JPS62205792A - アルカロイドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ナス科植物が生合成する生理活性物質及び薬
用成分でもあるアルカロイド、特にトロパンアルカロイ
ドを、ナス科植物の毛状根を培養して効率的に製造する
方法に関するものである。

〔従来の技術〕

植物の細胞・組織培養法によるｊｆＬ物の二次代謝物の
工業的生産法としては、従来から囚細胞・カルスなどの
未分化の組織を培養する方法及びｆＢｌ根、葉などの器
官を培養する方法が行なわれている。

しかしながら囚の方法によると、次にあげる問題がある
。

（１）　　選抜して得た高生産株の特性が継代培養中に
失われ易い。

ｆｉｉｌ　　生産物質が目的とするもとの植物が作る物
質と多少異なることがある。

（ｉｉｉｌ　　安全性上問題がある生長調節物質を培養
に使う必要があるため、生産される作用物質に安全性上
の問題がある。

Ｇｖ）　　細胞中に目的物質が蓄積されるので、細胞を
破壊して抽出する必要があり、このため細胞中の他の成
分との分離にコストがかかる。

これに対して、上記［Ｂｌの方法には、（Ｂ−１）：イ
ンビトロで増殖させた芽や根を用いる方法および（Ｂ−
２）：毛根病菌アグロバクテリウム・リゾジェネス（八
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）　
　を接種し、生えてきた毛状根を培養する方法がある。

このうち、（Ｂ−２）の方法は、次の原理に基づくもの
である。すなわち、アグロバクテリウム・リソジェネス
を植物の茎・葉・根などに接種すると、感染部位から毛
状根と呼ばれる根が発生する。

この根は、リゾジェネス中に存在する巨大プラスミド（
Ｒｉプラスミド）の遺伝子の一部が植物の遺（公子に組
み込まれることにより発生し、通常の根に比べて生育が
非常に速く又二次代謝物の生産攪が同等以上であること
が知られている。そこで（Ｂ−２）の方法は、この性質
を利用して、根にａ用物質を含む植物にアグロバクテリ
ウム・リゾジェネスを接種し、発生した毛状根を切り出
してタンクなどの装置で培養し、増殖させた毛状根を破
壊して有用物質を取り出す方法であり、天然物の製造法
として注目され、一部の植物で実用化が検討されている
。

しかしながら、（Ｂ−１）の方法によれば、上記ｆｉｌ
　ｆｉｉｌの問題がなく、又（Ｂ−２）の方法によれば
、［ｉｌ聞及びｆｉｉｉｌの問題はないものの、（Ｂ−
１）及び（Ｂ−２）の方法とも、細胞を破壊して細胞中
に蓄積された目的物質を取り出しているため、細胞成分
と目的物質との分離が煩雑であり、コストアップになる
という欠点があり、又増殖する植物器官を連続的に取り
出すことが困難であるために、バッチ方式による生産し
か行なうことができないという欠点がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、本発明は、植物が生産するアルカロイドを簡易
な方法で、かつ連続的に製造する方法を提供することを
目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、各種植物のうち、特にナス科植物にアグロバ
クテリウム・リゾジェネスを感染させ、生えてきた毛状
根を培養すると、生産したアルカロイドを毛状根の細胞
内に蓄積し、外部には放出しないとの常識に反し、該毛
状根は、生産したアルカロイドを培地中に分泌するとの
知見に基づいてなされたものである。

すなわち、本発明は、ナス科植物細胞をアグロバクテリ
ウム・リゾゲネスが保持するＲｉプラスミドにより形質
転換し、生じた毛状根を培養して該毛状根が培地中に分
泌するアルカロイドを抽出することを特徴とするアルカ
ロイドの製造方法を提供する。

本発明で処理の対象とされるのは、ナス科植物であり、
本発明では処理対象をこのように限定したことが特に重
要である。すなわち、ナス科植物の毛状根によればアル
カロイドが培地中へ分泌されるからである。本発明では
任意のナス科植物が用いられるが、アトローパ属植吻、
ダツラ属植物、ヒヨスチアムス属植物、スコポリア属植
物の群から選ばれるものを用いるのが好ましい。

これらの植物に毛状根を作らせるために利用できること
をアグロバクテリウム・リゾジェネス菌としては、 アグロバクテリウム・リゾジェネス　２５８１８アグロ
バクテリウム・リゾジェネス　１５８３４アグロバクテ
リウム・リゾジェネス　８１９６アグロバクテリウム・
リゾジェネス　　へ４などがあげられる。また大腸菌な
どの他の菌にＲｉプラスミドまたはその一部のＴ−ＤＮ
Ａを遺伝子導入した菌も使用できる。

本発明により植物をアグロバクテリウム・リゾジェネス
菌で処理すると、リゾジェネス菌中のＲｉプラスミドの
一部（Ｔ−ＤＮＡ）が植物細胞の核Ｄ　Ｎ　Ａの中に導
入（形質転換）される。

前記ナス科植物の茎・根・菜などにＲｉプラスミドＴ−
ＤＮＡを導入し形質転換させた毛状根を辱る方法として
は、例えば、次の方法があげられる。

１、　植物個体への直接接種法 ２、　葉片を用いたリーフディスク法（Ｌ、　Ｃｏｍａ
ｉ　ｅｔａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１７　、７４１
　（１９８５）　）３、　植物体のプロトプラストを利
用した共存培養法（Ｚ、　Ｍ、　Ｗｅｉ　ｅｔ　ａｔ、
、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐ、、　１ｎｐｒｅｓ
ｓ　　（１９８６）　） ４、　植物体のプロトプラストとアグロバクテリウム・
リゾジェネスのスフ二〇プラスト法（Ｒ。

１１ａｉｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｐｌａｎｔ　　Ｃ
ｅ１ｌ　　Ｒｅｐｏ、　　　３　　、　５　　Ｑ５、　
アグロバクテリウム・リゾジェネス菌のＲｉプラスミド
またはその一部のＴ−ＤＮＡをマイクロインジェクショ
ンなどの方法で直接細胞内に注入する方法 Ｒｉプラスミドを上記１〜４の方法で導入した場合は、
その後アグロバクテリウム・リゾジェネス閑の除菌処理
が必要で、その方法としては下記のものがある。

○　高温処理（４０℃） ○　抗生物質処理 ■　毛状根先端部の早いサイクルでの植え継ぎ以上の方
法により碍られた毛状根の培養方法としては下記のもの
が有効である。

培地の種類：１．液体培地　２．カンテンなどを用いた
固型培地 培養の方法：１．静置培養　２．振とう培養（ロータリ
ー、レシプロ）３０回転培養 ４、タンクを用いた大造培養 用いる基本培地二通常のマクロ元素、ミクロ元素、糖及
びビタミンを含む寒天又 は液体培地が使用できる。具体的 には、次の培地が例示される。

１、ムラシゲ・スクーグ培地 ２、ギャンボルグ培地 ３、ニッチ・ニッチ培地 ４、ホワイト培地 以上のように、植物の器官・カルス・細胞などの培養に
使用できるものは、そのままあるいはＪｊ：と分の一部
を変更して使用できる。培地には炭素・原として糖を加
える必要があり、シュークロース、グルコース、フルク
トース、マルトースナト力、０．１〜３０％の濃度で使
われる。毛状根は成長が著しく早いので、植物の生長調
節物質とじて使われる天然および合成の植物ホルモンは
不要である。

毛状根が適当に生育したところで培地の一部を連続的に
新しいものと交換し古い培地を集めるか、毛状根が十分
生育したところで培地をすべて回収するかのどちらかの
方法で培地を集め、クロロホルムなどを用いて目的のア
ルカロイドを抽出する。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ナス科植物からアトロピン、スコポラ
ミン（ヒヨスチン）、ｌ−ヒヨスチアミンなどのトロパ
ン系アルカロイドを簡易な手段により工業的に生産する
ことができる。そして、本発明によれば、 （１）選抜して得た高生産株の特性が継代培養中に失わ
れにくい。

（２）　　もとの植物がつくる物質と同じ生産物を継続
的に得ることができる。

（３）　　安全性の問題がある生長調節剤を使用する必
要がない。

（４）細胞、つまり毛状根を破壊する必要がないので細
胞中の他成分との分離が不必要である。

（５）　　培地を連続的に取り出すことができるので、
連続生産方式を採用することができる。

という利点がある。

次に実施例により本発明を説明する。

実施例 種子を次亜塩素酸ナトリウム溶液などの殺菌剤で滅菌し
た後、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳと略す）の固型培地上
に播種し、発芽した無菌植物あるいは茎頂培養により得
られた無菌植物の茎、葉部などにＲｉプラスミドを保持
するアグロバクテリウム・リゾジェネス菌を接種した。

２〜５週間後に接種部位から発生した毛状根を切り取り
、カルベニシリンＩｇ／ｌまたはクラホラン０．５　ｇ
　／　１を含むＭＳ固型培地上に移植し、１〜２週間で
同じ組成の新しい培地に移植した。

２〜３回この操作を繰り返して除菌した毛状根の小遣を
ＭＳ液体培地に無菌的に移し、振とう培養（ロータリー
回転数１００回／分、２５℃、暗所）した。

培養後１週間〜４ケ月目に培地を回収し、アルカロイド
の抽出を行った。まず、ろ過して固型物を除いた後、硫
酸酸性（ｐＨ２）でクロロホルム抽出を行い、水層を分
取した。次にアンモニアアルカリ性（ｐＨ１０）にして
からクロロホルム抽出を行った。そして、クロロホルム
層を無水硫酸ナトリウムで脱水処理した後、蒸発乾固さ
せアルカロイドを碍た。

アルカロイドの定潰は、高速液体クロマトグラフィーで
行った。カラムはＴＳＫｇｅｌＯＤＳ−１２０Ｔ（東洋
四速社製）、溶離液はメタノールと１−へプクンスルホ
ン酸ナトリウム水溶液との混合液（４８：５２）、検出
波長は２１５ｎｍを用いた。結果を表−１に示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ナス科植物細胞をアグロバクテリウム・リゾゲネ
   スが保持するＲｉプラスミドにより形質転換し、生じた
   毛状根を培養して、該毛状根が培地中に分泌するアルカ
   ロイドを抽出することを特徴とするアルカロイドの製造
   方法。
2. （２）ナス科植物が、アトローパ属植物、ダツラ属植物
   、ヒヨスチアムス属植物、スコポリア属植物の群から選
   ばれる特許請求の範囲第（１）項記載の製造方法。