CN117660236A

CN117660236A - 一种解钾胶冻样类芽孢杆菌mssw02及其应用

Info

Publication number: CN117660236A
Application number: CN202311638647.2A
Authority: CN
Inventors: 晏先荣; 蒋羽; 凡登; 谭之磊; 周义新; 陈万阳; 刘琪; 黄杰; 陈艳; 李伟; 焦义能; 黄飞; 邱鸿栓; 张世柏; 周镔
Original assignee: Hubei Maosheng Biology Co ltd
Current assignee: Hubei Maosheng Biology Co ltd
Priority date: 2023-11-30
Filing date: 2023-11-30
Publication date: 2024-03-08

Abstract

本发明提供了一种解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02及其应用，属于胶冻样类芽孢杆菌技术领域。本发明的一株解钾胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)MSSW02，所述解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2023年8月14日，保藏编号为CCTCCNO：M 20231472。本发明的解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02繁殖速度快，具有优异的溶解钾长石粉的能力，利用该菌株制备的解钾菌剂，促进了种子萌芽，提高了植物生长势，并有效改善了土壤环境。

Description

一种解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02及其应用

技术领域

本发明涉及胶冻样类芽孢杆菌技术领域，尤其涉及一种解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02及其应用。

背景技术

钾是农作物生长所必需的营养元素之一，其离子态或可溶性盐类起着催化植物酶促反应、促进植物光合作用进行和蛋白质合成等重要作用。土壤中以钾长石为主的难溶性矿物钾含量丰富，分布广泛，但是据相关研究发现在自然条件下，土壤中矿物钾每年释放的可溶性钾每公顷仅有1kg。特别是化肥的过量施用，造成一些钾被土壤固结。

胶冻样类芽孢杆菌是一种植物根际促生菌(plant growth promotingrhizobacteria，PGPR)，可以通过在土壤中分泌代谢产物分解矿物，促进钾素释放，让土壤中含钾硅酸盐矿物转化为可被作物直接吸收利用的速效钾形态。自身也可分泌激素等物质刺激植物生长，可以改善土壤结构。但现有的胶冻样类芽孢杆菌对钾的转化率较低，这导致在解钾肥料中胶冻样类芽孢杆菌的添加量较高，无疑增加了肥料的生产成本。并且，肥料中微生物过多，可能会破坏土壤原始微生物群落结构，造成土壤营养失衡。因此，提供一种解钾能力强，繁殖速度快的胶冻样类芽孢杆菌，以及解钾产品，对微生物肥料领域的发展和产品推广有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02及其应用。本发明的解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02繁殖速度快，具有优异的溶解钾长石粉的能力，利用该菌株制备的解钾菌剂，促进了种子萌芽，提高了植物生长势，并有效改善了土壤环境。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株解钾胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)MSSW02，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2023年8月14日，保藏编号为CCTCCNO：M20231472。

优选的，所述解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种解钾液态菌剂，所述解钾液态菌剂中包含上述解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02。

优选的，所述解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02的活菌数为(2～5)×10⁹CFU/mL。

本发明还提供了一种上述解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02或上述解钾液态菌剂在土壤解钾中的应用。

本发明提供了一种解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02及其应用。本发明通过菌种筛选和植物促生实验，获得一株可以有效促进小麦生长的解钾胶冻样类芽孢杆菌，该菌株有较快生长速度和稳定性，具有优异的溶解钾长石粉的能力，可将其用于制备解钾液体菌剂以及应用于微生物肥料中。本发明的具有解钾效果的菌株及菌剂产品，可以丰富解钾微生物菌种资源，提供额外的速效钾供应，促进植物细胞的渗透调节能力，有助于作物维持水分平衡，同时促进作物生长，改善土壤理化性质。本发明不仅提高了菌种选育的效率，扩大了菌株的适应范围，而且对于改善环境中作物的生长状态和作物根际环境，对提升微生物肥料的作用效果具有重要意义。

附图说明

图1为解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02在亚历山大罗夫选择性培养基上的菌落形态图。

图2为解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02在显微镜下的形态特征图。

图3为解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02的系统发育树。

保藏说明

解钾胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)MSSW02，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2023年8月14日，保藏编号为CCTCCNO：M 20231472。

具体实施方式

本发明提供了一株解钾胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)MSSW02，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2023年8月14日，保藏编号为CCTCCNO：M 20231472。

在本发明中，所述解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02的16S rDNA序列优选如SEQ IDNO.1所示：

CGACTCACCACTTCGACGGCTGGCCCCTTGCGGGTTACCCCACCGGCTTCGGGTGTTGTAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGACCGGCTTCTAAGGATTCGCTCCATCTCGCGACTTCGCTTCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACTCTAGAGTGCCCAACTCAATGCTGGCAACTAAAGTCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCTCTGTCCCGAAGGAGGACCCTATCTCTAGGGCTTTCAGAGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATACTCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCACTCTTGCGAGCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTATTGTGTTTACTTCGGCACCAAGGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGTCCAGAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCGCTTTCCTCTCCTGCACTCAAGTCTTCCAGTTTCCGGTGCGAACCGGGGTTGAGCCCCGGGCTTAAACACCAGACTTAAAAGACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGACAACGCTTGCCCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGGCTTTCTTCTCAGTACCGTCATTCGCAGAGCAGTTACTCTCCACGACATC。

在本发明中，所述解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02的活菌数优选为(2～5)×10⁹CFU/mL；进一步优选为2×10⁹CFU/mL。

在本发明中，所述解钾液态菌剂的制备方法优选为，将解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02种子液接种于发酵培养基中，发酵，得到所述解钾液态菌剂。

在本发明中，所述发酵培养基，以水为溶剂，优选包括如下浓度的组分：糖蜜(10～15)g/L，K₂HPO₄(0.5～1)g/L，MgSO₄(0.1～0.5)g/L，豆粕(1.0～3.0)g/L，酵母浸粉(0.1～0.3)g/L，MgCl₂(0.1～0.3)g/L；进一步优选包括如下浓度的组分：糖蜜12g/L，K₂HPO₄0.8g/L，MgSO₄0.3g/L，豆粕2.0g/L，酵母浸粉0.2g/L，MgCl₂0.2g/L。

在本发明中，所述解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02种子液的接种量优选为5～10％，进一步优选为8％。

在本发明中，所述发酵的温度优选为35～38℃，进一步优选为37℃。

在本发明中，所述发酵的周期优选为34～40h，进一步优选为36h。

在本发明中，所述发酵过程中的pH优选为7.0～8.0，进一步优选为7.5。

在本发明中，所述发酵过程中的溶氧量优选为20～30％，进一步优选为25％。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实施例提供了一种解钾胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)MSSW02，具体筛选过程如下：

1、菌株筛选

自天津市采集土壤，打钻深度为20cm，去除根系和石块等杂质后充分混匀作为土壤样品，放入冰盒低温保存带回实验室。称取10g采集的土壤样品，加入无菌生理盐水，待土壤样品完全与无菌生理盐水混匀后，静置10min。去上清液，进行梯度稀释，得到10^-2～10^-7稀释梯度的土壤上清悬浮液。吸取200μL稀释梯度为10^-5、10^-6、10^-7的土壤上清悬液涂布于冷却的亚历山大罗夫选择性培养基平板上，每个稀释梯度重复3次。

亚历山大罗夫培养基(1L，以水为溶剂)：蔗糖5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，Na₂HPO₄2.0g，CaCO₃0.1g，FeCl₃0.05g，钾长石粉1.0g，pH 7.4。

将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养48h，挑选在亚历山大罗夫选择性培养基上生长迅速的菌株，继续通过平板划线法进行纯化，获得单菌落后，进行多次传代培养，选取长势依然良好、形态稳定的菌株进行后续实验研究。最终分离得到一株在培养皿上菌落形态为透明、光滑、有粘稠感的菌株(如图1所示)。使用革兰氏染色法对该菌株进行染色观察，该菌株为革兰氏阳性菌，显微镜下菌体呈短杆形(如图2所示)。

2、菌株功能验证

采用四苯硼酸重量法定量测定菌种的解钾能力。

将纯化后的菌株接种到装有5mL灭菌的LB液体培养基的试管中，在37℃、120r/min条件下培养24h，取2mL培养后的菌液，12000r/min离心2min收集菌体，并用无菌水洗涤和悬浮菌体得到菌悬液。将菌悬液以体积分数10％的接种量接种至装有100mL亚历山大罗夫液体培养基的锥形瓶中，然后在37℃、200r/min摇床上培养3d得到发酵液，重复三次，记为实验组1、2、3。以亚历山大罗夫空白液体培养基作为空白对照组CK。实验组发酵液统一用亚历山大罗夫空白培养基调整OD₆₀₀至0.8，使用四苯硼酸重量法测量并计算发酵液中的可溶钾含量。

四苯硼酸钾重量法：在弱碱性介质中，以四苯硼酸钠溶液为沉淀剂与待测液中的钾离子反应，生成白色的四苯硼酸钾沉淀，将沉淀过滤、洗涤、干燥、称重。四苯硼酸钾重量法操作步骤：将得到的发酵液加热煮沸30min，冷却后定量转移到250mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度线，混匀，干过滤。吸取上述滤液25mL，置于烧杯中，加入EDTA溶液20mL，加2滴酚酞溶液，滴加氢氧化钠溶液至红色出现，再过量加入氢氧化钠溶液1mL(完全驱除铵离子)，在良好的通风柜内缓慢加热15min，然后放置冷却至室温。向试样溶液中加入25mL四苯硼酸钠溶液(不断搅拌)，静置20min，过滤于120℃下预先恒重的4号玻璃坩埚式滤器内，用四苯硼酸钠洗涤液洗涤5～7次，每次用量约5mL，最后用水洗涤2次，每次用量5mL。将盛有沉淀的坩埚置于120℃干燥箱干燥1.5h，然后放在干燥器内冷却、称重。根据实验数据以及如下计算公式，计算发酵液中的K₂O含量，记为发酵液中可溶钾含量。

计算公式:

式中，m2—四苯硼酸钾沉淀的质量(g)，m1—空白组四苯硼酸钾沉淀的质量(g)，0.1314—四苯硼酸钾沉淀的质量换算为氧化钾质量的系数，m0—试样质量(g)，25—吸取试样溶液体积的数值(mL)，50—试样溶液总体积的数值(mL)。

记录数据，如表1所示。

表1菌株的生物量(OD₆₀₀值)和可溶钾含量

组别	OD₆₀₀均值	可溶钾含量(mg/L)
			实验组1	0.80	132.8
实验组2	0.80	127.2
			实验组3	0.80	130.5
空白对照组CK	0.0	20.5

从表1可以看出，在调整菌液OD₆₀₀为0.8的情况下，接种MSSW02的发酵液中可溶钾含量可达132.8mg/L，具有优异的溶解钾长石粉的能力。

3、菌株鉴定

将该解钾菌株在LB液体培养基中培养至对数生长期，12000r/min离心2min收集纯培养物，采用宝日医生物技术(北京)有限公司的TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNAExtraction Kit Ver.3.0提取该细菌基因组DNA，然后以其为模板，采用细菌通用鉴定引物(27F/1492R)对16Sr RNA进行PCR扩增。

PCR扩增的反应条件为：①94℃预变性5min；②94℃变性30s，③56℃退火30s，④延伸72℃90s，②～④步骤循环30次，⑤72℃终延伸10min。

PCR扩增的反应体系如表2所示。

表2 PCR扩增的反应体系

将得到的PCR产物进行测序，利用NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的BLAST工具分别将测序结果进行同源性分析，得到与待测物种序列相似性最大的50条同源序列，并利用MEGA11.0软件中的邻接(neighbor-joining，NJ)法构建系统发育树确定菌株种属关系。BLAST比对测序结果表明该菌株为胶冻样类芽孢杆菌Paenibacillusmucilaginosus，命名为MSSW02，系统发育树构建如图3所示。将MSSW02送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址:中国.武汉.武汉大学，保藏日期:2023年08月21日，保藏编号：CCTCCNO：M 20231472。

实施例2

本实施例利用实施例1的解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02制备了一种解钾液态菌剂，具体制备过程如下：

1、种子液的制备

液体种子培养基：蔗糖10g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄0.2g，MgCl₂0.2g，CaCO₃1g，酵母膏0.4g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.2，121℃灭菌20min。

种子发酵工艺条件：取亚历山大罗夫培养基平板上长势好的解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02一环，接种于50mL液体种子培养基中，30℃、160r/min条件下培养24h得到种子液，备用。

2、解钾液态菌剂的制备

发酵培养基(以水为溶剂)：糖蜜12g/L，K₂HPO₄0.8g/L，MgSO₄0.3g/L，豆粕2.0g/L，酵母浸粉0.2g/L，MgCl₂0.2g/L。

发酵工艺条件：发酵温度37℃，初始pH 7.5，种子液接种量为8％。发酵过程中pH控制在7.5，溶氧控制在25％，发酵周期为36h。发酵结束后，得到解钾液态菌剂。采用平板计数法测定解钾液态菌剂中活菌总数，活菌数可达到2×10⁹CFU/mL。

试验例1

本试验例对实施例2制备的解钾液态菌剂的功效进行了验证，验证过程如下：

1、发芽率实验

以津春6号小麦种子为例。选取健康、饱满、大小均匀一致的小麦种子，用蒸馏水冲洗，吸水纸吸尽小麦种子表面浮水。对实施例2中解钾液态菌剂进行梯度稀释，设置10^-2和10^-3两个稀释度为实验组1和实验组2。得到的稀释液所含活菌数分别为2×10⁷CFU/mL和2×10⁶CFU/mL。称取30g小麦种子分别加入100mL对应稀释度的稀释液中，对小麦种子浸种处理12h，每个处理3次重复。以无菌蒸馏水浸种为空白对照组，进行3次重复。

定性滤纸种植：将浸种处理后的小麦种子腹沟朝下均匀放置于培养皿内的滤纸上，每个培养皿中放置20粒小麦种子，在室温下进行发芽试验，根据滤纸的干湿度适量补充水分。

发芽率与发芽势测定：统计每1个培养皿内小麦发芽个数，芽长超过种子长度的1/2作为发芽。

发芽率＝(7d内发芽种子数/供试种子总数)×100％；

发芽势＝(3d内发芽种子数/供试种子总数)×100％；

再培养15d后测定株高、根长。记录数据，如表3所示。

表3浸种处理后小麦种子的生长状况

组别	发芽势(％)	发芽率(％)	根长(cm)	株高(cm)
					空白对照组	85	90	2.4	9.83
实验组1(稀释10^-2)	90	95	4.8	14.1
					实验组2(稀释10^-3)	85	90	4.6	8.9

从表3可以看出，解钾液态菌剂不同浓度下浸种处理的小麦种子发芽势、发芽率生物量等指标均较空白对照组有所提高。

2、盆栽实验

以津春6号小麦为例，采用当地农田土，在长和宽为10cm的塑料花盆中，统一加入农田土按压实至盆口1.5cm处，均匀放入大小基本一致的小麦种子25粒，覆土至花盆口，加入适量的水使各盆栽土壤保持湿度一致，并控制每日每盆浇水量相同。后期每个花盆隔2天浇一次水。

出苗一周后通过浇灌的方式接种MSSW02。接菌时吸取液态菌剂1mL，12000r/min离心2min收集菌体，并用无菌水洗涤，调整其浓度为2×10⁸CFU/ml。用9mL无菌蒸馏水悬浮菌体后再接种5mL至花盆中，每个花盆接种一次，设置5次重复，为实验组。以不接种菌液的盆栽作为空白对照组，以其他市售解钾菌剂产品(胶冻样芽孢杆菌农业种植功能菌，购自北海业盛旺生物科技有限公司)为正对照组，均设置五次重复。

培养条件：室外培养，用蒸馏水浇施，以保持相同的湿度，30天后收成。

播种30天收成后，将花盆内整株小麦小心地全部拔出，将粘在根部的大部分土壤抖掉后，用自来水洗净并用报纸擦干，依次平铺于桌面上，用直尺测量子叶节点到生长点的长度为小麦株高；用直尺测量第三片真子叶的长度作为小麦的叶长。

将小麦植株洗净擦干，统计小麦种子胚部伸长的根数作为其种子根数，以直尺测量小麦根茎结合处到整株植物最长根尖的长度，即种子胚部最长种子根根长作为其最大根长。

将小麦植株洗净擦干后，用天平直接称量(精确到0.01g)测得其鲜重。再将小麦植株于烘箱中烘干处理，100℃烘干至恒重称重，测得其干重。统计各组数据平均值，如表4所示。

表4不同处理对小麦生长性状的影响

不同组别处理小麦幼苗后，每天观察其生长情况，在第15、25和30天记录小麦植物生长情况。从15天生长开始出现差异，在第30天时，实验组和空白对照组的植物生长情况出现明显差别，相比空白对照组，可以明显看出接种含MSSW02菌液处理组具有显著的促进作用。

从表4可以看出，接种MSSW02菌液的小麦，株高、叶长、最大根长、鲜重、干重相较空白对照组都有显著提高，分别提高了15.61％、51.76％、11.20％、34.83％、86.67％。与市售产品相比，MSSW02菌液对小麦的生长性状也有一定提升效果，其中各项分别提升了1.97％、5.74％、5.30％、4.35％、16.67％。

3、土壤理化性质测定实验

土壤理化性质的测定实验分为原土壤、空白对照组、实验组和正对照组，其中，原土壤为盆栽实验中未栽培小麦，且不接种菌液的当地农田土，空白对照组取自盆栽实验中空白对照组小麦收成后的花盆土壤，实验组取自盆栽实验中实验组小麦收成后的花盆土壤，正对照组取自盆栽实验中正对照组小麦收成后的花盆土壤。每组设置5个平行。将土壤自然晾干，过筛后分装至塑封袋。对土壤进行pH、有机质、速效钾的测定，取平均值，结果如表5所示。

土壤中速效钾含量测定：参照NY/T 889-2004《土壤速效钾和缓效钾含量的测定》，称取通过1m孔径筛的风干土试样5g于100mL三角瓶中，加入50.0mL乙酸铵溶液(土液比为1:10)，盖紧瓶塞，在20℃～25℃下，150r/min～180r/min振荡30min，干过滤。滤液直接在火焰光度计上测定。

表5接种MSSW02菌剂对土壤肥力的影响

组别	pH	速效钾含量(mg/kg)	有机质含量(g/kg)
				原土壤	7.5	30.7±0.9	9.3±0.2
空白对照组	7.5	40.7±0.9	15.3±0.2
				实验组	7.4	80.6±1.2	20.5±0.3
正对照组	7.5	76.5±1.0	19.3±0.2

从表5可以看出，菌株接种后的实验组土壤中有机质、速效钾含量均显著高于未接种的原土壤和空白对照组。菌株处理后的实验组土壤与空白对照组相比，速效钾增加98.03％，有机质增加了33.99％。结果表明，施用MSSW02菌剂的效果要优于其他市售解钾产品，其中各项分别提升了5.36％，6.22％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一株解钾胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)MSSW02，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2023年8月14日，保藏编号为CCTCCNO：M 20231472。

2.根据权利要求1所述的解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02，其特征在于，所述解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种解钾液态菌剂，其特征在于，所述解钾液态菌剂中包含权利要求1或2所述的解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02。

4.根据权利要求3所述的解钾液态菌剂，其特征在于，所述解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02的活菌数为(2～5)×10⁹CFU/mL。

5.一种权利要求1或2所述解钾胶冻样类芽孢杆菌MSSW02或权利要求3或4所述解钾液态菌剂在土壤解钾中的应用。