JPH0223880A - リンドウ科植物苦味成分の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、リンドウ科植物たとえばスェルチア属植物お
よびゲンチアナ属植物が生合成する生理活性物質及び薬
用成分でもあるセコイリドイド配糖体を、該植物の形質
転換細胞である毛状根を培養することによって、効率的
に製造する方法に関するものである。

（従来の技術） リンドウ科たとえばスェルチア属植物及びゲンチアナ属
植物は全草に苦味成分であるスェルチアマリン、ゲンチ
オビクロサイド、スエロサイド、アマロゲンチン等のセ
コイリドイド配糖体を含有し、健胃薬、養毛剤等に広く
利用されている。

しかしながら、播種から収穫までにスェルチア属植物で
は２年、ゲンチアナ属植物では４年収にの朋間を要し、
病虫害防除等の裁培管理も困難である。また、その生産
量は自然環境や天候に左右される等の問題点があり、そ
の安定した供給が望まれている。

これに対し、スェルチア属植物の細胞を培養することに
よってスェルチアマリン等の苦味配糖体を生産する試み
がなされたが、この培養細胞中には苦味配糖体は存在し
なかった（三浦他　生薬学雑誌　３２　（２１９０−９
５、１９７８）。

一方、Ｒｉプラスミドによる形質転換体である毛状根を
培養して、薬用植物に含まれる有用物質を生産する技術
が知られているが、リンドウ科植物においては、アグロ
バクテリウム菌の感染に好適な状態の無菌植物を得るの
が困難なため、これまでに毛状根による苦味成分の生産
に関する報告はない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、リンドウ科植物をＲ１プラスミドによって形
質転換し、生した高増殖性毛状根を培養することにより
、生産効率の高い苦味配糖体の製造方法を提供すること
を目的としている。

（課題を解決するための手段） 本発明は、リンドウ科植物細胞をアグロバクテリウム属
細菌が保持するＲｉプラスミドにより形質転換し、生じ
た毛状根を培養して、該毛状根が産生するセコイリドイ
ド配糖体を取り出すことを特徴とするセコイリドイド配
糖体の製造方法である。

本発明で取り扱う微生物は、それ自体公知であるアグロ
バクテリウム属に属する細菌であり、特に限られるもの
ではなく、例えばアグロバクテリウム１リゾジエネス（
Ａ　ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＊　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ
ｓ）ＡＴＣＣＩ５８３４．　　Ａ４．　８１９６．　１
８５５゜ＡＴＣＣｌｌ３２５．　　Ｋｅｒｒ３８．　　
ＴＲ１０５ＴＲ７，ＴＲｌ０Ｉ、アグロバクテリウム・
ツメファシェンス（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　　
Ｒ１０００ＴＭＲ３３８，ｐＲｉ２６５５．ｐＲｉ２６
５７゜ｐＲｉ２６５９等が挙げられる。

本発明が適用されるリンドウ科植物としては、スェルチ
ア属に属する植物であるスェルチア・ジャポニカ（Ｓ　
ｗｅｒｔｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ　）スェルチア・プソ
イドキネンシス（Ｓ　ｗｅｒｔｉａ　　ｐｓｅｕｄｏｃ
ｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ゲンチアナ属に属するゲンチアナ
・ルテア（Ｇｅｎｔｉａｎａ　１ｕｔｅａ）、ゲンチア
ナ・トリフローラ（Ｇ　、　ｔｒｉｆｌｏｒａ）　、ハ
レニア属に属Ｖるハレニア・コルニキュラータ（ｔ（ａ
ｌｅｎｉａ　ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔａ）等が挙げられる
。

本発明において、リンドウ科植物遺伝子にアグロバクテ
リウム属に属する細菌に保持されるＲｉプラスミド断片
を導入するには、下記の、該菌を植物へ感染させる方法
等が考えられる。これらの方法はすでに公知であるが、
リンドウ科植物たとえばスェルチア属植物及びゲンチア
ナ属植物は感染に好適な状態の無菌植物体を作製するの
が困難なためか、これまでに該植物の形質転換細胞は得
られていない。

更に、該植物細胞に、Ｒｉプラスミド断片により形質転
換し、得られた形質転換細胞がセコイリドイド配糖体生
産能を有することについては、本発明者らが初めて見出
した知見である。

リンドウ科植物の無菌植物体を作製する方法は、該植物
体より頂芽または茎節部を切り取り、次亜塩素酸ナトリ
ウム等の溶液を用いて常法により無菌植物体を作製する
か、又は植物ホルモンを含む培地上で培養する方法が好
ましい。使用される培地は植物組織培養において通常使
用されるものであれば使用可能であり、特に限定される
ものではなく、たとえばＭ　ｕｒａｓｈｉｇｅ　−Ｓ　
ｋｏｏｇ等の植物Ｍｉ織培養に用いる通常の培地に３％
程度の糖類を添加し、植物ホルモンであるサイトカイニ
ンとオーキシンを適当に組み合わせて添加したものであ
るが、植物ホルモンは添加しなくてもよい。

培養開始後、２週間程度で新たな茎葉の伸長が見られる
が、組織が水浸状になり感染の材料として不適当なもの
が多い。このなかで正常な状態に近いものを選抜・継代
することにより感染に好適な正常な無菌植物体が得られ
る。

次に、植物組織に細菌を接種するには前記細菌を有柄針
等に付着させ植物組織に突き刺す方法、植物組織に傷を
付けそこに細菌を塗布もしくは細菌Ｉす濁液を滴下もし
くは噴霧する方法、或いは、細菌含有液体中に植物組織
を浸漬する方法等がある。植物組織に細菌を接種した後
、適当な培地を用いてこの植物Ｍｉ織を２５℃〜３０℃
好ましくは暗所下で放胃後、１〜６週間程度で毛状根が
発生ずる。

細菌を接種した後の植物Ｍｉ織の培養に使用される培地
は、植物Ｍｉ織培養において通常使用されるものであれ
ば適用可能であり、特に限定されるものではない。例え
ば、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　−Ｓ　ｋｏｏｇ或いは、Ｗｈ
ｉｌｅの培地である。培地には３％程度の糖類を添加す
るが、植物ホルモンは添加しな（でも良い。

上記の方法により得られた毛状根は、生長点を含む先端
部を切り出し、２５℃〜３５℃、好ましくは暗所で培養
する操作を繰り返す方法や、抗生物質を含む培地に、切
り出した毛状根を置き２５℃〜３０℃好ましくは暗所で
培養する方法等により、無菌状態とすることができる。

無菌状態になった毛状根の中で、増殖速度の大きいもの
及び分枝数の多いものを選抜する。

このようにして選抜した高増殖性の毛状根が、Ｒｉプラ
スミド断片の導入によって形質転換したものであるかど
うかは、次の方法によって確認できる。

１００ｍｇ程度の毛状根を破砕し、遠心分離等の操作に
より上澄液をサンプルとして得る。サンプルはアグロビ
ン、マンノビンとならべて濾紙に滴下し、ギ酸：酢酸：
水をｌ：３：１６（ｖ：ｖ；ｖ）等を泳動用緩衝液とし
て用い、濾紙１ｃｍあたり５〜ＩＯＶの電圧をかけて濾
紙電気泳動する。電気泳動後の濾紙をアルカリ性硝酸銀
試薬を用いる反応により、サンプル中のアグロピン、マ
ンノビンヲ４１１　出する。アグロピン　マンノビンは
昔通の植物組織には存在しないが、Ｒｉプラスミド断片
の導入により形質転換した植物Ｍｉ織で特異的に産生さ
れるアミノ酸である。これらの物質の存在の有無により
、形質転換した植物Ｍｉ織か否かを確認することができ
る。

このようにして選抜された毛状根を更に２５℃〜３０℃
好ましくは暗所で培養する事により、大量に増殖させる
ことが可能である。毛状根を大量に増殖させるための培
地は、植物組織培養に通常使用されるものであれば使用
可能であり、特に限定されるものではなく、例えばＭ　
ｕｒａｓｈｉｇｅＳ　ｋｏｏｇ或いはＷｈｉｔｅの培地
である。培地には３％程度の糖類を添加するが、植物ホ
ルモンは添加しなくても良い。

培養終了後の毛状根からはエタノール、水等の抽出溶媒
によってスェルチアマリン、ゲンチオピクロサイド等の
セコイリドイド配零唐体を回収することができる。

（実施例） 以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明すルカ、こ
れば、本発明を限定するものではない。

また、培地はすべて１２０℃で１５分間滅閉じて使用し
た。

実施例−１ センブリ　（Ｓ　ｗｅｒｔｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）の
茎の節部を１％次亜塩素酸ナトリウム溶液などの殺菌剤
で滅菌し、無菌水で洗浄した後０．２％ジェランガムで
固形化したＭ　ｕｒａｓｈｉｇｅ　−Ｓ　ｋｏｏｇ培地
（Ｓ　ｕｃｒｏｓｅ　　３％添加）に植え込んだ。得ら
れた無菌植物体の中から正常な個体を選抜し、この茎部
に有柄針を用いてＲｉプラスミドを保持するアグロバク
テリウム・リゾジェネス（ＡＴＣＣ１５８３４）菌を接
種した。

２〜４週間後に接種部位から発生した毛状根を切り取り
、０．２％のジェランガムで固形化したＲ　ｏｏｔ　Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ　　Ｍ　ｅｄｉｕｓ　　（以下ＲＣ培地と
略記）上に置き３５℃で培養した。１週間毎に４〜８回
、毛状根の先端部を切り取り新しいＲＣ培地に移す操作
を繰り返すことによって、除菌された毛状根を得た。

除菌された毛状根を固形ＲＣ培地に植え込み、２５℃暗
条件下で４週間培養を行なった。

ＩＯ養終了後の毛状根は秤量したのち凍結乾燥した。乾
燥後ふたたび秤量してから乳鉢ですりつぶし粉末にした
。次に、この粉末を２０倍蟹のエチルアルコールで抽出
し、ロータリーエバポレーターでｔ；縮したものを、苦
味成分定量のための試料とした。

苦味成分の定量は、高速液体クロマトグラフィ（カラム
；ＴＳＫｇｅｌＯＤＳ８０ＴＭカラム、ン容媒　；　ｌ
　２　％　ア　セ　ト　ニ　ト　リ　ル水？容　ン夜　
、　流速°０．８ｍ　ｌ　／　ｍ　ｉ　ｎ　、　構出波
長；２３８ｎｍ）によって行なった。この結果を表１に
示す（表中のカルスのスェルチアマリン含有率は従来技
術である三浦他・生薬学Ｍ誌３２　ｆ２）　９０−９５
　、　１９７８による。）。

表１ センブリの毛状根及びカルスのスェルチアマリンの含有
率 カルス 毛状ｆｉｔ　　　　３７ ０．０２ 実施例−２ センブリ（Ｓ　ｗｅｒｔｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）の茎
の節部を材料として、実施例−１と同様の方法で無菌植
物体を得た。この茎の頂部を切除し、この切り口にアグ
ロバクテリウム・リゾジェネス（Ａ４）菌を塗布した。

２〜４週間後に接種部位から発生した毛状根を切り取り
、固形ＲＣ培地上に植え込んだ。１週間ごとに新しい培
地に植え次ぐことによって、除菌された毛状根を得た。

１００ｍｌの三角フラスコに液体ＲＣ培地を５０ｍ１入
れ、この培地に上記毛状ｍ　ｔ　ＯＯｍ　ｇを入れ２５
℃で４週間、回転振盪墳！（８０回転／分）した、培養
終了後の毛状根は秤量したのち凍結乾燥し実施例−１と
同様の方法で苦味成分の定量を行った。

′この結果、フラスコ１本あたり平均１グラムの毛状根
乾燥物が得られ（増殖率；　１００倍／４週）、これに
含まれるスェルチアマリンは約１ミリグラム（含有率０
．０８％）であった。

（発明の効果） 本発明によれば、リンドウ科植物の形質転換細胞培養に
よりセコイ・リドイド配塘体を効率的に製造することが
できるので、本発明の方法はセコイリドイド配糖体の工
業的製造方法として掻めて好適である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）リンドウ科植物細胞をアグロバクテリウム属細菌
   が保持するＲｉプラスミドにより形質転換し、生じた毛
   状根を培養して、該毛状根が産生するセコイリドイド配
   糖体を取り出すことを特徴とするセコイリドイド配糖体
   の製造方法。
2. （２）リンドウ科植物がスエルチア属植物、ゲンチアナ
   属植物の群から選ばれる請求項１記載の製造方法。