JPH02231090A

JPH02231090A - タンシノン類の製造方法

Info

Publication number: JPH02231090A
Application number: JP63065816A
Authority: JP
Inventors: Kouichirou Shimomura; 講一郎下村; Akira Yagi; 晟八木; Nobuyuki Okamura; 岡村　信幸
Original assignee: KOKURITSU EISEI SHIKENJIYOCHIYOU
Current assignee: KOKURITSU EISEI SHIKENJIYOCHIYOU
Priority date: 1988-03-22
Filing date: 1988-03-22
Publication date: 1990-09-13
Anticipated expiration: 2010-06-05
Also published as: JPH0751073B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔従来の技術〕タンジンＳａｌｖｉａ　ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａの根
の乾燥品は漢薬「丹参」であり、漢方において血行改善
剤として狭心症、心筋梗塞の治療に利用されてきた。

その有効成分としてタンシノン頚のクリブトタンシノン
（ｃｒｙｐｔｏｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ）が知られている
〔化学の領域　（１９８１）．　３５．　４９４−Ｓｏ
ｌ）。一方、　我々ｉ．ｔ虚血性心疾患病態モデル（摘
出心臓に対する血液遮断と低酸素負荷）を用いて丹参の
成分検索を行った結果、タンシノン類、特にタンシノン
Ｉ　（ｔａｎ−　ｓｈｉｎｏｎｅ　Ｉ）が再正常時の心
筋収縮回復の促進、冠状動脈血管の拡張及びＡＴＰ代謝
産物の遊離抑制等の有意義な対虚血性心疾患的薬理作用
を有することを見いだしている〔八木ら、日本生薬学会
（＋９８７）大阪〕．このような作用を持っタンシノン
類は、化学構造が複雑であるため、合成法により製造す
ることは困難であり、本植物を原料として抽出法により
タンシノン類を製造することは、本植物の栽培が天候に
左右されたり、年月を要するので、本化合物類を栽培に
よっての工業的に生産収得することは困難である。その
ため植物組織培養により生産する研究が行われている。

今回、我々は不定根．の分化誘導またはＲｉプラスミド
にょる毛状根を培養することにより、容易に有効成分を
製造することに特徴を見いだした．〔本発明の目的〕本発明はタンジン（Ｓａｌｖｉａ　ｍｉｌｔｉｏｒｈｉ
ｚａ）が生合成する生理活性物質及び薬用成分であるタ
ンシノン類を、本植物の葉、茎、葉柄あるいは根より誘
導した不定根あるいは毛状根を培養して効率的に製造す
る方法に関するものである．したがって、本発明はタンジンの組織を効率よく培養し
て、タンシノン類を効率的に簡易な方法により製造する
方法を提供することを目的とする．〔問題を解決するた
めの手段〕本発明は、タンジンの組織培養を行いタンシノン頚を生
産するにあたり、（１）ホルモンの種類と濃度を変えて
不定根を誘導、培養、あるいは、（２）アグロバクテリ
ウム・リゾジエネスを感染させ、生えてきた毛状根を培
養すると、親植物が生合成すると同様なタンシノン類を
生産させることができるとの知見に基づいてなされたも
のである。

すなわち、本発明は、タンジンの不定根組織、あるいは
、アグロバクテリウム・リゾジエネスが保持するＲｉブ
ラスミドにより形質転換し、生じた毛状根を培養してそ
れらが生産するタンシノン類をａｍ及び培地より抽出す
ることを特徴とするタンシノン類の製造方法を提供する
。

（１）不定根の誘導は以下の方法で行う。

材料としては、タンジンの葉、茎、葉柄等のいずれも使
用してよい。これらは、予め例えば７５％エタノールで
消毒し、２％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に１０分間浸
し、滅菌水で洗浄するなどの殺菌をしておくことが必要
である。また、茎頂培養や種子より無菌植物を培養し、
これらを使用することもできる．茎や葉柄では５ｍｍ長
さ、葉では５ｍｍ角に母植物を切りわけ、例えばＭｕｒ
ａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ　（ＭＳ）の固型培地あるい
は液体培地（ＭＳ，　８５）に植え付けて不定根を誘導
する。

（２）毛状根の誘導は以下の方法で行う。

滅菌した、あるいは植物の葉・茎・根などにアグロバク
テリウム・リゾジエネスを接種すると、感染部域から毛
状根が発生する．この根は、アグロバクテリウム・リゾ
ジエネス（Ｒｉブラスミド）の遺伝子の一部が植物の遺
伝子に組み込まれることにより発生し、通常の親植物の
根に比較して生胃が非常に速く、または二次代謝産物の
生産量が同等かそれ以上であることが知られている。

本植物に毛状根を誘起させるために利用できるアグロバ
クテリウム・リゾジエネス菌としては、＋５８３４，　
Ａ４株などがあげられる。タンジンの葉、茎、根などに
ＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡを導入し形質転換させた毛
状根を得る方法としては、植物個体への直接接種法、葉
切片や茎切片を用いた共存培養法（リーフ・ディスク）
、植物体のプロトブラストを利用した共存培養法、植物
体のブロトブラストとアグロバクテリウム・リゾジエネ
スのスフエロプラストとの細胞融合法、アグロバクテリ
ウム・リゾジエネス菌のＲｔブラスミドまたはその一部
のＴ−ＤＮＡをマイクロインジエクションなどの方法で
直接細胞内に注入する方法がある。アグロバクテリウム
・リゾジエネス菌を用いてＲ１プラスミド導入した場合
は、本菌の除苗が必要である。その方法としては、抗生
物質処理、高温処理（４０℃）および毛状根先端部の早
いサイクルでの植え継ぎなどの方法がある．以上の方法により得られた不定根絹織及び毛状根の培養
方法としては下記のものが有効である．用いる基本培地
と種類：１．ムラシゲスクーグ培地２．ギャンボルグ培地３．ニッチニッチ培地４．ホワイト培地などが例示され、通常のマクロ元紫、ミクロ元素、糖、
アミノ酸類及びビタミン類を含む固型または液体培地が
使用できる．培養の方法：静置培養、振盪培Ｎ（ロータリーレシブロ
〉、回転培養及びタンク等を用いた大量培養が例示できる．以上のように、植物の鞘織培養に使用できるものく器官
、カルス、細胞）は、そのままあるいは成分の一部を変
更して使用できる．炭素源としては、しょ糖及び他の炭水化物、その誘導体
、脂肪酸等の有機酸、エタノール等の１級アルコール等
が例示される．植物ホルモン類には、インドール酢酸（１＾Ａ）、イン
ドール酪酸（　ｌ　ＢＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
、ｐ−クロロフェノキシ酪酸、２．４−ジクロロフェノ
キシ酢酸（２．４−Ｄ）などのオーキシン類、カイネチ
ン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン、ベンジルアデニンな
どのサイトカイニン類が例示される．ビタミン類は、チ
アミン（ビタミンＢｌ）、ビリドキシン（ビタミンＢ６
），ビオチン、アスコルビン酸（ビタミンＣ）．ニコチ
ン酸、イノシトールなどが例示される．アミノｍ類は、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、
アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、アラ。ニ
ン、フエニールアラニンなどが例示される．固形及び液体培地の成分の濃度は、広い範囲で変えるこ
とができる．通常は、無機成分を約０．ＩＢ　Ｍ　−　
　１００ｍ　Ｍ．炭素源を約１％−ｌθ％、植物ホルモ
ン類を約０μＭ−ｔｏｏμＭ１　　ビタミン類及びアミ
ノ酸類をそれぞれ約０．１ｍｇ／Ｌ−５００ｍｇ／Ｌ程
度とすることができる．不定根及び毛状根の植え付け量は、広い範囲で変え鴫こ
とができる．通常、不ｔ根あるいは毛状根を用いる場合
、それぞれ固型培地では約１−３ｃｍあるいは約１−５
　ｃｍ、液体培地では５０ｍｌの培地に対して約１０ｍ
ｇ−約１　ｇ，　約１ｍｇ一約１ｇ（新鮮重量）を植え
付けることが望ましい．不定根及び毛状根の培養は、光は必須ではなく、通常、
暗黒で培養できる．培養温度は、約５−３５℃、望まし
くは約２２−２８℃が適している．不定根あるいは毛状
根が成育したところでこれらのＭ織及び培地を回収して
クロロホルムなどの有機溶媒を用いて目的のタンシノン
類を抽出する．〔発明の効果〕本発明によれば、タンジンよりタンシノン　１、タンシ
ノン１１、ジヒドロタンシノン、クリブトタンシノンな
どのタンシノン類を簡易な方法で製造することができる
．そして、もとの植物自体が生合成する物質と同様の生
産物を培地から回収することも可能で、また、培養条件
を変えることにより目的とする物質の生産量を上げるこ
ともできる．実施例により本発明を説明する．実施例タンジン（Ｓａｌｖｉａ　ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）
の茎頂部を７５！エタノールついで滅曹水で処理して、
ＩＯＸ次亜塩素酸ナトリウム水溶液にｌＯ分間浸し、次
いで滅菌水で３回洗浄した後、茎頂部を約２　ｍ　ｍに
切断し、インドール酢酸０．５ｍｇ／Ｌおよびカイネチ
ンｌＩＩｇ／Ｌになるように添加したムラシゲ・スクー
グ［Ｍｕｒａｓｈ　ｉ　ｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）］の
固型培地に置床し、２５℃、１６時間照明下で８週間培
養する．（ｌ）茎頂培養により得られた茎葉を頂芽及び
節（　ｌｃｍ長）に切り分け、ホルモン無添加ＭＳ培地
で培養しＷ＃菌植物を増殖する．得られた無菌植物の葉
柄を約５ｍｍ長さに調整し、種々の濃度のオーキシン類
及びサイトカイニン類を添加したＭＳ、ギャンボルグＢ
５　（Ｂ５）培地に植え付け、４−８週間、２５℃、暗
黒下で培養し不定根を誘導する．得られた不定根の一部
は誘導した同一の固型及び液体培地に継代培養する．（
２）毛状根は無Ｍｕ物の茎、葉及び葉柄などにＷＥＢ培
地で培養したＲｉブラスミドを保持するアグロバクテリ
ウム・リゾジェネス１１（＾ＴＣＣ　１５８３４）を接
種した．２−８週間後に誘起されてきた毛状根をクラフ
オラン０．５３／Ｌを含むＭＳ固型培地に移植し、１−
２週間の間隔で同一組成培地に２−３回この操作を行っ
て除菌した．毛状根の一部を前記ホルモン無添坤のＭＳ
固型及び液体培地に移植し培養した．不定根及び毛状根
の液体培養は、２５℃、暗黒で振盪培ｌＩ（ロータリー
回転数１００回７分）した．４−８週間培養後、生育した不定根あるいは毛状根と培
地を回収して培養物の生育量（新鮮重量及び乾物重量）
の測定を行った．タンシノン類の抽出には、不定根及び
毛状根は、凍結乾燥した．液体培養したものは、まず、
濾過して固型物と培地に分け、固型物は凍結乾燥した．
液体培地及び屹燥した検体はクロロホルム抽出を行い、
これを減圧濃縮し高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）でタンシノン類の定量を行った。カラムはＴＳＫ３
ｅｌ　Ｓｉｌｉｃａ　１５０　５μ３ｍｍ　ｘ２５ｃｍ
　　（東ソー製）、溶離液は８　　ｖ／ｖ％ジオキサン
　ヘキサン混液、検出波長は２６０１ｍを用いた．タン
シノン類のＨＰＬＣでの分離は図１に示す．不定根培養における不定根の形成数は、使用したホルモ
ンにより差があるが約１０−１００本であった．一例を
示せば、ＩＡＡ　ｌｍｇ／Ｌ添加ＭＳ培地では平均約４
０本、新鮮重量は約０．９ｇであった．また、含量はタ
ンシノンｔ　：　Ｏ．Ｑｌ３χ（乾物重量当り）であり
、他のＭＳ及びＢ５固型培地におけるタンシノン類の含
量は表１に示す．　ＭＳ及びＢ５液体培地においては、
生育は約１・２ｇ（新鮮［１であり、タンシノン頚の生
産は表２に示す通りで、例えばタンシノンＩは不定根：
　０．０１３−０．０６８１，　　培地中：　０．０１
３−０．６５５ｎｍｏｌ／１００ｍｌ三角フラスコであ
った。

毛状根は形質転換していることを、高圧ろ紙電気泳動で
杉質転換細胞が特異的に生産するオパインであるアグロ
ビン及びマンノビンを検出し確認した．　ＭＳ固型培地
で培養している毛状根約＋ｏｏｍｇをＭＳ液体培地に植
え付ζナて８週間培養した。生育した毛状根は約１−４
ｇ　（新鮮重量）であフた．その時の毛状根及び培地中
のタンシノン類の含量及び圃場栽培株である１年主根及
′Ｕ２年生根の含量を表３に示す．表１ｌＩｉ型培地表２　液体培養表３　毛牡混及び比較例ａ》カイネチンｂ〉ペンジルアデニン１：Ｉ１Ｋ跡図１．ＨＰＬＣでのタンシノン類の分離手続補正書（方式）１，事件の表示昭和６３年特許願第６５８１６号２．発明の名称タンシノン類の製造方法１．明細書第１２ページ第８行の後に次の文章を加入す
る．（内容に変更なし）「４．

【図面の簡単な説明】

図１はタンシノン類のＨＰＬＣでの分離状態を表す図で
ある．」

Claims

【特許請求の範囲】

（１）シソ科植物であるタンジンの切片を培養し不定根
を分化誘導せしめるタンシノン類の製造法。
（２）アグロバクテリウム・リゾゲネスが保持するＲｉ
プラスミドにより形質転換し誘起された毛状根を培養す
る特許請求の範囲第１項記載のタンシノン類の製造法。
（３）特許請求の範囲第１項および第２項の培地中に分
泌されたタンシノン類の製造方法。
（４）固形培地、液体培地を用いて不定根及び毛状根を
培養する特許請求の範囲第１項および第２項記載のタン
シノン類の製造法。