CN105325196B - 根部接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的方法 - Google Patents
根部接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种根部接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)培养小麦光腥黑粉菌菌丝：将浓度为1×105/ml的小麦光腥黑粉菌冬孢子悬液涂布到2％的水琼脂培养基上，每9cm直径的培养皿加0.1－0.5ml悬液，16℃培养，经观察确认直至长出先菌丝，所述先菌丝为冬孢子直径的1/2时用于下一步接种；(2)接种：将发芽后的小麦种子放在上述长出菌丝的培养基上，培养皿放入5℃培养箱中边春化边侵染，持续30‑45天。(3)春化结束后，将麦苗种植在无菌土中，放到白天23摄氏度，夜晚21摄氏度的人工气候培养箱中培养；所述发芽后的小麦种子指胚芽鞘萌出不超过1mm的发芽小麦。采用该方法，可以获得仅根部感染而其它部位表现正常的小麦光腥黑粉菌的小麦植株。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物领域，具体涉及一种根部接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的方法。
背景技术
小麦光腥黑粉菌，又名小麦光腥黑穗病菌(拉丁名：Tilletia foetida)，为黑粉菌目、腥黑粉菌科、小麦光腥黑穗病菌属。它可引起小麦腥黑穗病。小麦光腥黑穗病菌冬孢子萌发时只生出一根原菌丝，而内壁发生多处消解。原菌丝含有多个细菌核，并有脂肪粒，核糖体，糖原和线粒体等。原菌丝顶端可形成8个担孢子，并桥接形成“H”型菌丝。其孢子生于子房内，外包果皮，与种子同大。其孢子呈球形至椭圆形，有时候为长圆形至多角形，淡灰褐色至榄褐色，平滑，有腥臭。
在对小麦光腥黑粉菌的生理生长情况和侵染机制的研究中，通常需要通过人工方法将它接种至小麦植株使后者感染得到染病小麦植株以进行观察和分析，并且，在仅针对小麦植株根部的研究中，可能只需要得到根部侵染而其它部位表现正常的小麦材料，但迄今为止，尚未存在一种有效的人工接种小麦光腥黑粉菌仅侵染小麦根部的方法，以获得根部侵染率较高而其它部位表现正常的小麦植株用于研究。
发明内容
本发明基于上述领域的空白，提供了一种获得用于后续研究的小麦光腥黑粉菌根部感染小麦的方法。
本发明的技术方案如下：
根部接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)培养小麦光腥黑粉菌菌丝：将浓度为1×105/ml的小麦光腥黑粉菌冬孢子悬液涂布到2％的水琼脂培养基上，每9cm直径的培养皿加0.1－0.5ml悬液，16℃培养，经观察确认直至长出先菌丝，所述先菌丝为冬孢子直径的1/2时用于下一步接种；
(2)接种：将发芽后的小麦种子放在上述长出菌丝的培养基上，培养皿放入5℃培养箱中边春化边侵染，持续30-45天；
(3)春化结束后，将麦苗种植在无菌土中，放到白天23摄氏度，夜晚21摄氏度的人工气候培养箱中培养；
所述发芽后的小麦种子指胚芽鞘萌出不超过1mm的发芽小麦。
所述冬孢子悬液的制备方法如下：
将小麦光腥黑粉菌的菌瘿放进离心管中，加蒸馏水浸泡半个小时后将种皮夹出，150目纱网过滤去掉残渣，过滤液体离心震荡，将上清倒出弃掉；
对沉淀加水常温培养12-36小时后将水倒掉，加0.25％NaClO处理1min后倒掉NaClO溶液，加无菌水离心清洗反复2到3次，得到冬孢子悬液；调整浓度为1×105/ml。
所述观察指，涂布24h后在显微镜下观察，每隔12h观察一次，直至观察到侵染菌丝。
步骤(2)中所述培养的时间为3d。
所的方法在研究小麦光腥黑粉菌方面的应用。
本发明提供了一种获得根部感染小麦光腥黑粉菌的小麦植株的方法，该方法获得的被侵染小麦植株仅在根部出现感染现象，而植株的其它部位表现正常。
本发明的方法的特点在于将刚刚发芽的小麦种子与已经萌发的小麦光腥黑粉菌冬孢子放在小麦光腥黑粉菌的菌丝培养基上，于春化条件下共培养从而促使菌丝侵染发芽期的小麦，采用的发芽小麦的发芽程度为胚芽鞘不长于1mm，确保菌丝仅侵染根部而不侵染其它部位。非常适合于建立用于后续研究的小麦光腥黑粉菌根部感染小麦。
所述方法包括如下步骤：
(1)制备小麦光腥黑粉菌冬孢子悬液：菌瘿放进离心管中，加蒸馏水浸泡半个小时后将种皮夹出，150目纱网过滤，离心震荡，过滤和振荡的作用是使菌瘿散落出的孢子粉末更均匀；将水倒出后再加水常温培养24小时；此步骤的好处是让来自菌瘿的孢子复苏；第二天将水倒掉，加0.25％NaCLO 1min后倒掉，加无菌水离心清洗反复2到3次，得到冬孢子悬液；加0.25％NaCLO 1min是给冬孢子消毒，避免其它菌的干扰。用无菌水离心清洗数次的作用是去除小麦光腥黑粉菌冬孢子悬液中的其它杂质，纯化悬液使其更均质；
(2)培养小麦光腥黑粉菌菌丝：将步骤(1)获得的冬孢子悬液涂布到2％的水琼脂培养基上，16℃培养，经观察确认直至长出侵染菌丝；经过上述培养的小麦光腥黑粉菌冬孢子可成功地萌发并生长出符合侵染条件的菌丝。(3)接种：将发芽后的小麦种子放在上述长出侵染菌丝的培养基上，边春化边侵染。该步骤既能使小麦种子成功春化使其后期可以顺利孕育结实，又能在春化过程中同时让菌丝侵染已发芽的小麦种子根部，便于后期研究该感染植株的其它生理性状。
进一步地，所述冬孢子悬液的浓度为1×105/ml，好处是用这种浓度的冬孢子悬液进行涂布培养获得的生长效果最佳。
具体地，所述观察指，涂布24h后在显微镜下观察，每隔12h观察一次，直至观察到侵染菌丝；观察的作用是便于确认水琼脂培养基上生长的冬孢子是否长出符合侵染条件的菌丝。
具体地，所述发芽后的小麦种子指，小麦种子加水浸泡至发芽，此步骤十分简单，目的就是为了使小麦种子萌发出初生根，便于后面的根部侵染。
具体地，所述边春化边侵染指，于5℃培养箱中放置1个月。这样为小麦种子提供了适当的春化温度和足够的春化、侵染时间，使春化侵染后的小麦种子既能获得仅根部感染的效果，又能保证相应的小麦植株根部的较高的侵染率。
本发明还请求保护所述方法在研究小麦光腥黑粉菌方面的应用。
采用本发明所述的根部接种方法获得的被侵染的小麦种子，经种苗长出小麦植株后，通过PCR检测以及激光共聚焦扫描显微镜的观察共同确认根部感染的小麦植株数量，经统计，侵染率可高达91％。
这表明，采用本发明所述的方法，可以获得仅根部感染小麦光腥黑粉菌的小麦植株的成功率更大。并且，本发明的方法简单易行、便于实施操作、有利于推广应用。
附图说明
图1为小麦光腥黑粉菌的冬孢子；
图2为冬孢子萌发成先菌丝；
图3为长出侵染菌丝；
图4为侵染一个月后激光共聚焦显微镜下观察到的菌丝；
图5为小麦光腥黑粉菌特异性引物PCR后琼脂糖凝胶电泳检测后的条带；
图6为叶片未表现症状的小麦苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细说明本发明所述的制品，但并不以此限制本发明的范围。如无特殊说明，下述所采用的试剂与材料均可商购获得，所采用的方法均为常规操作。
生物材料
小麦品种：冬选3号，为已知品种，可商购获得。
供试菌株：小麦光腥黑粉菌菌株，采样自河南田间。
试剂与耗材
琼脂、蒸馏水、WGA-AF488、Propidium idodide等染色剂、NaCLO、无水乙醇、PCR扩增所需试剂、琼脂糖凝胶电泳所需试剂均商购获得。
培养基：2％的水琼脂培养基(具体成分：20g琼脂粉，1L蒸馏水)；
实施例1、采用本发明所述方法人工接种小麦光腥黑粉菌
具体步骤：
(1)制备小麦光腥黑粉菌冬孢子悬液：
菌瘿放进离心管中，加蒸馏水浸泡半个小时后将种皮夹出，150目纱网过滤，离心震荡，将水倒出后再加水常温培养24小时；第二天将水倒掉，加0.25％NaCLO 1min后倒掉，加无菌水离心清洗反复2到3次，得到冬孢子悬液；小麦光腥黑粉菌冬孢子在显微镜下的形态如图1所示。
(2)培养小麦光腥黑粉菌菌丝：将浓度为1×105/ml的小麦光腥黑粉菌冬孢子悬液涂布到2％的水琼脂培养基上，每9cm直径的培养皿加0.1－0.5ml悬液，16℃培养，经观察确认直至长出先菌丝，所述先菌丝为冬孢子直径的1/2时用于下一步接种；
(3)接种：将发芽后的小麦种子放在上述长出菌丝的培养基上，培养皿放入5℃培养箱中边春化边侵染，持续30-45天。
(4)春化结束后，将麦苗种植在无菌土中，放到白天23摄氏度，夜晚21摄氏度的人工气候培养箱中培养；
所述发芽后的小麦种子指胚芽鞘萌出不超过1mm的发芽小麦。
所述冬孢子悬液的浓度为1×105/ml。
所述观察指，涂布24h后在显微镜下观察，每隔12h观察一次，直至观察到侵染菌丝；大约2d后，小麦光腥黑粉菌冬孢子开始萌发，此时长出的是先菌丝，如图2所示，约3d后大部分冬孢子长出侵染菌丝，如图3所示。
所述发芽后的小麦种子指，小麦种子加水浸泡至发芽，胚芽鞘不长于1mm。
所述边春化边侵染指，于5℃培养箱中放置1个月。
实施例2、本发明方法获得的小麦种子的侵染情况验证和侵染率统计
(1)侵染情况验证：
将实施例1获得的春化侵染后的种苗取根部组织，检测是否小麦被侵染。采用CTAB法提取小麦根部的DNA，提取后的DNA用小麦光腥黑粉菌(Tilletia foetida)的特异性引物SC1：ACAAGTTGGAGTCAGGAG；SC2：ATCGTATGGTTTCGTCTT进行PCR反应，反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测，发现有特异性条带，如图5所示。
同时，将小麦根部组织剪成小段后置于无水乙醇中固定，将样品置于10μg/mLPropidium idodide(0.5mL),0.02％Tween 20(0.5mL)染色10min,然后20μg/mL WGA-AF488(0.5mL)染色10min最后用10×PBS(pH 7.4,1mL)冲洗3至5次。WGA可将真菌的菌丝染成绿色，Propidium idodide可将植物细胞染成红色，将染色好的小麦组织在激光共聚焦显微镜下观察，激发光为488，观察结果如图4所示，发现有菌丝存在。证明一个月后小麦的根部已被小麦光腥黑粉菌侵染，说明本发明的方法成功获得根部侵染的小麦种苗。
上述PCR反应体积为25μL，其中包括
PCR扩增程序为
(2)侵染率统计：
将确定侵染的种子数量除以进行处理的种子总数，得到的侵染率为91％。
(3)植株感染情况观察：
将上述经侵染验证后的种苗进行移栽，移栽种苗的土壤需要进行高温灭菌。移栽后获得根部侵染的小麦植株，统计获得根部感染植株的比例为91％。
Claims (3)
1.根部接种小麦光腥黑粉菌侵染小麦的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)培养小麦光腥黑粉菌菌丝：将浓度为1×105/ml的小麦光腥黑粉菌冬孢子悬液涂布到2％的水琼脂培养基上，每9cm直径的培养皿加0.1－0.5ml悬液，16℃培养，经观察确认直至长出先菌丝，所述先菌丝为冬孢子直径的1/2时用于下一步接种；
(2)接种：将发芽后的小麦种子放在上述长出菌丝的培养基上，培养皿放入5℃培养箱中边春化边侵染，持续30-45天；
(3)春化结束后，将麦苗种植在无菌土中，放到白天23摄氏度，夜晚21摄氏度的人工气候培养箱中培养3天；
所述发芽后的小麦种子指胚芽鞘萌出不超过1mm的发芽小麦；
所述冬孢子悬液的制备方法如下：
将小麦光腥黑粉菌的菌瘿放进离心管中，加蒸馏水浸泡半个小时后将种皮夹出，150目纱网过滤去掉残渣，过滤液体离心震荡，将上清倒出弃掉；
对沉淀加水常温培养12-36小时后将水倒掉，加0.25％NaClO处理1min后倒掉NaClO溶液，加无菌水离心清洗反复2到3次，得到冬孢子悬液；调整浓度为1×105/ml。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述观察指，涂布24h后在显微镜下观察，每隔12h观察一次，直至观察到侵染菌丝。
3.权利要求1或2所述的方法在研究小麦光腥黑粉菌方面的应用。
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| CN1891835A (zh) * | 2005-06-29 | 2007-01-10 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 小麦矮腥黑粉菌检测的一种pcr方法 |
| KR20140037473A (ko) * | 2012-09-19 | 2014-03-27 | 경상대학교산학협력단 | 식물생장시스템 |
| CN104221648A (zh) * | 2013-08-13 | 2014-12-24 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 室内培养获得小麦矮腥黑粉菌发病植株的方法 |
| CN104593332A (zh) * | 2014-10-22 | 2015-05-06 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 一种检测小麦矮腥黑粉菌的试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 小麦矮腥黑粉菌冬孢子萌发和室内人工接种方法的探索;姚卓等;《植物保护》;20140630;第40卷(第3期);第122-126页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105325196A (zh) | 2016-02-17 |
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