CN101352144B - 一种灵芝杂交育种方法 - Google Patents

Abstract

一种灵芝杂交育种方法，包括亲本菌株选择、菌丝培养、再生培养基配制、菌丝裂解、单细胞再生、单核细胞分离、单核体杂交，杂交菌株培养并筛选。由于灵芝孢子的细胞壁很厚，在人工条件下几乎不萌发，难以进行杂交育种，本发明通过菌丝裂解形成单细胞，并萌发成单核菌株进行杂交育种，整个过程不超过20天即可完成，单核细胞的获得率不低于35％，具有杂交育种的速度快、成功率高、后代遗传性状稳定等优点。

Description

一种灵芝杂交育种方法 

技术领域 本发明涉及一种食用菌育种方法，特别是一种灵芝杂交育种方法。 

背景技术 食用菌的育种方法一般包括野生种驯化、诱变育种、原生质体融合育种、基因工程育种和杂交育种等。 

野生种驯化是从野生灵芝子实体中分离获得菌丝体，经过栽培试验，筛选获得优良菌种，这种育种方法需要分离获得大量的菌株，从中选出高产优质的品种，只能从现有的菌株中筛选，不能创造出新的种性。 

诱变育种是通过物理或化学的手段，促进变异，再从众多的变异体中筛选出好的品种，这是一种随机性很强育种方法，需要大量的筛选才有可能获得好品种。 

原生质体融合育种是一种用于远缘杂交克服“种间性隔离”的技术，上世纪八十年代在食用菌广泛研究，但由于在有丝分裂过程中有些染色体会丢失，融合子不稳定，这种育种技术未得到广泛应用。 

基因工程育种是近年来发展起来的新技术，具有目标明确的特点，但这一技术在食用菌育种中还处在研究试验阶段，尚未广泛应用。 

杂交育种，国外有用酵母菌与灵芝孢子共培养，培养时间4—6周，可诱导少量灵芝孢子萌发，萌发率低于1/10⁸。国外的这种方法存在以下缺点：①试验时间长；②萌发率很低，需要大量的试验才能获得可用于杂交的单孢菌株；③需要除去酵母菌后才能用于杂交。由于酵母菌的生长速度远远快于灵芝菌丝，如果没有除去酵母菌，经常会由于酵母菌大量生长而使灵芝菌丝不生长。 

杂交育种是一种有效的品种改良技术，杂交育种可以组合双亲的优良性状、表现出杂种优势，培育出超越亲本的杂交种。杂交育种在食用菌中已广泛应用，取得很大成效。 

现代医学研究证明，灵芝对治疗神经衰弱、慢性支气管炎、冠心病、心绞痛及高血脂、高血压、肝炎、造血系统疾病等有良好的疗效。由于含 有灵芝多糖，灵芝可以提高机体免疫功能，增强体质，具有抗肿瘤的作用。 

我国灵芝年产量约2000吨，创产值约20亿元人民币，在50多种食用菌中单种产值最大。但由于我国灵芝人工育种研究相对落后，我国主栽的品种都是从国外引进或者是从引进品种分离获得。这种状况在一定程度上制约灵芝产业的发展。 

鉴于灵芝具有很高的药用价值，灵芝产业又是一个很大的产业，如果能建立一种高效的杂交育种技术，将会促进灵芝新品种的培育，进而促进灵芝产业的进一步发展。 

发明内容 本发明目的是探索解决灵芝杂交育种中单孢菌株难以获得的问题，为灵芝的杂交育种提供一种新方法。 

本发明的一种灵芝杂交育种方法，包括灵芝亲本菌株选择、菌丝培养、再生培养基配制、菌丝裂解、单细胞再生、单核细胞分离、单核体杂交，杂交菌株培养并筛选，其特征在于 

1、所述菌丝裂解 

将经过2次活化、处于生长对数期中期的亲本液体菌丝分别放入离心管中，离心后取沉淀，并加入无菌水清除菌丝外壁的杂质，再用稳渗液清洗，将清洗后的菌丝悬浮于溶壁酶液，于30℃的循环水浴锅中恒温水浴至单细胞完全释放，得单细胞裂解液；所述稳渗液为0.6M甘露醇水溶液；所述溶壁酶液为含2％溶壁酶的稳渗液。 

2、所述单细胞再生， 

离心单细胞裂解液，取沉淀，并用再生培养基清洗沉淀至单细胞外不含溶壁酶，然后用再生培养基稀释至单细胞浓度为2～3个/低倍镜视野，将单细胞稀释液涂布至再生培养基平板中，并倒置培养皿于25℃培养箱中培养，至单细胞开始萌发； 

3、所述单核细胞分离 

从单细胞萌发的培养皿中挑取单个已长出芽管的单细胞连同培养基放入斜面培养基中，于25℃培养，长出3～5cm的菌落时，镜检挑取无锁状联合的菌株，即为单核菌株。 

本发明的灵芝杂交育种方法，解决了由于灵芝孢子的细胞壁很厚，在人工条件下几乎不萌发，难以进行杂交育种的难题。 

本发明的灵芝杂交育种方法，通过菌丝裂解形成单细胞，并萌发成单核菌株进行杂交育种，整个过程不超过20天即可完成，单核细胞的获得率不低于35％，杂交育种的速度快、成功率高。 

利用本发明的方法进行灵芝杂交育种，其后代的遗传性状稳定，而无论是诱变育种还是原生质体融合育种所得到的后代，通常遗传性状不稳定。 

由于常规的杂交育种需要担孢子作为原材料，而担孢子是从灵芝子实体中弹射而来，因此常规的杂交育种受季节限制，一年只能做一批；本发明的杂交育种方法，所用的原材料是灵芝的菌丝，通过液体发酵，几天时间就可以得到，不受季节限制，一个月就可以做几批次。 

具体实施例：为了充分公开本发明的灵芝杂交育种方法，以下结合实施例加以说明。 

实施例：一种灵芝杂交育种方法 

一种灵芝杂交育种方法，包括以下步骤： 

1.亲本菌株选择：选取丰产性状良好的广东赤芝和灵芝5.75为杂交亲本，转接到PDA斜面中进行活化两次；广东赤芝和灵芝5.75由市场购得。 

2.再生培养基配制(g·L^-1)：葡萄糖10.0、麦芽糖5.0、酵母膏5.0、氯化钾44.73、固化培养基添加20g·L^-1琼脂； 

3.菌丝培养：把经2次活化好的菌种接种至PDA培养基中，放置摇床中培养7天，培养温度为25度，转速为100转每分钟；PDA培养基由市场购得； 

4.菌丝裂解： 

(1)把在PDA培养基中已经长成的菌丝移入7ml的离心管中，每管5ml，赤芝与灵芝5.75各两管； 

(2)将步骤4(1)移好菌液的离心管放入高速离心机中10000rpm离心10min； 

(3)将步骤4(2)离心过的离心管取出，倒出上清液，加入无菌水， 振荡后再次放入高速离心机中以10000rpm离心10min； 

(4)将步骤4(3)离心过的离心管取出，倒出上清液，加入稳渗液洗涤，振荡后再次放入高速离心机中离心； 

(5)将步骤4(4)离心过的离心管取出，用无菌滤纸过滤去溶液后，将收集的菌丝在无菌滤纸上吸干水份，称取0.5g菌丝，放入干净的离心管中； 

(6)称取100mg溶壁酶加入另一个干净的离心管，加入5ml稳渗液，制得溶壁酶液； 

(7)向步骤4(5)放入菌丝的离心管中加入2.5ml溶壁酶液，振荡； 

(8)把步骤4(7)加入溶壁酶液的离心管放入循环水浴器中30℃水浴2.5～3.0h，其间5～10分钟振荡一次，至单细胞完全释放，得单细胞裂解液；具体方法：从离心管中取少量溶液，用血球计数板在显微镜下检查单细胞数量，至确定单细胞完全释放。 

5.单细胞再生： 

(1)将装有单细胞裂解液的离心管放入离心机中，于4℃，1000rpm离心20min； 

(2)将离心过的离心管取出，倒去上清液，取沉淀，各加入2ml稳渗液洗涤后再放入离心机以4℃，1000rpm离心20min； 

(3)将步骤5(2)离心过的离心管取出，倒去上清液，取沉淀，各加入2ml再生培养基，放入离心机，于4℃，1000rpm离心20min； 

(4)将步骤5(3)离心过的离心管取出，倒去上清液，加入再生培养基稀释，稀释后各取一小滴溶液于载玻片上，盖上盖玻片后放上显微镜观察，使单细胞浓度为2～3个/低倍镜视野(10×物镜)； 

(5)将稀释后的单细胞液涂平板，每皿涂布0.5ml，倒置平板培养皿于25℃下培养48小时，单细胞开始萌发。 

6.单核细胞分离： 

(1)将平板培养皿放于显微镜下寻找已萌发并长出芽管的单细胞，且周围其他部分无相同菌丝； 

(2)点燃酒精灯，将接种针于酒精灯上烧红，在显微镜下挑取单个已萌发并长出芽管的单细胞连同一小块培养基的，并确保培养基上无其他单细胞； 

(3)在火焰处拔出斜面培养基上的硅胶塞，将挑出的培养基块放入，塞回硅胶塞，放于25℃下培养让其生长； 

(4)当长出3～5cm的菌落时，无菌操作挑取少量菌丝，显微镜下检查是否有锁状联合，挑取无锁状联合的菌株。 

7.单核体杂交：将20mlCM培养基装入干净的培养皿中，两个配对菌株相距1cm接种，25℃下培养7天，当两个菌株的菌落相互接触后，挑取交接处的菌丝，显微镜下检查是否有锁状联合，如果有锁状联合，则说明杂交成功，如果没有锁状联合，则说明这两个菌株不亲和，不可杂交。可杂交的组合转接到新的CM培养基培养皿，25℃下培养5--7天后，在显微镜下进行单菌丝尖端分离，即得到若干纯的杂交菌株。所述CM培养基为通用的完全培养基，由市场购得。 

8.杂交菌株培养并筛选：常规方法培养所获得的杂交菌株，并从中筛选出杂种优势强、相对性状优良的杂交菌株。 

利用本发明的方法，从菌株广东赤芝的单细胞再生平板中分离获得79个单个再生菌株，显微镜观察锁状联合结果，有29株无锁状联合，50株具有典型的锁状联合，菌丝的单核化率为41.4％；从灵芝5.75菌株单细胞再生平板中分离获得72个单个再生菌株，通过显微镜观察锁状联合，其中37株无锁状联合，35株具有典型的锁状联合特征，菌丝的单核化率为51.4％。通过单核菌株的杂交配对，培养、筛选后得到3个优良的杂交菌株。 

本发明所用的材料与仪器：溶壁酶为生物纯试剂；酵母膏为化学纯试剂；葡萄糖、麦牙糖和甘露醇为分析纯试剂。4K-15型高速冷冻离心机德国Sigma公司生产；HH-6型水浴锅由国华电器公司生产；BX51生物显微镜由日本奥林巴斯生产；SW-CJ-1FB型超净工作台由苏州净化设备有限公司生产；GSP-9160MBE型恒温培养箱由上海博迅实业有限公司生产。

Claims (4)

1.一种灵芝杂交育种方法，包括灵芝亲本菌株选择、菌丝培养、再生培养基配制、菌丝裂解、单细胞再生、单核细胞分离、单核体杂交，杂交菌株培养并筛选，其特征在于

(1)灵芝亲本菌株选择：取广东赤芝和灵芝5.75为杂交亲本，转接到PDA斜面中进行活化两次；

(2)把经2次活化好的菌种接种至PDA培养基中，放置摇床中培养7天，培养温度为25度，转速为100转每分钟；PDA培养基由市场购得；

(3)再生培养基配制：葡萄糖10.0g·L^-1、麦芽糖5.0g·L^-1、酵母膏5.0g·L^-1、氯化钾44.73g·L^-1、固化培养基添加琼脂20g·L^-1；

(4)菌丝裂解，是将经过2次活化、处于生长对数期中期的亲本液体菌丝分别放入离心管中，离心后取沉淀，并加入无菌水清除菌丝外壁的杂质，再用稳渗液清洗，将清洗后的菌丝悬浮于溶壁酶液，于30℃的循环水浴锅中恒温水浴至单细胞完全释放，得单细胞裂解液；

(5)单细胞再生，即离心单细胞裂解液，取沉淀，并用再生培养基清洗沉淀至单细胞外不含溶壁酶，然后用再生培养基稀释至单细胞浓度为2～3个/低倍镜视野，将单细胞稀释液涂布至再生培养基平板中，并倒置培养皿于25℃培养箱中培养，至单细胞开始萌发；

(6)单核细胞分离，是从单细胞萌发的培养皿中挑取单个已长出芽管的单细胞连同培养基放入斜面培养基中，于25℃培养，长出3～5cm的菌落时，镜检挑取无锁状联合的菌株；

(7)单核体杂交：将20mlCM培养基装入干净的培养皿中，两个配对菌株相距1cm接种，25℃下培养7天，当两个菌株的菌落相互接触后，挑取交接处的菌丝；

(8)杂交菌株培养并筛选：常规方法培养所获得的杂交菌株，并从中筛选出杂种优势强、相对性状优良的杂交菌株。

2.根据权利要求1所述的一种灵芝杂交育种方法，其特征在于菌丝裂解的具体步骤如下：

(1)把在PDA培养基中已经长成的菌丝移入7ml的离心管中，每管5ml，赤芝与灵芝5.75各两管；

(2)将步骤(1)移好菌液的离心管放入高速离心机中10000rpm离心10min；

(3)将步骤(2)离心过的离心管取出，倒出上清液，加入无菌水，振荡后再次放入高速离心机中以10000rpm离心10min；

(4)将步骤(3)离心过的离心管取出，倒出上清液，加入稳渗液洗涤，振荡后再次放入高速离心机中离心；

(5)将步骤(4)离心过的离心管取出，用无菌滤纸过滤去溶液后，将收集的菌丝在无菌滤纸上吸干水份，称取0.5g菌丝，放入干净的离心管中；

(6)称取100mg溶壁酶加入另一个干净的离心管，加入5ml稳渗液，制得溶壁酶液；

(7)向步骤(5)放入菌丝的离心管中加入2.5ml溶壁酶液，振荡；

(8)把步骤(7)加入溶壁酶液的离心管放入循环水浴器中30℃水浴2.5～3.0h，其间5～10分钟振荡一次，至单细胞完全释放，得单细胞裂解液；具体方法：从离心管中取少量溶液，用血球计数板在显微镜下检查单细胞数量，至确定单细胞完全释放。

3.根据权利要求1所述的一种灵芝杂交育种方法，其特征在于单细胞再生的具体步骤如下：

(1)将装有单细胞裂解液的离心管放入离心机中，于4℃，1000rpm离心20min；

(2)将离心过的离心管取出，倒去上清液，取沉淀，各加入2ml稳渗液洗涤后再放入离心机以4℃，1000rpm离心20min；

(3)将步骤(2)离心过的离心管取出，倒去上清液，取沉淀，各加入2ml再生培养基，放入离心机，于4℃，1000rpm离心20min；

(4)将步骤(3)离心过的离心管取出，倒去上清液，加入再生培养基稀释，稀释后各取一小滴溶液于载玻片上，盖上盖玻片后放上显微镜观察，使单细胞浓度为2～3个/低倍镜视野；

(5)将稀释后的单细胞液涂平板，每皿涂布0.5ml，倒置平板培养皿于25℃下培养48小时，单细胞开始萌发。

4.根据权利要求1所述的一种灵芝杂交育种方法，其特征在于单核细胞分离的具体步骤如下：

(1)将平板培养皿放于显微镜下寻找已萌发并长出芽管的单细胞，且周围其他部分无相同菌丝；

(2)点燃酒精灯，将接种针于酒精灯上烧红，在显微镜下挑取单个已萌发并长出芽管的单细胞连同一小块培养基的，并确保培养基上无其他单细胞；

(3)在火焰处拔出斜面培养基上的硅胶塞，将挑出的培养基块放入，塞回硅胶塞，放于25℃下培养让其生长；

(4)当长出3～5cm的菌落时，无菌操作挑取少量菌丝，显微镜下检查是否有锁状联合，挑取无锁状联合的菌株。