CN104480035A - 一株胶冻样类芽胞杆菌高产菌株,其培养方法及用途 - Google Patents

一株胶冻样类芽胞杆菌高产菌株,其培养方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株胶冻样类芽胞杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)高产菌株KN-18，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO∶M2014321。该菌株具有极强的解硅能力和产芽孢能力，菌株发酵液的解硅能力可以达到26.8μg/ml，显著优于出发菌株和其它胶冻样类芽胞杆菌。本发明还公开了一种培养所述胶冻样类芽胞杆菌高产菌株的方法，采用该方法得到的发酵液其芽胞数高达20亿/ml，显著优于其它培养方法。本发明的胶冻样类芽胞杆菌作为生物肥料用在水稻上能使水稻株高增长5％以上，稻穗长增加4％以上，实粒数增加7％以上，亩产量增加9％以上；用在甜瓜上能使甜瓜提前2天成熟，单株着瓜个数多0.1个，单果重量增加5％以上，亩产量增加9％以上。

Description

一株胶冻样类芽胞杆菌高产菌株,其培养方法及用途
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一株胶冻样类芽胞杆菌高产菌株，还涉及所述菌株的培养方法及其作为生物肥料的用途。
背景技术
土壤中硅含量不足是限制作物产量的一个关键因素，硅元素首先以硅凝胶的形式在植物根部和叶面的表面组织上凝聚，增厚的表面增加了植物结构的稳定性，改善了植物的受光角度，从而促进植物生长，此外，硅元素在植物组织的沉淀还减少了蒸发作用，从而减少了干旱和盐碱的影响。硅酸盐细菌可以分解土壤及矿物中的硅，为植物提供充足的硅元素。
胶冻样类芽胞杆菌又名胶质芽孢杆菌，国内通常称之为硅酸盐细菌。它能分解正长石和磷灰石释放出磷、钾元素。胶冻样类芽胞杆菌具有转化土壤中的云母、长石等稳定硅酸盐矿物的特殊功能，不仅能提高作物的产量，增加抗逆性，而且还增加了土壤肥力，且当其在土壤中繁殖为优势菌群后，还可以达到抑制病原菌的效果。
目前，在世界范围内限制农业产量的主要因素之一就是土壤贫瘠，肥力下降，补充作物生长发育所必须的营养元素已经成为获得稳产、高产不可或缺的重要措施。土壤中含有大量的硅，但绝大多数处于结晶体中，不能被植物吸收利用。硅酸盐细菌能够转化土壤中晶体结构的硅成植物能利用吸收的多硅酸、单硅酸及各种易于转化为单硅酸的硅形态。
然而，现有的胶冻样类芽胞杆菌解硅能力不强，而且产芽孢能力很差，从而限制了它作为硅肥的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有强解硅能力和高产芽孢能力的胶冻样类芽胞杆菌菌株及其培养方法和用途。
本发明是通过下述方案实现的：
本发明首先以保藏在中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)的胶冻样类芽胞杆菌(保藏号为ACCC01429)菌株作为出发型菌株，通过N离子束诱变，以平板解硅圈大小来挑选，再通过摇瓶解硅和摇瓶发酵芽胞形成率实验进行验证，并在土壤中进行解硅能力的测定，最终获得了这一株胶冻样类芽胞杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)高产菌株KN-18，该菌株已于2014年7月4日在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO∶M2014321。
所述胶冻样类芽胞杆菌高产菌株的培养方法，它包括以下步骤：
1)菌种活化：将上述胶冻样类芽胞杆菌高产菌株KN-18接种至斜面培养基，在温度28℃下培养24小时；
所述斜面培养基的组成如下：蔗糖5-15％、磷酸氢二钾0.03-2％、二氧化硅0.2-1.5％、硫酸镁0.01-1％、碳酸钙0.05-0.5％、酵母抽提物0.02-0.1％、琼脂粉1.5-2％，pH7.2-7.4；
2)种子培养：在500ml三角瓶中装入50ml液体种子培养基，灭菌，然后把步骤1)得到的活化菌种接至种子培养基中，在32℃、180rpm的条件下培养16-20小时，制得种子液；
所述种子培养基的组成如下：淀粉1.5-2.5％，酵母抽提物0.5-1％、蔗糖0.1-0.5％、磷酸氢二钾0.1-0.5％、碳酸钙0.1-0.5％、二氧化硅0.1-0.5％，pH7.2-7.5；
3)发酵培养：将培养好的种子液取2.5-3ml接入25-30ml发酵培养基中，在32℃、180rpm的恒温摇床中培养40-48小时，得到发酵液；
所述发酵培养基的组成如下：淀粉1.5-2％、酵母抽提物0.5-1％、蔗糖1-2％、酵母粉0.5-1％、磷酸氢二钾0.02-0.05％、硫酸镁0.1-0.2％、碳酸钙0.05-0.1％，pH7.2-7.5。
本发明还涉及所述胶冻样类芽胞杆菌菌株在制备生物肥料中的用途，特别是在制备生物硅肥中的用途。
本发明的有益效果是：
1)本发明通过人工诱变和筛选得到的胶冻样类芽胞杆菌具有极强的解硅能力，该菌株发酵液的解硅能力可以达到26.8μg/ml，显著优于出发菌株和其它胶冻样类芽胞杆菌。
2)本发明获得的胶冻样类芽胞杆菌菌株具有极强的产芽孢能力，通过本发明的培养方法得到的发酵液其芽胞数高达20亿/ml，显著优于其它培养方法。
3)本发明所获得的胶冻样类芽胞杆菌作为生物肥料用在水稻上能使水稻株高增长5％以上，稻穗长增加4％以上，实粒数增加7％以上，亩产量增加9％以上，效果明显优于其它胶冻样类芽胞杆菌；用在甜瓜上能使甜瓜提前2天成熟，单株着瓜个数多0.1个，单果重量增加5％以上，亩产量增加9％以上，效果明显优于其它胶冻样类芽胞杆菌。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细地说明。
实施例1胶冻样类芽胞杆菌高产菌株的获得
1.制备出发型菌株的菌体
挑选出发菌(胶冻样类芽胞杆菌ACCC01429)单菌落，接入含有淀粉1％、酵母抽提物0.5％，氯化钠0.5％，pH7.2-7.5的简单培养基中，在32℃与180rpm的恒温摇床上培养16-24h，然后，取50ml发酵液离心收集菌体待用。
2.N离子束诱变强解硅性能及高产芽胞菌株的筛选
取步骤1制备的菌体用5ml无菌水溶解震荡均匀，取0.5ml涂于在无菌培养皿并吹干，采用TITAN离子束注入机对菌体进行N离子束注入，能量为30keV，注入剂量为1×1016ion/cm2，注入后再用5ml无菌水清洗培养皿上的菌体，稀释103倍后取50μl涂布固体含硅培养基平板，在温度28℃恒温培养箱中避光培养5-7d。
所述固体含硅培养基的组成是：蔗糖5-10％、酵母抽提物0.1-0.5％、二氧化硅0.2-1％、氯化钠0.02-0.05％、硫酸镁0.02-0.05％、碳酸钙0.05-0.2％、琼脂粉2％，pH7.2-7.5。
胶冻样类芽胞杆菌其重要特性是能够分解出长石、云母等矿物中的钾、硅，也能分解出磷灰石中的磷合成出有机酸、氨基酸、多糖等各种代谢产物。摇瓶试验表明，这些有机酸、氨基酸、多糖代谢产物具有络合矿物中各种金属离子的有机基团，并且它们本身也具有一定的酸溶作用，因此它们均能够破坏高岭石晶体结构，释放出其晶体中存在的硅。所以在初筛固体平板培养基中加入二氧化硅，经过培养后，平板上会出现明显的解硅透明圈。
经过5-7d的培养后，平板上出现明显的环状解硅圈透明带，根据N离子束诱变效果差异，解硅圈透明带宽度1-6mm，经过三十多次反复实验，终于发现一株透明带宽约12mm、芽胞形成率高的菌株，于2014年7月4日在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行保藏，保藏编号为CCTCC NO:M2014321。
3.摇瓶芽孢形成能力和解硅能力的验证
取保藏好的菌种，解冻后接入种子培养基中，同时取原始菌株和其它透明带较窄的菌株(3株)做对照试验，使用恒温摇床在温度32℃与180rpm的条件下培养16-24h，然后取种子液转接到发酵摇瓶，在恒温摇床，32℃，180rpm的条件下培养40-48h。然后取发酵液10ml，稀释2倍，在12000-18000rpm的条件下离心5min，去除菌体。取上清液，然后采用本技术领域技术人员熟知的钼蓝比色法(参见“土壤农化分析第三版”，中国农业出版社出版，2000年)测定该上清液中的可溶性硅。根据在该上清液中可溶性硅含量可以判断这些菌的解硅能力大小；取摇瓶发酵液，常规涂片，用碱性石炭酸复红染色，用奥林巴斯显微镜油镜(16×100倍)观察发酵芽胞形成率，采用本技术领域技术人员熟知的饲料中细菌总数的测定方法(参见GB/T13093-2006)，测定该发酵液中芽胞的含量，从而判断这些菌的芽胞形成率高低。
经解硅能力测定，本发明的菌株在摇瓶中的解硅能力可以达到26.8μg/ml，而所述的出发菌株ACCC01429其摇瓶解硅能力为6.3μg/ml，本发明是它的4.25倍；对照菌株如解硅圈为3mm的单菌落其摇瓶解硅能力为15.2μg/ml，本发明是它的1.76倍；解硅圈为4mm的单菌落其摇瓶解硅能力17.9μg/ml，本发明是它的1.5倍；解硅圈为5mm的单菌落其摇瓶解硅能力22.1μg/ml，本发明是它的1.21倍。
经过芽胞计数测定，本发明的胶冻样类芽胞杆菌菌株在摇瓶中的芽胞数达到20亿/ml，比所述的出发菌株提高了167％，比其它三株对照菌株分别提高了74％、81％和88％。
4.菌株鉴定
所获胶冻样类芽胞杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)菌株具有如下特征：
1)菌体形态特征：菌体粗、稍弯曲长杆状有厚荚膜，菌体着色均匀，菌体大小为(1.0～1.2)×(2.5～7.0)μm；
2)芽胞形态特征：芽胞囊微膨大，椭圆形中生，芽胞内不着色。
3)菌落形态特征：在硅酸盐细菌专用培养基平板上菌落为圆形，如半粒玻璃球，凸起，凸起度大于45度；无色透明，5-6d中部有淡黄色的浑浊点，边缘透明，表面光滑；粘稠，弹性大，可拉成丝状；好氧或兼性厌氧生长。
4)生理生化特征：革兰氏染色阴性，在植物根际具有解磷、解钾、解硅矿物作用，有一定固氮作用。
5)微生物学特性：好氧或兼性厌氧生长，接触酶反应阳性，氧化酶或卵磷脂酶反应阴性，在无氮培养基上生长良好，能很好地利用葡萄糖、蔗糖作为碳源，在酵母浸膏粉、蛋白胨、氯化钠培养基中略弱，只能形成很薄的荚膜，能水解淀粉，生长温度10-45℃。
实施例2菌株的培养
本发明胶冻样类芽孢杆菌的培养方法步骤如下：
1)菌种活化：将保藏编号为CCTCC NO:M2014321的胶冻样类芽胞杆菌高产菌株接种至斜面培养基，在温度28℃下培养24小时；
所述斜面培养基的组成如下：蔗糖5-15％、磷酸氢二钾0.03-2％、二氧化硅0.2-1.5％、硫酸镁0.01-1％、碳酸钙0.05-0.5％、酵母抽提物0.02-0.1％、琼脂粉1.5-2％，pH7.2-7.4；
2)种子培养：在500ml三角瓶中装入50ml液体种子培养基，灭菌，然后把步骤1)得到的活化菌种接至种子培养基中，在32℃、180rpm的条件下培养16-20小时，制得种子液；
所述种子培养基的组成如下：淀粉1.5-2.5％，酵母抽提物0.5-1％、蔗糖0.1-0.5％、磷酸氢二钾0.1-0.5％、碳酸钙0.1-0.5％、二氧化硅0.1-0.5％，pH7.2-7.5；
3)发酵培养：将培养好的种子液取2.5-3ml接入25-30ml发酵培养基中，在32℃、180rpm的恒温摇床中培养40-48小时，得到发酵液；
所述发酵培养基组成如下：淀粉1.5-2％、酵母抽提物0.5-1％、蔗糖1-2％、酵母粉0.5-1％、磷酸氢二钾0.02-0.05％、硫酸镁0.1-0.2％、碳酸钙0.05-0.1％，pH7.2-7.5。
得到的发酵液中活芽胞数达到了20亿/ml。
实施例3田间应用试验
下面对保藏编号为CCTCC NO:M2014321的胶冻样类芽胞杆菌进行了水稻和甜瓜的田间应用试验。
一.胶冻样类芽胞杆菌的水稻田间应用试验
1.试验田选择：试验田为沙泥田，质地中壤，肥力中等，前茬为油菜，试验前对耕层进行了取土分析，有机质16.501g/kg，碱解氮85mg/kg，有效磷7.2mg/kg，速效钾76mg/kg，PH值为5.2，供试作物为杂交中稻扬两优6号；
2.试验设计：
处理1：常规施肥+胶冻样类芽孢杆菌CCTCC NO:M2014321菌肥；
胶冻样类芽孢杆菌CCTCC NO:M2014321菌肥的制备：云母粉与胶冻样类芽胞杆菌菌粉混合成10亿芽胞数/g粉末；
处理2：常规施肥+同处理1等量的胶冻样类芽胞杆菌ACCC01429；
处理3：常规施肥处理；
试验小区面积20平方米，随机排列，四次重复。
试验主要操作：移栽前常规施肥亩施N-P-K为16∶5∶9的复合肥50㎏外；另处理1加亩施10公斤胶冻样类芽孢杆菌CCTCC NO:M2014321菌肥，处理2加亩施等量的胶冻样类芽胞杆菌ACCC01429菌肥，处理3加亩按常规施肥，其他管理按常规。
3.试验结果及分析
1)中稻试验考种结果
2)实产结果(单位：公斤)
由以上结果清楚地看出，本发明的胶冻样类芽胞杆菌CCTCC NO:M2014321作为生物肥料用在水稻上能使水稻株高增长5％以上，稻穗长增加4％以上，实粒数增加7％以上，亩产量增加9％以上，且效果明显优于胶冻样类芽胞杆菌ACCC01429。
二.胶冻样类芽胞杆菌的甜瓜田间应用试验
1.试验田选择：试验田为沙泥田，质地中壤，肥力中等，前茬为小白菜，试验前对耕层进行了取土分析，有机质19.816g/kg，碱解氮118mg/kg，有效磷8.3mg/kg，速效钾88mg/kg，PH值为5.3，供试甜瓜品种为津蜜1号。
2.试验设计：
处理1：常规施肥+胶冻样类芽孢杆菌CCTCC NO:M2014321菌肥；
胶冻样类芽孢杆菌CCTCC NO:M2014321菌肥的制备：云母粉与胶冻样类芽胞杆菌菌粉混合成10亿芽胞数/g粉末；
处理2：常规施肥+胶冻样类芽孢杆菌ACCC01429菌肥；
处理3：常规施肥处理；
试验小区面积20平方米，随机排列，四次重复。
试验主要操作：甜瓜移栽前除常规施肥外另处理1加亩基施10公斤胶冻样类芽孢杆菌CCTCC NO:M2014321菌肥，处理2加亩施等量的胶冻样类芽孢杆菌ACCC01429菌肥，处理3加亩按常规施肥，其他管理按常规。
3.试验结果及分析
1)甜瓜生物性状
处理 亩株数 单株着瓜个数 始摘期 单果重(g)
处理1 1800 2.4 6/16 683
处理2 1800 2.3 6/18 655
处理3 1800 2.3 6/18 650
2)甜瓜产量(单位：公斤)
从上述结果可以看出，本发明胶冻样类芽胞杆菌菌株CCTCC NO:M2014321能使甜瓜提前2天成熟，单株着瓜个数多0.1个，单果重量增加5％以上，亩产量增加9％以上。且效果明显优于胶冻样类芽胞杆菌ACCC01429。

Claims (4)

1.一株胶冻样类芽胞杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)高产菌株KN-18，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO∶M2014321。
2.一种培养权利要求1所述胶冻样类芽胞杆菌高产菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)菌种活化：将权利要求1所述胶冻样类芽胞杆菌高产菌株接种至斜面培养基，在温度28℃下培养24小时；
所述的斜面培养基的组成如下：蔗糖5-15％、磷酸氢二钾0.03-2％、二氧化硅0.2-1.5％、硫酸镁0.01-1％、碳酸钙0.05-0.5％、酵母抽提物0.02-0.1％、琼脂粉1.5-2％，pH7.2-7.4；
2)种子培养：在500ml三角瓶中装入50ml液体种子培养基，灭菌，然后把步骤1)得到的活化菌种接至种子培养基中，在32℃、180rpm的条件下培养16-20小时，制得种子液；
所述种子培养基的组成如下：淀粉1.5-2.5％，酵母抽提物0.5-1％、蔗糖0.1-0.5％、磷酸氢二钾0.1-0.5％、碳酸钙0.1-0.5％、二氧化硅0.1-0.5％，pH7.2-7.5；
3)发酵培养：将培养好的种子液取2.5-3ml接入25-30ml发酵培养基中，在32℃、180rpm的恒温摇床中培养40-48小时，得到发酵液；
所述发酵培养基的组成如下：淀粉1.5-2％、酵母抽提物0.5-1％、蔗糖1-2％、酵母粉0.5-1％、磷酸氢二钾0.02-0.05％、硫酸镁0.1-0.2％、碳酸钙0.05-0.1％，pH7.2-7.5。
3.权利要求1所述的胶冻样类芽胞杆菌高产菌株在制备生物肥料中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述生物肥料为生物硅肥。
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