酸、4-羟基苯丙酮酸、尿黑酸、L-酪氨酸、迷迭香酸和丹酚酸B提高。特别是能够快速提高丹参中迷迭香酸的含量。

本发明的方法操作简单，能够生产出迷迭香酸含量高的丹参细胞系，满足了市场需求。

附图说明

图1悬浮细胞显微图，其中A是三五个成群聚集在一起的丹参悬浮细胞、B是成熟的细胞，细胞核比较小、C是小圆形的成熟细胞，细胞核比较大。

图2悬浮细胞TTC染色图。

图3经MeJA诱导后丹参悬浮细胞的含量测定结果。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

1、外植体处理：用自来水冲洗丹参(S.miltiorrhizaBunge)种子4小时以上，之后将其浸泡在75％的乙醇溶液中30秒，然后用无菌去离子水冲洗5次，再用浓度为0.1％的升汞溶液(1g/LHgCl₂)浸泡10分钟，最后用无菌水冲洗5次，用无菌的纱布将其擦干净，将擦净的种子接种到MS培养基(购自上海生工生物工程公司)上，培养数周后将长成为无菌苗。取无菌丹参幼苗，用去离子水冲洗干净，并用软毛刷轻轻刷洗，在无菌条件下将丹参无菌苗幼叶、茎、根分别剪下，用剪刀将叶片切成0.5×0.5cm，上表皮向下接种诱导在MS培养基上，茎及根切成1cm小段。

2、激素的配置：

2,4-D母液(100mg/L，购自上海源叶生物科技有限公司)：取10mg2,4-D，先溶于95％乙醇中，然后加入去离子水加热溶解，定容至100mL，冷藏保存。

NAA母液(500mg/L，购自上海源叶生物科技有限公司)：取50mgNAA，先溶于少量lmol/L的氢氧化钠中，然后用去离子水定容至100mL，冷藏保存。

6-BA母液(500mg/L，购自上海源叶生物科技有限公司)：取50mg6-BA，先溶于少量lmol/L的氢氧化钠中，然后用去离子水定容至100mL，冷藏避光保存。

3、愈伤组织的诱导：选用MS(购自上海生工生物工程公司)作为丹参愈伤组织诱导的基本培养基，将步骤1备好的外植体接种于基本培养基附加表1中2,4-D、6-BA、NAA不同浓度,培养基的蔗糖浓度为3％，琼脂浓度为1％，pH值为6.3，在光照12h/d，光照强度为3000Lux条件下培养30d，温度为25℃，得到颜色有光泽呈鲜黄绿色，生长旺盛，疏松的愈伤组织。

表1诱导愈伤组织培养基

表2不同激素配比对愈伤组织诱导的影响

4、细胞的悬浮培养:挑选步骤3中颗粒细小、疏松易碎、外观湿润鲜艳的白色或淡黄色愈伤组织接种到与步骤3中所使用的MS固体培养基相同组分和含量的液体培养基中，培养温度28℃，黑暗条件下，120r/min振荡培养，每19天进行一次继代培养，继代培养5次后得到分散性良好的悬浮细胞系。

5、茉莉酸甲酯诱导丹参悬浮细胞：在无菌条件下，取新鲜继代5次以上得到丹参悬浮细胞，按悬浮细胞体积计算，将茉莉酸甲酯(购自SIGMA)用无菌注射器通过无菌过滤膜注入悬浮细胞系中，终浓度为0.1mM/L，培养12天得到迷迭香酸含量高的丹参细胞系。

实施例2：

步骤3中基本培养基中还加入了0.1mg/LVc，防褐变，其余步骤同实施例1。

实施例3-7：

步骤4中悬浮细胞培养液体培养基的激素配比按表1编号3-8，共6组，其余步骤同实施例1。进入悬浮培养阶段的各激素配比下的丹参悬浮细胞形态见表3，实施例1中的3号激素配方获得了生长状态最佳的悬浮细胞。

表3各种悬浮细胞系的形态

实施例8：丹参悬浮细胞形态观察

丹参悬浮细胞一般呈圆形或长圆形，体积小。三五个成群聚集在一起，个别单个存在。小圆形的细胞，细胞核比较大；成熟的细胞，细胞核比较小，细胞质中有颗粒状物质存在。培养15天，可见许多圆形细胞，此时，细胞体积大；培养20天，细胞进入停滞期，处于休眠状态，此时多见长形死细胞。定期更新新鲜培养液，细胞又逐渐增大。

分别将表3中六组丹参悬浮细胞置于显微镜下观察(10×40)，观察结果如图1所示(图1是3号的结果)。

实施例9：丹参悬浮细胞TTC法活性测定

TTC活性测定操作过程：无菌条件下向1mL丹参悬浮细胞液中添加1mL0.4％TTC溶液，充分混匀后于室温下暗反应3～6h。反应完成后具有生命力的细胞染成红色，死细胞不染色，4500rpm离心后真空吸取上清液，去离子水洗涤3遍。放置血球计数板上记录活细胞数目。

图2为六组不同激素浓度配比下的TTC染色结果图，从左到右编号依次为1～6号分别为表1中5，4，3，6，7，8号激素配比下的细胞，活细胞由于呼吸作用产生红色物质TTF，表明丹参悬浮细胞为正常生长并具有活性的细胞。

实施例10：LC-MS/MS测定丹参中酚酸类化合物含量

1、对照品、供试品溶液的制备及色谱分离条件

用甲醇将精密称取尿黑酸、LAB、L-酪氨酸和肉桂酸溶解，用水将L-苯丙氨酸和RA溶解，用50％甲醇将精密称取4-羟基苯丙酮酸和4-香豆酸溶解，分别制成每lmL含丹酚酸B、迷迭香酸、肉桂酸、尿黑酸、酪氨酸、苯丙氨酸、4-羟基苯丙酮和4-香豆酸1mg作为对照品溶液。

将3号配方制备得到的丹参悬浮细胞置于37℃恒温烘箱中干燥，干燥后研磨成粉，称取50mg，过100目筛，30％乙醇25mL，超声提取两次，每次10min，4500rpm离心5min，滤液用50mL容量瓶定容至50mL，滤液用0.2μM微孔有机滤膜过滤，进样。

色谱柱：美国Agilent公司，AgilentZorbaxSBC183.5μm150×2.1mmID，采用等梯度洗脱方式，流速0.3mL/min，进样量10μL，流动相：乙腈-水(55:45)，柱温30℃，分析时间3.5min。

2、质谱检测条件及LC-MS/MS测定丹参中酚酸类化合物的方法学考察

采用ESI离子源、负离子检测，选择MRM工作方式进行一/二级质谱分析。质谱检测工作参数如下：GasFlow10L/min、GasTemp350℃、Nebulizer40psi、MS2Heater100℃、Capillary4000V、RoughVac2.05E+0Torr、Turbo1speed100％、MS1Heater100℃、HighVac3.03E-5Torr、Turbo1power130w。优化的多反应监测(MRM)参数见表4。

表4.优化的多反应监测(MRM)参数

化合物	母离子峰	解离能(V)	碰撞能(eV)	子离子峰
					4-羟基苯丙酮酸	179	70	8	107
4-香豆酸	163	100	12	119
					肉桂酸	147	100	10	102
L-酪氨酸	180	100	18	119
					L-苯丙氨酸	164	100	15	147
尿黑酸	167	100	8	123
					LAB	717	150	12	519
RA	359	120	14	161

注：表中LAB表示丹酚酸B，RA表示迷迭香酸。

3.1线性考察

精密吸取1mg/mL的标准对照品溶液适量，分别置于5个5mL的容量瓶中，定容至容量瓶刻度，分别配置成不同浓度的标准溶液，摇匀后进样，以样品浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标绘制标准曲线,计算线性相关系数r。结果见表5。

表5标准曲线测定结果(n＝5)

化合物	标准曲线方程	相关系数(r2)	线性范(ng/mL)
				4-羟基苯丙酮酸	A＝29.492C+589.69	0.9913	30～300
4-香豆酸	A＝2152.6867C+233.4033	0.9991	0.5～5
				肉桂酸	A＝334.7573-394.8667	0.9988	2.5～25
L-酪氨酸	A＝49.4590C-10.4933	0.9947	3.5～35
				L-苯丙氨酸	A＝131.9075C-11.15	0.9951	4～40
尿黑酸	A＝486.17+2186.9	0.999	50～500
				LAB	A＝654.04-1000000	0.9965	1200～120000
RA	A＝1697.8C+2000000	0.9968	3000～30000

3.2精密度试验

取上述标准曲线制备项下LAB对照品溶液(30000ng/mL)、RA对照品(12000ng/mL)、L-苯丙氨酸对照品(16ng/mL)、尿黑酸对照品(200ng/mL)、肉桂酸对照品(10ng/mL)、4-香豆酸对照品(2ng/mL)、4-羟基苯丙酮酸对照品(120ng/mL)和L-酪氨酸对照品(14ng/mL)，连续重复进样六次，记录峰面积，计算相对标准偏差RSD。结果表明精密度良好，如表6所示。

表6精密度测定结果(n＝6)

样品	1	2	3	4	5	6	RSD％
								尿黑酸	187.6	193.9	188.34	197.23	193.65	197.45	1.74
L-苯丙氨酸	16.23	17.34	18.32	18.76	17.46	16.98	2.97
								L-酪氨酸	14.34	16.34	15.43	14.13	15.65	11.43	8.61
肉桂酸	10.76	10.63	9.76	9.65	9.27	10.64	5.52
								4-香豆酸	1.87	1.98	2.07	2.19	1.93	1.82	5.23
4-羟基苯丙酮酸	118.12	117.63	135.68	120.37	124.38	120.47	3.94
								RA	11765.98	12067.98	11876.9	11335.21	11659.8	12001.9	1.68
LAB	31761.23	30921.23	30214.39	31123.47	30631.93	31246.13	1.27

3.3重现性试验

供试品溶液均由同一样品制备，连续测定6次，记录色谱峰面积，计算RSD，进行重复性考察。重现性试验结果表明重现性良好，结果如表7所示。

表7重现性测定结果(n＝6)

样品	1	2	3	4	5	6	RSD％
								尿黑酸	387.32	397.32	409.31	397.34	406.39	389.63	2.2
L-苯丙氨酸	35.76	34.98	32.74	35.79	37.21	33.58	4.64
								L-酪氨酸	36.92	37.48	33.97	28.52	30.47	35.29	10.63
肉桂酸	7.98	6.92	8.03	6.31	7.32	8.11	9.78
								4-香豆酸	3.59	3.62	3.11	2.99	3.62	2.71	11.95
4-羟基苯丙酮酸	251.29	263.17	259.01	238.91	247.12	238.62	4.07
								RA	13679.32	13761.12	14383.76	13719.36	13734.64	14032.12	1.98
LAB	1847.21	1820.11	1823.87	1839.16	1852.93	1837.21	0.70

3.4最小检测限

取4-香豆酸、肉桂酸、L-苯丙氨酸、4-羟基苯丙酮酸、尿黑酸、L-酪氨酸、迷迭香酸和丹酚酸B储备液，用流动相稀释至不同浓度的样品溶液，取10μL注入液相色谱仪测定最小检测量。以信噪比大于3估算最小检测量，结果：肉桂酸、尿黑酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、4-香豆酸、RA、LAB和4-羟基苯丙酮酸主峰的最小检测量分别约为0.60ng/mL、1.0ng/mL、0.8ng/mL、3.5ng/mL、0.42ng/mL、0.17ng/mL、12.0ng/mL和3.0ng/mL。

3.5样品溶液稳定性试验

取供试样品，制备定量供试品溶液，在仪器运行的情况下，0间隔(0，2，4，6，12，24h)每隔两小时进样，记录峰面积，计算RSD。结果，24h内尿黑酸、L-苯丙氨酸、4-羟基苯丙酮酸、肉桂酸、4-香豆酸、L-酪氨酸、RA和LAB样品溶液中的响应峰面积稳定，RSD＜5.0％，如表8所示。

表8.样品溶液稳定性测定结果

放置时间	0hr	2hr	4hr	6hr	12hr	24hr	RSD％
								尿黑酸	387.21	397.34	396.78	396.72	376.87	387.39	2.21
L-苯丙氨酸	23.62	22.86	23.74	22.15	23.68	23.94	2.94
								L-酪氨酸	24.74	24.36	23.51	24.73	23.49	24.28	2.32
肉桂酸	7.76	6.98	7.43	7.36	8.04	7.87	5.14
								4-香豆酸	4.87	4.54	5.18	3.98	2.34	3.54	25.44
4-羟基苯丙酮酸	287.76	264.87	285.76	276.87	287.45	298.46	4.03
								RA	9887.98	10876.43	11467.04	9326.98	12753.14	10342.96	11.34
LAB	1987.23	1865.26	1740.32	2061.51	1856.92	1856.86	5.97

3.6样品含量测定

取各个供试品溶液样品，按外标法计算供试品中肉桂酸、4-香豆酸、4-羟基苯丙酮酸、尿黑酸、迷迭香酸、丹酚酸B、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸含量。

对数生长期后期和稳定期开始阶段为诱导子的最佳添加时间，本实验选择继代5次后的悬浮细胞添加MeJA(0.1mM)。考察诱导3d、6d、9d、12d后，利用LC-MS/MS对丹参中酚酸类化合物(丹酚酸B、迷迭香酸、肉桂酸、尿黑酸、酪氨酸、苯丙氨酸、4-羟基苯丙酮和4-香豆酸)的影响。结果表明：在MeJA(0.1mM)作用下，丹参悬浮细胞中的丹参酚酸类成分以及参与迷迭香酸合成的途径中的代谢产物含量均有不同程度的抑制或促进，不同程度的促进了酪氨酸、尿黑酸、对羟基苯丙酮酸和香豆酸的积累。与未处理的空白悬浮细胞(CK)相比，分别提高了酚酸类成分LAB4.95倍(25046.03±7.82mg/g,DW)，和RA3.49倍(8946.7±mg/g,DW)，MeJA对RA的诱导作用在处理后的第12天达到最高峰后呈下降趋势，随着培养时间的增长，含量逐渐降低。然而，MeJA对L-苯丙氨酸的积累抑制作用，第3天开始含量逐渐下降，在第12天含量有增加的趋势；4-羟基苯丙酮酸经诱导后与对照相比，在第12天达到最大值。图3显示MeJA(0.1mM)对丹参悬浮细胞中各化合物积累的影响。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (8)

1.一种快速提高丹参中迷迭香酸含量的方法，包括如下步骤：

A、外植体处理：取丹参种子作为外植体，接种到MS空白培养基上，培养成为无菌苗，在无菌状态下将丹参无菌苗幼叶、茎、根分别剪下，叶片成块，茎及根成段；

B、愈伤组织的诱导：选用MS作为丹参愈伤组织诱导的基本培养基，将步骤A制备好的外植体接种于MS培养基中添加0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.5mg/L的萘乙酸,培养基的蔗糖浓度为3％，琼脂浓度为1％，pH值为5.0-6.5，在光照12小时/天，光照强度为3000Lux条件下培养30天，温度为25℃，得到颜色有光泽呈鲜黄绿色，生长旺盛，疏松的愈伤组织；

C、细胞的悬浮培养：将步骤B得到的愈伤组织接种到于与步骤B中所使用的MS培养基相同组分和含量的液体培养基中，培养温度28℃，黑暗条件下，120r/min振荡培养，每18-20天进行一次继代培养，继代培养3-15次后得到分散性良好的悬浮细胞系；

D、茉莉酸甲酯诱导丹参悬浮细胞：在无菌条件下，取新鲜继代5次以上得到丹参悬浮细胞，按悬浮细胞体积计算，将茉莉酸甲酯用无菌注射器通过无菌过滤膜注入悬浮细胞系中，终浓度为0.1mM/L，培养12天以上。

2.根据权利要求1所述的一种丹参细胞系悬浮细胞培养的方法，其特征在于，所述的步骤A中，叶片制成0.5×0.5cm的块，茎及根制成1cm的段。

3.根据权利要求1所述的一种丹参细胞系悬浮细胞培养的方法，其特征在于，所述的步骤B中，MS培养基中还添加了0.1mg/L的Vc。

4.根据权利要求1所述的一种丹参细胞系悬浮细胞培养的方法，其特征在于，所述的步骤B中，2,4-二氯苯氧乙酸的配置方法如下：

取10mg的2,4-二氯苯氧乙酸，先溶于95％乙醇中，然后加入去离子水加热溶解，定容至100mL，冷藏保存。

5.根据权利要求1所述的一种丹参细胞系悬浮细胞培养的方法，其特征在于，所述的步骤B中，6-苄氨基腺嘌呤的配置方法如下：

取50mg的6-苄氨基腺嘌呤，先溶于少量lmol/L的氢氧化钠中，然后用去离子水定容至100mL，冷藏避光保存。

6.根据权利要求1所述的一种丹参细胞系悬浮细胞培养的方法，其特征在于，所述的步骤B中，萘乙酸的配置方法如下：

取50mg的萘乙酸，先溶于少量lmol/L的氢氧化钠中，然后用去离子水定容至100mL，冷藏保存。

7.根据权利要求1所述的一种丹参细胞系悬浮细胞培养的方法，其特征在于，所述的步骤B中，pH值为6.0-6.5。

8.根据权利要求1所述的一种丹参细胞系悬浮细胞培养的方法，其特征在于，所述的步骤C中，所述的愈伤组织为颗粒细小、疏松易碎、外观湿润鲜艳的白色或淡黄色愈伤组织。