CN117660237A - 一种固氮胶冻样类芽孢杆菌mssw01及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01及其应用，属于固氮胶冻样类芽孢杆菌技术领域。本发明的固氮胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)MSSW01，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2023年8月14日，保藏编号为CCTCCNO：M20231471。本发明的固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01繁殖速度快，固氮能力强，利用该菌株制备的固氮菌剂，促进了种子萌芽，提高了植物生长势，并有效改善了土壤环境。

Description

一种固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01及其应用
技术领域
本发明涉及胶冻样类芽孢杆菌技术领域，尤其涉及一种固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01及其应用。
背景技术
目前，提高作物产量的方式主要依赖外部肥料的投入。在新阶段全球气候变化背景下，长期施用化肥带来的氮排放超标和土地板结，对生态环境破坏巨大。其对生态环境的破坏与污染，严重威胁到农业的可持续发展。
微生物肥料是由有益的含有特殊功能的活的微生物组成的制剂，应用于农业生产具有一定的肥效作用，直接或间接地刺激植物根际的活动，从而改善土壤养分的流动性。其在可持续农业土壤生态系统中起着重要的作用。
胶冻样类芽孢杆菌是一种植物根际促生菌(PGPR)，通过在土壤中分泌代谢产物分解矿物，促进钾等元素的释放，自身也可分泌激素等物质刺激植物生长。并且可以改善土壤结构，提高土壤养分。目前，微生物肥料处于发展起步阶段，市售商品所含菌种良莠不齐，菌剂实际作用难以达到宣传的效果，尤其是固氮肥料。因此，亟需提供一种稳定、固氮效果好的固氮微生物及微生物菌剂产品，以丰富市场上固氮胶冻样类芽孢杆菌商品化菌剂产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01及其应用。本发明的固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01繁殖速度快，固氮能力强，利用该菌株制备的固氮菌剂，促进了种子萌芽，提高了植物生长势，并有效改善了土壤环境。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株固氮胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)MSSW01，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2023年8月14日，保藏编号为CCTCCNO：M20231471。
优选的，所述固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种固氮液态菌剂，所述固氮液态菌剂中包含上述固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01。
优选的，所述固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01的活菌数为(2～5)×109CFU/mL。
本发明还提供了一种上述固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01或上述固氮液态菌剂在土壤固氮中的应用。
本发明提供了一种固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01及其应用。本发明通过菌种筛选和植物促生实验，获得一株可以有效促生植物的固氮胶冻样类芽孢杆菌，其具有较快生长速度和稳定性，能够固定环境中氮素。将其用于制备液体菌剂以及应用于微生物肥料中，可促进种子萌芽，提高植物生长势，改善土壤理化性质。本发明不仅提高了菌种选育的效率，扩大了菌株的适应范围，而且对于改善环境中作物的生长状态和作物根际环境，对提升微生物肥料的作用效果具有重要意义。
附图说明
图1为固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01在Ashby无氮固体培养基上的菌落形态。
图2为固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01在显微镜下的形态特征。
图3为固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01的系统发育树。
保藏说明
固氮胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)MSSW01，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2023年8月14日，保藏编号为CCTCCNO：M 20231471。
具体实施方式
本发明提供了一株固氮胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)MSSW01，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2023年8月14日，保藏编号为CCTCCNO：M20231471。
在本发明中，所述固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01的16S rDNA序列优选如SEQ IDNO.1所示：
NNNNNCNNCCACCTTCGACGGCTGGCCCCCTTGCGGGTTACCCCACCGGCTTCGGGTGTTGTAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGACCGGCTTCTAAGGATTCGCTCCATCTCGCGACTTCGCTTCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACTCTAGAGTGCCCAACTCAATGCTGGCAACTAAAGTCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCTCTGTCCCGAAGGAGGACCCTATCTCTAGGGCTTTCAGAGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATACTCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCACTCTTGCGAGCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTATTGTGTTTACTTCGGCACCAAGGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGTCCAGAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCGCTTTCCTCTCCTGCACTCAAGTCTTCCAGTTTCCCGGTGCGAACCGGGGTTGAGCCCCGGGCTTAAACACCAGACTTAAAAGACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGGCTTTCTTCTCAGGTACCGTCATCGCAGAGCAGTACTCTCACGACGNTCTTCCCTGGCAACAGGAGCTTTACGATCCGAAAACTTCATCACTCACGCGGGCGTGCTCGTCAGGCTTGCG。
本发明还提供了一种固氮液态菌剂，所述固氮液态菌剂中包含上述固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01。
在本发明中，所述固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01的活菌数优选为(2～5)×109CFU/mL；进一步优选为2×109CFU/mL。
在本发明中，所述固氮液态菌剂的制备方法优选为，将固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01种子液接种于发酵培养基中，发酵，得到所述固氮液态菌剂。
在本发明中，所述发酵培养基，以水为溶剂，优选包括如下浓度的组分：糖蜜(10～15)g/L，K2HPO4(0.5～1)g/L，MgSO4(0.1～0.5)g/L，豆粕(1.0～3.0)g/L，酵母浸粉(0.1～0.3)g/L，MgCl2(0.1～0.3)g/L；进一步优选包括如下浓度的组分：糖蜜12g/L，K2HPO40.8g/L，MgSO40.3g/L，豆粕2.0g/L，酵母浸粉0.2g/L，MgCl20.2g/L。
在本发明中，所述固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01种子液的接种量优选为5～10％，进一步优选为8％。
在本发明中，所述发酵的温度优选为35～38℃，进一步优选为37℃。
在本发明中，所述发酵的周期优选为34～40h，进一步优选为36h。
在本发明中，所述发酵过程中的pH优选为7.0～8.0，进一步优选为7.5。
在本发明中，所述发酵过程中的溶氧量优选为20～30％，进一步优选为25％。
本发明还提供了一种上述固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01或上述固氮液态菌剂在土壤固氮中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种固氮胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)MSSW01，具体筛选过程如下：
1、菌株筛选
自天津市采集土壤，打钻深度为20cm，去除根系和石块等杂质后充分混匀作为土壤样品，放入冰盒低温保存带回实验室。称取10g采集的土壤样品，加入无菌生理盐水，待土壤样品完全与无菌生理盐水混匀后，静置10min。去上清液，进行梯度稀释，得到10-2～10-7稀释梯度的土壤上清悬浮液。吸取200μL稀释梯度为10-5、10-6、10-7的土壤上清悬液涂布于冷却的Ashby无氮培养基平板上，每个稀释梯度重复3次。
Ashby无氮培养基(1L，以水为溶剂)：甘露醇10g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.2g，CaCO35g，CaSO4·H2O 0.5g，琼脂10g。
将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养48h，挑选在Ashby无氮固体培养基上生长迅速的菌株，继续通过平板划线法进行纯化，获得单菌落后，进行多次传代培养，选取长势依然良好、形态稳定的菌株进行后续实验进行研究。最终分离得到一株在培养皿上菌落形态为圆形、中间凸起、透明、光滑、有光泽的菌株(如图1所示)。使用革兰氏染色法对该菌株进行染色观察，革兰氏染色结果为阳性，显微镜下菌体呈短杆形(如图2所示)。
2、菌株功能验证
选用凯氏定氮法，定量测定该菌株的固氮能力。凯氏定氮法原理：在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的含氮量。
将纯化后的菌株接种到装有5mL灭菌的LB液体培养基的试管中，在37℃、120r/min条件下培养24h。取2mL培养后的菌液，12000r/min离心2min收集菌体，并用无菌水洗涤和悬浮菌体得到菌悬液。将菌悬液以体积分数10％的接种量接种至装有100mL Ashby无氮液体培养基的锥形瓶中，然后在37℃、200r/min摇床上培养3d得到发酵液，重复三次，记为实验组1、2、3。以Ashby无氮空白液体培养基作为空白对照组CK。实验组发酵液统一用Ashby无氮空白液体培养基调整OD600至0.8，经过上述步骤，通过自动凯氏定氮仪测量并计算发酵液中的含氮量，记录数据，如表1所示。
表1菌株的生物量(OD600值)和固氮量
组别 OD600均值 固氮量(mg/L)
实验组1 0.80 156.8
实验组2 0.80 143.9
实验组3 0.80 146.8
空白对照组CK 0.00 24.4
从表1可以看出，在调整发酵液OD600为0.8的情况下，接种MSSW01的培养液中含氮量大大增加，最大含氮量可达到156.8mg/L，说明该菌株具有良好的固氮效果。
3、菌株鉴定
将该菌株在LB液体培养基中培养至对数生长期，12000r/min离心2min收集纯培养物，采用宝日医生物技术(北京)有限公司的TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNAExtraction Kit Ver.3.0提取该细菌基因组DNA，然后以其为模板，采用细菌通用鉴定引物(27F/1492R)对16SrRNA进行PCR扩增。
PCR扩增的反应条件为：①94℃预变性5min；②94℃变性30s，③56℃退火30s，④延伸72℃90s，②～④步骤循环30次，⑤72℃终延伸10min。
PCR扩增的反应体系如表2所示。
表2 PCR扩增的反应体系
试剂 体积/μL
2×phanta Max Buffer 10
Dntp Mixture 0.4
模板DNA 0.4
上游引物 0.8
下游引物 0.8
Phanta Max super-fidelity DNA Polymerase 0.4
DMSO 0.8
ddH2O 6.4
total 20
将得到的PCR产物进行测序，利用NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的BLAST工具分别将测序结果进行同源性分析，得到与待测物种序列相似性最大的50条同源序列，并利用MEGA11.0软件中的邻接(neighbor-joining，NJ)法构建系统发育树确定菌株种属关系。BLAST比对测序结果表明该菌株为胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)，命名为MSSW01，系统发育树构建如图3所示。将MSSW01送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址:中国武汉.武汉大学，保藏日期:2023年08月21日，保藏编号：CCTCC NO：M 20231471。
实施例2
本实施例利用实施例1的固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01制备了一种固氮液态菌剂，具体制备过程如下：
1、种子液的制备
液体种子培养基：蔗糖10g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，MgCl2 0.2g，CaCO3 1g，酵母膏0.4g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.2，121℃灭菌20min。
种子发酵工艺条件：取Ashby无氮培养基平板上长势好的固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01一环，接种于50mL液体种子培养基中，30℃、160r/min条件下培养24h得到种子液，备用。
2、固氮液态菌剂的制备
发酵培养基：糖蜜12g/L，K2HPO40.8g/L，MgSO40.3g/L，豆粕2.0g/L，酵母浸粉0.2g/L，MgCl20.2g/L。
发酵工艺条件：发酵温度37℃，初始pH 7.5，种子液接种量为8％。发酵过程中pH控制在7.5，溶氧控制在25％，发酵周期为36h。发酵结束后，得到固氮液态发酵菌剂。采用平板计数法测定发酵液中活菌总数，活菌数可达到2×109CFU/mL。
试验例1
本试验例对实施例2制备的固氮液态菌剂的促生效果进行了验证，验证过程如下：
1、发芽率实验
以津春6号小麦种子为例。选取健康、饱满、大小均匀一致的小麦种子，用蒸馏水冲洗，吸水纸吸尽小麦种子表面浮水。对实施例2中固氮液态菌剂进行梯度稀释，设置10-2和10-3两个稀释度为实验组1和实验组2。得到的稀释液所含活菌数分别为2×107CFU/mL和2×106CFU/mL。称取30g小麦种子分别加入100mL对应稀释度的稀释液中，对小麦种子浸种处理12h，每个处理3次重复。以无菌蒸馏水浸种为空白对照组，进行3次重复。
定性滤纸种植：将浸种处理后的小麦种子腹沟朝下均匀放置于培养皿内的滤纸上，每个培养皿中放置20粒小麦种子，在室温下进行发芽试验，根据滤纸的干湿度适量补充水分。
发芽率与发芽势测定：统计每1个培养皿内小麦发芽个数，芽长超过种子长度的1/2作为发芽。
发芽率＝(7d内发芽种子数/供试种子总数)×100％；
发芽势＝(3d内发芽种子数/供试种子总数)×100％；
再培养15d后测定株高、根长。记录数据，如表3所示。
表3浸种处理后小麦种子的生长状况
组别 发芽势(％) 发芽率(％) 根长(cm) 株高(cm)
空白对照组 85 90 2.4 9.83
实验组1(稀释10-2) 85 95 4.5 15.8
实验组2(稀释10-3) 90 95 4.4 10.4
从表3可以看出，固氮液态菌剂不同用量下浸种处理的小麦种子发芽势、发芽率及生物量等指标均较空白对照组有显著提高。表明，本发明的固氮液态菌剂对小麦种子萌芽具有促进作用。
2、盆栽实验
以小麦为例，采用当地农田土，在长和宽为10cm的塑料花盆中，统一加入农田土按压实至盆口1.5cm处，均匀放入大小基本一致的小麦种子25粒，覆土至花盆口，加入适量的水使各盆栽土壤保持湿度一致，并控制每日每盆浇水量相同。后期每个花盆隔2天浇一次水。
出苗一周后通过浇灌的方式接种MSSW01菌液。接菌时吸取固氮液态菌剂1mL，12000r/min离心2min收集菌体，并用无菌水洗涤，调整其浓度为2×108CFU/ml。用9mL无菌蒸馏水悬浮菌体后再接种5mL至花盆中，每个花盆接种一次，设置5次重复，为实验组。以不接种菌液的盆栽作为空白对照组，以其他市售固氮菌剂产品(枯草芽孢杆菌农业种植专用(全水溶)，购自广西康绿生物科技有限公司)为正对照组，均设置五次重复。
培养条件：室外培养，用蒸馏水浇施，以保持相同的湿度，30天后收成。
播种30天收成后，将花盆内整株小麦小心地全部拔出，将粘在根部的大部分土壤抖掉后，用自来水洗净并用报纸擦干，依次平铺于桌面上，用直尺测量子叶节点到生长点的长度为小麦株高；用直尺测量第三片真子叶的长度作为小麦的叶长。
将小麦植株洗净擦干，统计小麦种子胚部伸长的根数作为其种子根数，以直尺测量小麦根茎结合处到整株植物最长根尖的长度，即种子胚部最长种子根根长作为其最大根长。
将小麦植株洗净擦干后，用天平直接称量(精确到0.01g)测得其鲜重。再将小麦植株于烘箱中烘干处理，100℃烘干至恒重称重，测得其干重。统计各组数据平均值，如表4所示。
表4不同处理对小麦生长性状的影响
不同组别处理小麦幼苗后，每天观察其生长情况，在第15、25和30天记录小麦植物生长情况。从15天生长开始出现差异，在第30天时，实验组和空白对照组的植物生长情况出现明显差别，相比空白对照组，可以明显看出接种含菌株MSSW01菌液处理组具有显著的促进作用。
从表4可以看出，接种含菌株MSSW01菌液的小麦，株高、叶长、最大根长、鲜重、干重相较空白对照组有显著提高，分别提高了17.58％、46.32％、12.17％、37.84％、93.33％。MSSW01菌液对小麦的生长性状的提升效果也高于其他市售产品，其中各项分别提升了5.25％、5.3％、3.20％、4.00％、20.83％。
3、土壤理化性质测定实验
土壤理化性质的测定实验分为原土壤、空白对照组、实验组和正对照组，其中，原土壤为盆栽实验中未栽培小麦，且不接种菌液的当地农田土，空白对照组取自盆栽实验中空白对照组小麦收成后的花盆土壤，实验组取自盆栽实验中实验组小麦收成后的花盆土壤，正对照组取自盆栽实验中正对照组小麦收成后的花盆土壤。每组设置5个平行。将土壤自然晾干，过筛后分装至塑封袋。对土壤进行pH、有机质、总氮的测定，取平均值，结果如表5所示。
土壤中总氮含量测定原理：在硫代硫酸钠、浓硫酸、高氯酸和催化剂的作用下，经氧化还原反应全部转化为铵态氮。消解后的溶液碱化蒸馏出的氨被硼酸吸收，用标准盐酸溶液滴定，根据标准盐酸溶液的用量来计算土壤中总氮含量。
表5接种MSSW01菌剂对土壤肥力的影响
组别 pH 总氮含量(mg/kg) 有机质含量(g/kg)
原土壤 7.5 15.7±0.9 9.3±0.2
空白对照组 7.5 21.7±0.9 18.3±0.2
实验组 7.4 50.6±1.2 23.4±0.3
正对照组 7.5 48.5±1.0 21.5±0.2
从表5可以看出，菌株接种后的实验组土壤中有机质、总氮含量均显著高于未接种的原土壤和空白对照组。菌株处理后的实验组土壤与空白对照组相比，总氮增加133.18％，有机质增加了27.87％。结果表明，施用MSSW01菌液后的效果要优于其他市售固氮产品，各项分别提升了11.35％、8.84％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一株固氮胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillusmucilaginosus)MSSW01，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为：2023年8月14日，保藏编号为CCTCCNO：M20231471。
2.根据权利要求1所述的固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01，其特征在于，所述固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种固氮液态菌剂，其特征在于，所述固氮液态菌剂中包含权利要求1或2所述的固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01。
4.根据权利要求3所述的固氮液态菌剂，其特征在于，所述固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01的活菌数为(2～5)×109CFU/mL。
5.一种权利要求1或2所述固氮胶冻样类芽孢杆菌MSSW01或权利要求3或4所述固氮液态菌剂在土壤固氮中的应用。
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