CN102696481A

CN102696481A - 一种提高丹参毛状根中丹参酮类活性成分产量的方法

Info

Publication number: CN102696481A
Application number: CN2012101491567A
Authority: CN
Inventors: 周铜水; 杨翼信
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2012-05-15
Filing date: 2012-05-15
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明属于植物组织培养技术领域，具体为一种提高丹参毛状根中丹参酮类活性成分产量的方法。本发明采用脱落酸处理悬浮培养的丹参毛状根提高丹参酮类成分产量，具体步骤为：将在6,7-V固体培养基上培养获得的丹参毛状根种株接种到GamborgB5液体培养基中，黑暗培养箱中用振荡培养若干天，然后转移到含有脱落酸的GamborgB5液体培养基中培养1-9天。本发明处理后得到的丹参毛状根中包括丹参酮IIA、二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮等丹参酮类化合物的含量提高了2～6倍。本发明为利用丹参毛状根快速高效生产丹参酮类活性成分提供了有效途径。

Description

一种提高丹参毛状根中丹参酮类活性成分产量的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种提高丹参毛状根中丹参酮类活性成分产量的方法。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我国一种传统中草药，因根赤色得名，始载于《神农本草经》，列为上品，能活血化瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈，现代临床上常用于心血管疾病的治疗，具有极高的药用价值。丹参的主要药用活性成分为水溶性的酚酸类化合物和脂溶性的丹参酮类化合物，其中丹酚酸B (≥3.0%) 和丹参酮IIA (≥0.2%)是《中国药典》规定的指标成分。丹参的这二类化合物都具有抗氧化、抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、抗HIV、抗过敏、抗炎、以及扩张冠状动脉等生物活性活性。现代医学研究表明不同结构丹参酮类成分生物活性存在差异：丹参酮I能提高学习和记忆能力，丹参酮IIA则具有抗增生的活性，并能缓解骨吸收疾病的症状；二氢丹参酮I和隐丹参酮这两种具有二氢呋喃环的丹参酮具有抗菌、抗过敏效果。此外，作为二萜醌类色素的丹参酮类成分在植物天然色素开发领域受到了额外的关注。

应对目前丹参野生资源日益匮乏，栽培品种的药材质量差别大、品质严重退化、生长周期长等种种困境，生物工程技术或植物组织培养技术为丹参次生代谢物的获取提供了一种优良的替代生产体系，其中利用发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) 感染丹参获得转化毛状根的技术使工业化生产丹参药用有效活性成分成为可能。毛状根培养系统具有激素自主、遗传稳定、生长快速等优势，较之植物细胞更适合工业规模的生产。通常毛状根能够稳定合成母体植物中绝大多数次生代谢物，甚至还有可能形成一些新的化合物。但转化过程中Ri基因插入宿主基因组中位置的随机性和拷贝数的不确定性导致不同毛状根株系间的产物性质及生长速度等生理特征存在差异。在研究初期，丹参毛状根的丹参酮类含量仅为干重的0.036%-0.068%，远小于生药中0.15%丹参酮的含量。采用生物或非生物诱导子诱导提高丹参毛状根活性成分的产量是行之有效的方法，迄今为此，已报道利用酵母提取物、茉莉酸甲脂、山梨酸、银离子(Ag⁺)等作为诱导子诱导提高丹参毛状根中丹参酮类成分产量的方法，但未见采用脱落酸(abscisic acid, ABA)为诱导子诱导提高丹参酮类成分产量的研究。

本发明将脱落酸(abscisic acid, ABA)加入到丹参毛状根悬浮培养体系中诱导提高丹参酮类成分，并对其最适浓度与最佳处理时间获进行了优化，为提高丹参毛状根丹参酮产量提供了新的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺简单、成本低廉的显著提高丹参毛状根中丹参酮类成分产量的方法。

本发明的另一个目的在于提供由本发明利用丹参毛状根生产的丹参酮类活性成分，并提供这些成分在制备丹参总酮提取物、丹参酮IIa和隐丹参酮单体成份，以及在丹参酮类药物制剂方面的应用。

本发明的再一个目的在于提供利用丹参毛状根生产的丹参酮类作为天然色素，在食品、药品以及化妆品领域的应用。

本发明提供的提高丹参毛状根中丹参酮类成分产量的方法，是采用脱落酸处理悬浮培养的丹参毛状根提高丹参酮类成分产量，具体步骤为：将在6,7-V固体培养基上培养3-4周获得的丹参毛状根种株接种到Gamborg B5液体培养基中，20-30℃黑暗培养箱中用100-300 rpm水平振荡培养15-30天，然后转移到含有脱落酸的Gamborg B5液体培养基中培养1-9天；所述脱落酸的浓度为1-100 μmol/L。

本发明中，所用丹参毛状根是利用发根农杆菌C58C1诱导丹参无菌苗外植体产生丹参毛状根株系Sm031103。

本发明中，所述脱落酸的处理浓度优选为1-25μmol/L。

本发明中，所述丹参酮类成分包括丹参酮IIA、二氢丹参酮I、丹参酮I和隐丹参酮。

本发明采用脱落酸处理丹参毛状根，显著诱导和提高了丹参酮类成分的含量。实验证明，采用浓度为1-100 μmol/L的脱落酸处理丹参毛状根1-9天丹参毛状根中总丹参酮类成分的含量可提高2-6 倍。经本方法优化后的最佳脱落酸效应浓度为1-25μmol/L（约0.26-7.5 mg/L）。本发明成本低廉，操作简便，为利用丹参毛状根培养体系生产丹参药用活性成分提供了一个稳定、高效的途径。

本发明的具体操作步骤如下：

（1）丹参毛状根的诱导：应用发根农杆菌C58C1侵染丹参无菌外植体形成毛状根。待毛状根长到2厘米左右切下，除菌后在6,7-V固体培养基上培养，经筛选获得丹参毛状根Sm031103。

（2）丹参毛状根的固体培养：将毛状根Sm031103在6,7-V固体培养基上，22℃黑暗静置培养，3-4周后继代一次。

（3）丹参毛状根的液体悬浮培养：毛状根Sm031103在6,7-V固体培养基上培养了3-4周后，挑取鲜嫩粗壮的毛状根转入稀释一倍的 Gamborg B5液体培养基，22℃，黑暗，120rpm水平振荡培养3周。

（4）脱落酸诱导处理：将液体悬浮培养3周后的丹参毛状根转入含有一定浓度脱落酸的新鲜稀释一倍的Gamborg B5液体培养基，诱导提高毛状根中丹参酮类成分的含量。其中，脱落酸的处理浓度为1-100μmol/L，优选为1-25μmol/L。脱落酸处理时间为1-9天，优选为7-9天。

本发明所述丹参毛状根，是由唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)无菌幼根或幼苗，经发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes, C58C1株系)诱导形成的毛状根。

本发明中，所述6,7-V固体培养基组成为(mg/L)：(1) 大量元素((NH₄)₂SO₄ 100; KNO₃ 800; Na₂HPO₄·12H₂O 20; MgSO₄·7H₂O 250; CaCl₂·2H₂O 200; NaH₂PO₄ 150; KCl 200)；(2)微量元素(NaMoO₄·2H₂O 0.25; CoCl₂·6H₂O 0.25; KI 0.05; MnSO₄·4H₂O 4.0; ZnSO₄·7H₂O 1.5; H₃BO₃ 5.0)；(3) Fe盐((EDTA)₂FeNa·3H₂O 21.1)；(4) 有机成分(VB₁ 0.5; VB₆0.5; 烟酸 1.5; 肌醇 100)。所述Gamborg B5液体培养基组成为(mg/L)：(1) 大量元素((NH₄)₂SO₄ 134; KNO₃2500; NaH₂PO₄·H₂O 150; MgSO₄·7H₂O 250; CaCl₂·2H₂O 150)；(2) 微量元素(NaMoO₄·2H₂O 0.25; CoCl₂·6H₂O 0.025; KI 0.75; MnSO₄·4H₂O 10; ZnSO₄·7H₂O 2.0; H₃BO₃ 3.0)；(3) Fe盐(CuSO₄·5H₂O 0.025; Na₂·EDTA 37.3; FeSO₄·7H₂O 27.8)；(4) 有机成分(VB₁10; VB₆ 1.0; 烟酸 1.0; 肌醇 100)。

上述培养基用浓度为1 mol/L的NaOH和HCl调节pH值至5.6-5.8后，加入3%蔗糖（固体培养基中还需加入7.5 g/L琼脂粉），121℃高压灭菌备用。

本发明还提供一种从丹参毛状根中提取丹参总酮提取物的方法，其步骤为：将上述利用脱落酸诱导培养获得的丹参毛状根，滤干培养液后，粉碎，用5-10倍样品量(重量比)的丙酮回流提取二次，每次各1.0小时，合并提取液，回收丙酮，浓缩液加5倍量去离子水稀释，抽滤澄清，滤液用 D101 大孔吸附树脂吸附，先用体积浓度为的 20-50%(与水体积比)乙醇或甲醇洗脱，收集 20-50%乙醇或甲醇洗脱液弃去，柱床再用体积浓度为40-95% (与水体积比)乙醇或甲醇洗脱，收集 40-95% 乙醇或甲醇洗脱部分，浓缩、冻干，即得丹参总酮提取物（即包括丹参酮类成分）。提取物中二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA 四种丹参酮的含量总和不低于75%。

上述获得的丹参总酮提取物，可直接用于制备丹参酮类药物制剂；或可直接作为紫红色丹参色素应用于食品、药品或化妆品的着色剂；或可进一步用于生产丹参酮IIA，隐丹参酮等单体化合物，用作药物制剂原料或中间体。

附图说明

图1.为ABA诱导丹参毛状根酮类成分含量测定HPLC色谱图。

图2. 为不同浓度脱落酸处理丹参毛状根后丹参酮类成分含量柱状图。

图3. 为相同浓度(5 μmol/L)的脱落酸处理不同时间后丹参毛状根中丹参酮类成分含量图。

具体实施方式

以下以具体实施实例进一步说明本发明内容：

实施例 1. 以脱落酸诱导丹参毛状根高效生产丹参酮类成分的方法

实验材料：

YEB培养基组成为(g/L)： (胰蛋白胨5.0；酵母提取物 1.0；牛肉膏 5.0；MgSO₄·7H₂O 0.493)。

6,7-V固体培养基组成为(mg/L)：(1)大量元素((NH₄)₂SO₄ 100; KNO₃ 800; Na₂HPO₄·12H₂O 20; MgSO₄·7H₂O 250; CaCl₂·2H₂O 200; NaH₂PO₄ 150; KCl 200)；(2)微量元素(NaMoO₄·2H₂O 0.25; CoCl₂·6H₂O 0.25; KI 0.05; MnSO₄·4H₂O 4.0; ZnSO₄·7H₂O 1.5; H₃BO₃ 5.0)；(3) Fe盐((EDTA)₂FeNa·3H₂O 21.1)；(4) 有机成分(VB₁ 0.5; VB₆0.5; 烟酸 1.5; 肌醇 100)。

MS固体培养基组成为(mg/L)：(1)大量元素(NH₄NO₃1,650; KNO₃ 1,900; MgSO₄·7H₂O 370; CaCl₂·2H₂O 440; KH₂PO₄170)；(2) 微量元素(Na₂MoO₄·2H₂O 0.25; CoCl₂·6H₂O 0.025; KI 0.83; MnSO₄·4H₂O 22.3; ZnSO₄·7H₂O 8.6; H₃BO₃6.2; CuSO₄·5H₂O 0.025)；(3) Fe盐(Na₂EDTA·2 H₂O 37.3; FeSO₄·7H₂O 27.8)；(4) 有机成分(VB₁0.5; VB₆ 0.4; 烟酸 0.5; 肌醇 100; 甘氨酸 2.0)。

Gamborg B5液体培养基组成为(mg/L)：(1) 大量元素((NH₄)₂SO₄ 134; KNO₃2500; NaH₂PO₄·H₂O 150; MgSO₄·7H₂O 250; CaCl₂·2H₂O 150)；(2) 微量元素(NaMoO₄·2H₂O 0.25; CoCl₂·6H₂O 0.025; KI 0.75; MnSO₄·4H₂O 10; ZnSO₄·7H₂O 2.0; H₃BO₃ 3.0)；(3) Fe盐(CuSO₄·5H₂O 0.025; Na₂·EDTA 37.3; FeSO₄·7H₂O 27.8)；(4) 有机成分(VB₁10; VB₆ 1.0; 烟酸 1.0; 肌醇 100)。

方法和步骤：

(1). 丹参无菌苗的培养：取丹参种子，过40目筛后，挑选饱满结实的种子用于发芽实验。在超净工作台上用75%乙醇表面灭菌80s，用无菌水漂洗3-5次。其后含有0.1%Triton X-100(w/v)的4%NaClO(v/v)溶液80rpm水平振荡8min后立即用无菌水漂洗3-5次，至无泡沫残留。将上述表面消毒后的种子用无菌长柄镊接种于稀释一倍的MS(Duchefa Biochemie, cat.no. M0222)固体培养基（1%蔗糖，3%琼脂），然后移入22℃光照培养箱中萌发，每天16h光照。

2). 丹参毛状根的诱导、保种和继代：在超净工作台上，用无菌手术刀将丹参无菌苗分解为1cm²大小的叶片和1cm左右茎段、根部，将这些外植体浸入发根农杆菌YEB液体培养液（含100 mg/L利福平），共培养5分钟后将外植体上多余的菌液用无菌吸水纸吸干，转移到稀释一倍的 MS培养基，在生长箱中培养1-3天后转至含有100 mg/L利福平及500 mg/L头孢噻肟钠的稀释一倍的 MS MS固体培养基（1%蔗糖，3%琼脂）继续培养1-2周后在茎段、根段及叶盘切口周围长出转化毛状根。毛状根生长到2cm左右切下转入不含抗生素的稀释一倍的MS培养基，在39-40℃下培养48h，移到22℃左右常温培养。毛状根转入新鲜的6,7-V固体培养基上，22℃静置暗培养，每3-4周继代一次，备用。

(3).丹参毛状根的液体培养与脱落酸诱导：选取固体培养3-4周粗壮幼嫩的毛状根1.0 g接种到含有40ml 稀释一倍的Gamborg’s B5液体培养基的150 ml锥形瓶中，22℃，黑暗，120rpm水平振荡培养20天后接受脱落酸诱导处理。其方法是：将生长了20天的丹参毛状根转移入含有不同浓度（1 -100μmol/L）脱落酸的新鲜稀释一倍的 Gamborg B5液体培养基，120rpm，22℃黑暗振荡培养9天。以在不含脱落酸的稀释一倍的 Gamborg B5液体培养基培养9天的毛状根为对照。另外采用最大响应浓度 (5 μmol/L)的脱落酸处理生长了20天的丹参毛状根，在转速为120rpm的摇床上黑暗条件下培养1-9天，分别以不含脱落酸的稀释一倍的 Gamborg B5液体培养基培养相同天数的毛状根为对照(Ctrl)。

(4). 实验结果：丹参毛状根中丹参酮类成分的含量采用高效液相色谱法进行测定。色谱条件：Agilent 1100高效液相色谱仪；DAD检测器；Kinetex 2.6 μ C18 100 Å 100 mm × 4.60 mm色谱柱；检测波长：280 nm；流动相：A-1‰三氟乙酸水，B-乙腈；柱温：30℃；流速：1ml/min。采用梯度洗脱：A: 93% (0 min)至19% (36 min)；B： 7% (0 min) 至 81% (36 min)。样品处理：将丹参毛状根从培养液中取出，用蒸馏水冲洗2-3次，去除残余的培养基，于滤纸上吸干附着水分后冷冻干燥。在研钵中将干燥后的毛状根研磨成均匀细分。精密称取0.1 g丹参毛状根干粉于4 ml EP管中，加入2.5 ml 70%甲醇，超声提取20分钟，5000rpm离心10分钟，取上清液，加入5 ml容量瓶中。重复提取1次，合并上清液，定容至5 ml，0.22 μm 微孔滤膜过滤后备用。分析结果：如图 1 、图 2和图 3 所示。

实施例 2. 利用脱落酸诱导后生产的丹参毛状根制备丹参总酮提取物的方法

将上述利用脱落酸诱导培养获得的丹参毛状根，滤干培养液后，称取新鲜毛状根 500克，碾碎，用5-10倍样品量(重量比)的丙酮回流提取二次，每次各1.0小时，合并提取液，回收丙酮，浓缩液加5倍量去离子水稀释，抽滤澄清，滤液用 D101 大孔吸附树脂吸附，先用体积浓度为的 20-50%(与水体积比)乙醇或甲醇洗脱，收集 20-50%乙醇或甲醇洗脱液弃去，柱床再用体积浓度为40-95% (与水体积比)乙醇或甲醇洗脱，收集 40-95% 乙醇或甲醇洗脱部分，浓缩、冻干，即得丹参总酮提取物26.5克，得率 5.3%(提取物干重/毛状根鲜重)。

采用上述HPLC含量测定方法，测得提取物中二氢丹参酮Ⅰ (1) 17.7%、隐丹参酮(2)52.1%、丹参酮Ⅰ(3)4.9%和丹参酮IIA(4) 5.25%，四种丹参酮的含量总约为丹参酮总提取物的80.0%。

Claims

1. 一种提高丹参毛状根中丹参酮类活性成分产量的方法，其特征在于采用脱落酸处理悬浮培养的丹参毛状根提高丹参酮类成分产量，具体步骤为：将在6,7-V固体培养基上培养3-4周获得的丹参毛状根种株接种到Gamborg B5液体培养基中，20-30℃黑暗培养箱中用100-300 rpm水平振荡培养15-30天，然后转移到含有脱落酸的稀释一倍的Gamborg B5液体培养基中培养1-9天；所述脱落酸的浓度为1-100 μmol/L。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所用丹参毛状根是利用发根农杆菌C58C1诱导丹参无菌苗外植体产生丹参毛状根株系Sm031103。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述脱落酸的处理浓度为1-25μmol/L。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述丹参酮类成分包括丹参酮IIA、二氢丹参酮I、丹参酮I和隐丹参酮。

5. 由权利要求1所述方法得到的丹参酮类成分。

6. 由权利要求5所述的丹参酮类成分在制备丹参酮类提取物、单体化合物及各种丹参制剂中的应用。

7. 由权利要求5所述的丹参酮类成分作为天然色素在食品、药品及化妆品中的应用。