JPH03272682A - ゴマ毛状根の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、植物細胞を人工的に培養する方法に関し、よ
り詳しくは、ゴマ（Ｓｅｓａｓｕｍ　１ｎｄｉｃｕｓ　
Ｌ、）の細胞を形質転換し、前培養により得られる毛状
根を更に培養する方法に関する。

〔従来の技術〕

ゴマは、セサミン、セサモリン等の生理活性物質を含ん
でいることは従来知られており、このような生理活性物
質は、医薬・食品など幅広い用途を持っていることも知
られている。また、このような生理活性物質は、これま
で、ゴマ種子やゴマ種子より搾油して得られる、いわゆ
るゴマ油などから抽出されていた。

しかしながら、ゴマを栽培して種子を得、これから生理
活性物質を得る方法に代わり、例えば特開昭６３−２０
７３８０号公報で開示しているような、ゴマの植物体よ
りカルスを誘導し、このカルスを大量培養して生理活性
物質を生産する方法が知られているようになった。

植物細胞を人工的に培養する方法としては、カルスの培
養は広く知られているが、他の方法として、植物細胞を
形質転換させ、形質転換した細胞の自己増殖能力を利用
し、環境条件を整えて培養する方法がある。形質転換に
は、通常、アグロバクテリウム（ＡｇｒＯｂａｅｔｅｒ
ｉｕ耐属菌が用いられ、研究されている。このアグロバ
クテリウム属菌には、植物にクラウンゴールと呼ばれる
ガン種を誘起するＴｉプラスミドを有する菌と、植物に
毛状根を誘起するＲｉプラスミドを有する菌があること
が知られている。しかし、植物細胞を形質転換させるに
は、必ず、アグロバクテリウム属菌を植物個体に感染さ
せることが必要であり、感染しない場合は、植物細胞に
形質転換を引き起こせないことも知られている。このア
グロバクテリウム属菌の感染例は多数報告されているが
、植物全種に感染するわけではなく、未感染・未報告の
種も多数ある。ゴマをこの菌によって感染させたという
報告は本発明者らの知る限りではない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者らは、以下のような理由より、本発明を完成さ
せる研究に着手した。

すなわち、ゴマ植物を栽培する方法においては、広大な
面積と多大な労力を必要とし、加えて、天候により収穫
高が安定しないという欠点がある。

また、カルス培養による方法においては、安定した収量
は得られるものの、カルスの増殖スピードはさほど速く
なく、限りがある。さらに、培養に際して必ず添加しな
くてはならない成分とじて植物ホルモンがある。植物ホ
ルモンには、天然のままの形態では安定性を欠くものが
多いためか、合成によるものが通常主に用いられている
。これらの合成植物ホルモンには除草剤として用いられ
るものも多く、それ故、これらを用いた場合培養によっ
て得られるカルス細胞には不可避的にこれらの物質が含
まれており、よってこのようなカルス細胞から抽出して
得られる生理活性物質を食品・医薬などに使用するには
安全性の点で問題がある。

本発明者らは、以上のような点を深慮し、上記のような
欠点を有さない培養方法を確立することを目的として種
々検討をした際、形質転換技術の利用に着眼し、更に研
究を重ねたところ、形質転換によって得られた毛状根を
培養したものには、驚くべきことに、これまでゴマ細胞
自体やカルスでは全く知られていなかったような抗菌性
物質が含まれていることを発見し、本発明を完成するに
至った。

【課題を解決するための手段〕

すなわち、本発明は、ゴマ細胞を、Ｒｉプラスミドを保
持するアグロバクテリウム属菌により形質転換させ、前
培養により得られた毛状根を更に培養することを特徴と
するゴマ毛状根の培養方法を提供するものである。

ここでいうＲｉプラスミドを保持するアグロバクテリウ
ム属菌としては、例えばアグロバクテリウム０リゾゲネ
ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｌｕｓ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ
ｓ）が挙げられる。そのタイプ・菌株としては、例えば
、ＡＴＣＣ，１５８３４，１１３２５゜１３３３２．１
３３３３および２５８１８菌株の他、Ｉ　Ｆ　Ｏ（Ｊｎ
ｓｔｊｘｕｔｅ　Ｆｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　
０ｓａｋａ）の分類によれば、ＩＦ０１３２５７．１４
５５４゜１４５５５などの菌株がある（　ｒＬＩｓＴ　
ＯＦ　ＣＵＬＴＵ−ＲＥＳ」、第８版、１８１巻、第６
０頁（１９８８）参照）。

また、本発明において形質転換とは、Ａｇｒｏｂａｃ−
ｔｅｒｌｕ■菌体中に存在する巨大プラスミド（ｐＲｉ
）の一部が植物ゲノムＤＮＡ中に組み込まれ、この組み
込まれたＤＮＡ　（Ｔ−ＤＮＡ）上に存在する遺伝情報
により毛状根と呼ばれる特殊な形態をもつ腫瘍が誘起さ
れる現象を意味する（「組織培養」１３　（６）　、１
８４−１９２、（１９８７））。

以下、本発明の方法を更に具体的に説明する。

本発明を実施するには、まず、ゴマ種子の無菌発芽によ
り実生を得る必要がある。実生を得る方法としては、常
法によればよいが、その−例を以下説明する。

ゴマ種子をまず滅菌処理する。例えば７０％エチ／ｌ／
　７　／ｌ／　＝ｔ　−ルに約１分間浸漬し、次いで２
％の次亜塩素酸ナトリウム液に約２０分間浸漬した後、
別に用意した数個の滅菌水に順に浸漬して水洗する。無
菌状態確認のために、ショ糖を添加して固化した寒天上
に静置する。ショ糖の資化による菌の増殖が認められな
いことで無菌状態の確認ができる。この寒天を明所条件
の場所に配置して、発芽させる。発芽直後の実生に、後
述するような形質転換操作を直ちに行なってもよいが、
該操作のしやすい大きさに成長するまで次のような培養
の方法で更に成長させてもよい。

その際実生の成長用の培地としては、例えば、ＭＳ（ム
ラシゲ・スクーグ）培地、Ｗｈｉｔｅ（ホワイト）培地
等の一般的な植物組織培養用の栄養培地を一種あるいは
複数種組合せたものを用いればよい。なお、この栄養培
地は通常寒天やジュランガムなどの固化剤を用いて固化
して使用する。培養の方法は、特殊な方法ではなく、単
に実生を上記の培地上に移植・静置し、２５℃〜４０℃
および５００ルクス以上という条件に設定された室に１
〜４週間そのまま静置すればよい。

適度な大きさに実生が成長したならば、実生の根付茎の
いずれかの部分で切断し、得られた根付部分の方に次い
で形質転換操作を行なう。この場合の形質転換操作は、
この切断面に、別に培養しておいたＲｉプラスミドを保
持するアグロノくクテリウム属菌を塗布することにより
行えばよい。この際アグロバクテリウム属菌としては、
その培養方法に限定はないが、例えば前日に一般的な細
菌培養用の培地、例えばＹＥＢ培地（その−配合例を第
１表に示す）に植菌し、−昼夜培養したものを遠心分離
などにより濃縮して苗密度を高めたものを使用すればよ
い。アグロバクテリウム属菌の塗布を終えた実生は、そ
のまま、あるいは前述の実生の培養の場合と同じ条件の
別の培地へ移植して、１〜４週間、２５℃〜４０℃、暗
所条件の室に静置する。この培養期間の終了時には実生
の切断面には、無数の細かな発根（毛状根）が見られる
ようになる。この状態のまま培養を続けてもよいが、ゴ
マ本来の根との混同を避けるため、実生の発根部のみを
切除して、この発根部を別途用意した同一条件の培地へ
移し、上記と同一条件の室で更に１〜４週間静置する（
前培養）。

また、別な形質転換操作として、前述した方法により適
度な大きさに成長した実生を得、通常組織培養で使用す
る大きさ、例えば茎ならば５〜１０ｍｍ、葉ならば５〜
１０ｍｍ角程度に切断して得た切片を、予め前日にＹＥ
Ｂ培地などにＲｉプラスミドを保持するアグロバクテリ
ウム属菌を植菌して一昼夜培養しであるアグロバクテリ
ウム菌液中に２０分〜−昼夜、２５℃〜４０℃、暗所条
件で浸漬することにより行なう方法がある。浸漬後、好
ましくは無菌濾紙などで余分な菌液を除いたのち植物組
織培養用の栄養培地に移植し、２５℃〜４０℃、暗所条
件にて１〜４週間静置する。この培養期間の終了時には
切片の表面、特に切断面からの発根（毛状根）が見られ
るようになる。このものをそのまま、あるいは新しい同
一の培地に移植したのち同一条件で更に１〜４週間静置
する（前培養）。

上述したいずれの形質転換の場合でも発根部の静置培養
期間中における毛状根の成長は、カルスに比べてかなり
速く、温度条件によって多少異なるが、１日に７ｍ＋ｓ
ぐらいずつは伸長するのが観察される。

次いで、毛状根が適当な長さ（好ましくは３日ｍ以上）
に成長したところで一本一本切除し、好ましくは抗生物
質溶液などで除菌したのち例えば、実生の培養の場合と
同一の培地であるが固化剤を加えない液体培地中で、静
置あるいは緩やかな条件で振盪しながら、２５℃〜４０
℃、暗所条件で、適宜空気供給、培地交換などを行ない
ながら培養をすれば毛状根は増々成長をし続ける。この
際、培養に使用する機器類は、毛状根の成長に伴いスケ
ールアップする必要がある。カルスの場合と異なり、容
器の容量に対し、その基となる毛状根の仕込み量は１１
５０００程度以上であれば十分であり、その増殖能力は
極めて高い。なお、培養、形質転換操作などにおいて通
常の技術の範囲内で可能な限りの殺菌、除菌、防菌など
に関する処置をとる方が好ましい。

第１表 ＹＥＢ培地 以上のようにして得られた毛状根には、後記の試験例の
結果から明らかなように、セサミン、セサモリン等の生
理活性物質とは異なり、真菌類にも抗菌作用を示す物質
が含まれている。よって、毛状根を単に圧搾して得られ
る圧搾液をそのまま抗菌剤として用いることが期待でき
る。また、こうして得られた圧搾液を乾燥させて粉末と
したり、アルコール等の他の通常の抗菌剤と混合して使
用に供することも可能である。

〔作　用〕

本発明の方法により培養して得られた毛状根が、カルス
誘導によるゴマ細胞が有さない生理活性物質を何故有す
るのかその理由は定かでないが、例えば、次のように考
えることができる。形質転換によってゴマ細胞に組み込
まれるＴ−ＤＮＡがゴマ細胞の核外遺伝子に組み込まれ
る際、その組み込まれる位置及びＴ−ＤＮＡの長さは一
定ではなくてランダムに組み込まれる。しかしながら、
組み込まれたＴ−ＤＮＡの遺伝子機能の発現と、ゴマ細
胞が本来持っている遺伝子であるがその機能を発現して
いなかった部分とが結びつき、ゴマ細胞がこれまで産生
じえなかったような生理活性物質を産生ずるようになる
のではないかと推察される。

〔実施例および試験例〕

以下、本発明を実施例および試験例でもって更に詳しく
説明する。

実施例１ 黒ゴマ種子を７０％エチルアルコールに約１分間、次い
で２％次亜塩素酸ナトリウム液に約２０分間浸漬したの
ち滅菌水で３回水洗して滅菌処理し、０．５％のショ糖
を添加した０、９％の固化寒天上に静置し、３０℃、１
５００ルクスの恒温室に配置して発芽させた。

発芽したゴマ種子を、ジュランガム０．２５％を添加し
て固化したＭＳ　（ムラシゲ・スクーグ）培地へ移植し
、１０日間発芽時と同一条件の恒温室に配置した。１０
日０に５〜８ｃ１１１に成長した実生を得た。

このようにして得られた実生の頂部より２ｃＩＩｌ下を
切断し、得られた根付部分の方の切断面に別途培養して
おいたアグロバクテリウム・リゾゲネスＡＴＣＣ１５８
３４採苗をミクロスパーチルで塗布する。なお、このア
グロバクテリウム・リゾゲネス菌は一昼夜ＹＥＢ培地（
前記第１表参照）に植菌して培養したものを遠心分離（
３０００ｒｐｍ、２０分）にかけ、菌密度を上げたもの
を用いた。

アグロバクテリウム・リゾゲネス菌を塗布した実生は、
そのまま２週間、３０℃、暗所条件の恒温室に静置した
。２週間後にアグロバクテリウム・リゾゲネス菌を塗布
した実生の切断面に無数の毛状根が発根しているのが認
められた。この発根部（２〜３ｍｍ）のみを切除し、実
生の培養の除用いた培地と同一の新たに用意した培地に
移植し、３０℃、暗所条件の恒温室で更に２週間培養し
た。

その結果毛状根は大きく成長し、平均２．５ｃｍ程度と
なった。このようにして得られた毛状根を、１本１本切
除して、クラフォラン■（セフェム系抗生物質、ヘキス
ト社製）の５００ｐｐ−溶液に浸漬して除菌し、次いで
ＭＳ培地（液体培地）中で３０℃、暗所条件の恒温室に
て２週間振盪培養を行なった。平均７．５ｃｍにも大き
く成長した毛状根を多数得た。

実施例２ 上記実施例１の方法に準じ、ゴマ種子として金ゴマ種子
を、アグロバクテリウム属菌としてアグロバクテリウム
・リゾゲネスＩＦＯ１４５５４（ＮＩＡＥＳ　１７２４
）採苗を用いた他はすべて上記実施例１の場合と同一の
条件下でゴマ細胞の形質転換および培養を行ないゴマ毛
状根を得た。

アグロバクテリウム・リゾゲネスＩＦＯ１４５５４（Ｎ
ＩＡＥＳ　１７２４）採苗は、感染力か弱いと一般にい
われているが、ゴマに対しては十分な感染力を示した。

得られた金ゴマの毛状根は、実施例１の黒ゴマより一段
と大きく成長（平均１４（７））した。

実施例３ 適量のＭＳ培地を入れたジャーファーメンタ−（容量５
Ｎ）に、上記実施例１で得た毛状根３本（約５ｇ）を入
れて３５℃、暗所条件の下ＭＳ培地を通気によって循環
させながら１月間培養した。

毛状根は旺盛に成長し、ジャーファーメンター−杯（約
１）ｃｇ）になった。

実施例４ 黒ゴマ種子の実生を上記実施例１の方法により得た。こ
の実生を根のつけ根より２ａｎの所で切断して根付部分
を除き、上部を更に茎部と茎部に切り分けた。茎部は７
關の大きさに、茎部は一辺が７ｍの方形の切片とし、残
りは廃棄した。これら切片を、別途ＹＥＢ培地にて一昼
夜培養して軽く遠心分離（４０００ｒｐｍ、２分間）し
ておいたアグロバクテリウム・リゾゲネスＡＴＣＣ１５
８３４採苗の培養液中に、３０℃暗所条件下２時間はど
浸漬した。２時間検切片を菌液より取り出して無菌濾紙
にて切片に付着した余分の菌液を拭き取り、ＭＳ培地を
０．２５％のジュランガムにて固化した培地上に静置し
、３０℃、暗所条件で２週間培養した。培養期間終了時
には切片に１３はどの無数の毛状根が生えていた。これ
を１本１本切り取り、新たなＭＳ培地（液体培地）中で
、３５℃、振盪（６０ｒｐｍ）、暗所条件下４週間更に
培養したところ、いずれも８ａｎ程度の大きさに成長し
た。

試験例 試料の調製： 毛状根の誘導 前記実施例１の方法に準じて金ゴマ種子、黒ゴマ種子お
よび白ゴマ種子由来の毛状根を得、これらを本発明の試
料とした。ただし抗生物質による除菌処理はいずれも行
なわず、また、カビ、酵母などのコロニーが認められた
ものは一切使用しなかった。

カルスの誘導 前記実施例１の方法に準じて金ゴマ種子、黒ゴマ種子お
よび白ゴマ種子をそれぞれ発芽させ、次いで更に実施例
１と同じ条件下で培養して５〜８国に成長した実生を得
た。

こうして得られた実生から子葉および胚軸部の５〜１０
ｍｍの切片を得、特開昭６３−２０７３８０号公報で開
示の方法に準じて３０℃の恒温室で暗所条件にて４週間
静置してカルスの誘導を行なった。この際カルス誘導に
用いた培地は、ＭＳ培地にナフタレン酢酸を５　Ｘ　１
０−５Ｍ、ベンジルアデニンを１Ｘ１０’Ｍ添加し、更
にアガロース・ジュランガム０．２５％を添加して固化
させたものであった。

こうして誘導したカルスを次いでＭＳ培地にナフタレン
酢酸５　Ｘ　１０−５Ｍ、ベンジルアデニンｌＸ１０−
５Ｍ添加し、更にアガロース・ジュランガム０８２５％
を添加して固化させた培地上に移植し、３０℃、明所条
件（８０００ルクス）の恒温室で更に３週間静置して対
照試料として６種のカルスを得た。

試　　験： （Ａ）セサミン、セサモリンの確認テスト（標　準） ゴマ種子より常法に準じて抽出して得たセサミン、セサ
モリンを各々の標準とした。

（各試料からの抽出） 本発明の３種の毛状根および対照の６種のカルスをそれ
ぞれ別々に磨砕し、メタノールで抽出した。各抽出物を
遠心分離（２００Ｏｒｐｍ、１０分）にかけて得られた
上澄部のみを更にメタノールで３回抽出し、得られたメ
タノール抽出液をいずれもエバポレーターで蒸発乾固し
た。

（測定方法） こうして得られた９種類の抽出サンプルをいずれもメタ
ノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィーにかけた
。

（結　果） 全抽出サンプルともセサミン、セサモリンの標準品のピ
ークの位置と同じ位置にピークが認められ、よって、い
ずれもセサミン、セサモリンを含有していることが確認
された。

（Ｂ）抗菌性テスト 本発明の３種の毛状根試料と対照の６種のカルス試料を
用いて酵母、ブドウ球菌および大腸菌に対するバイオア
ッセイをそれぞれ行なった。

（対照菌の培養およびブレーティング）下記の第２表に
示した配合割合のＹＭ培地にて上記の菌をそれぞれ３０
℃で一夜振盪培養した。

こうして得られた培養物を用い、ＹＭ培地に０、９％の
寒天を添加して固化させたものにそれぞれいずれも菌数
が１０’／ｍｌになるようにブレーティングした。

第２表 ＹＭ培　地 （テスト法） いずれの試料とも薬餌で押し潰し、浸出してきた組織液
を抗生物質検定用の試験紙（直径６ｍｍ）にしみ込ませ
た。これら試験紙を、上記のようにして用意しておいた
プレート上に各々別々に乗せ、３６時間、３０℃の恒温
室に静置した。

なお、コントロールとして市販のセサモール（シグマケ
ミカルカンパニー製：商品名「セサモール」）をクロロ
ホルムに溶解して５０．１００゜２００．５００■ｇ／
ｐの各濃度にそれぞれ調整した溶液を別途用意した。こ
れら溶液に抗生物質検定用の試験紙をそれぞれ浸漬し、
室温で５分間放置してクロロホルムを揮発させた後、上
記のようにして用意しておいた別のプレート上にそれぞ
れ乗せて３６時間、３０℃の恒温室に静置した。

（結　果） 以上のようにして得た試験の結果を下記の第３表に示す
。なお、表中ＺｒはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓｒｏｕｘｉｌ　１Ｐ００６８６株菌（酵母）、Ｓａは
５ｔａｐｈｙｌ−ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＩＰ
Ｏ１３２７ｅ株菌（ブドウ球菌）およびＥｃはＥｓｃｈ
ｅｒｌｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　ＡＴＣＣ１２０４１株菌（
大採苗）を各々示す。またＧは金ゴマ種子、Ｂは黒ゴマ
種子、Ｗは自ゴマ種子をそれぞれ示し、更に表中の値は
、抗菌性テストの結果示された菌の全く生えていないゾ
ーンの直径（単位：闘）を示す。

第　　３ 表 〔発明の効果〕 以上のように本発明の方法によれば、培養の結果得られ
る毛状根から、従来知られているセサミン、セサモリン
のほか、これまで（ゴマでは）全く産生ずることは知ら
れていなかった、真菌類に対して抗菌作用のある有用物
質も得られる。これらの物質は、本発明の方法の実施に
際しては合成植物ホルモンは一切使用していない上に、
天然由来のものといえることから、安全性は高く、よっ
て医薬・食品分野への利用も十分に考えられる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ゴマ細胞を、Ｒｉプラスミドを保持するアグロバクテリ
   ウム属菌により形質転換させ、前培養により得られた毛
   状根を更に培養することを特徴とするゴマ毛状根の培養
   方法。