CN107568061B

CN107568061B - 一种促进丹参毛状根迷迭香酸积累的方法

Info

Publication number: CN107568061B
Application number: CN201710683297.XA
Authority: CN
Inventors: 郭万里; 张慕罄; 梁宗锁; 杜旭红; 向倩倩; 杨佳瑶; 杨宗岐
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2017-08-11
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2037-08-11
Also published as: CN107568061A

Abstract

本发明涉及一种促进丹参毛状根迷迭香酸积累的方法，属于以植物生长调节剂对植物组织培养技术领域。将丹参毛状根接种到6,7‑V液体培养基中继代培养后，向其内加入NEM进行旁路抑制处理，处理完毕后继续培养即可，所述的旁路抑制处理中，0＜NEM添加浓度≤10mg/L，且处理效果随着处理时长的递增，促进效果越好。将发明应用于丹参有效成分的培养，可抑制木质素途径，并使丹参毛状根的生物积累量达到最大。

Description

一种促进丹参毛状根迷迭香酸积累的方法

技术领域

本发明涉及一种促进丹参毛状根迷迭香酸积累的方法，属于以植物生长调节剂对植物组织培养技术领域。

背景技术

临床医药有一部分重要的资源来自植物的次生代谢物。所以，很多研究者集中研究植物的次生代谢物，阐明其机理，使植物的次生代谢物应用于医药行业以及天然产物开发方面。丹参(Salviamiltiorrhiza Bunge)为我国的传统非常重要的大宗药材之一，丹参的次生代谢物丹参酮类和丹酚酸类具有活血祛瘀，清热安神、养血益气之功效，已经广泛应用于冠心病、心肌梗塞、心绞痛和心肌缺血等疾病的预防和治疗，研究植物的生物合成途径，阐明代谢途径的调控机理为药用植物扩大生产，开发利用，应用于医疗化工行业开拓了广泛的路径。近年来在中国以及其他国家包括美国，多项基于丹参的研究在治疗心血管病人方面取得重要进展。

丹参水溶性成分主要是酚酸类物质，包括丹酚酸B(LAB)、迷迭香酸(RA)、丹参素(DSU)、阿魏酸(ferulicacid)、咖啡酸(caffeicacid)、肉桂酸(cinnamicacid)等。现代药理学研究表明，在心脑血管治疗方面，酚酸类有一定的疗效，可以清除氧自由基，改善血管微循环作用，还能抗菌抗炎、治疗动脉粥样硬化、肝损伤。

富集关键有效成分是生物合成领域中的研究热点和难点之一。丹酚酸生物合成非常复杂，采用旁路抑制策略来改变代谢流是提高特定有效成分积累的有效途径之一。然而，就本领域而言，除了采用基因来抑制丹参酚酸生物合成旁路的尝试外，并没有采用旁路抑制剂来研究丹参酚酸生物合成途径的报道。

基于此，做出本申请。

发明内容

针对丹参酚酸合成中所存在的上述缺陷，本申请提供一种通过旁路抑制，促进丹参毛状根迷迭香酸积累的方法。

为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：

一种促进丹参毛状根迷迭香酸积累的方法，将丹参毛状根接种到6,7-V液体培养基中继代培养后，向其内加入NEM进行旁路抑制处理，处理完毕后继续培养即可，所述的旁路抑制处理中，0＜NEM添加浓度≤10mg/L，且处理效果随着处理时长的递增，促进效果越好。

进一步的，作为优选：

所述的NEM添加浓度≤0.5mg/L或者1-5mg/L。更优选的，所述的NEM添加浓度为0.5mg/L或2.5mg/L。

所述的处理时长为4-240h。更优选的，所述的处理时长为24-144h。

所述的继代培养在恒温摇床上进行，培养温度为25±1℃，转速110rpm，暗培养。

所述的继代培养时间为25天，继代培养18天时向其内添加抑制剂NEM进行处理。

所述的6,7-V培养基由大量溶液、微量溶液、铁盐、氯化钙、盐酸、肌酸、盐酸硫胺、吡多素和蔗糖构成，每升中的配方构成为：

所述的每升大量溶液中，

所述的每升微量溶液中，

所述的铁盐溶液中，

七水合硫酸铁 0.556g，

二乙胺四乙酸二钠 0.746g。

所述的6,7-V培养基的pH为5.8，pH与细胞内环境有关，在该pH值下离体植物组织生长最佳。

所述NEM处理后培养所得毛状根有效物质的检测方法为：取样→清洗→冷冻干燥→磨碎，甲醇提取→超声处理→离心，取上清液，进行检测起有效成分，其中，所述的磨碎至可过0.45mm筛孔，提取用甲醇体积浓度为70％，超声处理过程中采用间断颠倒混合处理。

丹参中酚酸类成分在结构上具有相似性，并且酚酸类成分主要是在迷迭香酸结构上衍生得到的，所以迷迭香酸(RA)代谢途径是合成丹参水溶性酚酸的主要途径。迷迭香酸的代谢途径中包括两条平行支路途径。一条为苯丙氨酸(phenylpropanoid)另一条为酪氨酸(tyrosine-derived)：肉桂酸是由苯丙氨酸在PAL催化作用下生成的，接着C4H催化肉桂酸使其生成4-香豆酸，在4CL作用下，4-香豆酸可以生成4-香豆酰CoA，4-香豆酰CoA是苯丙氨酸支路的产物；在酪氨酸支路中，4-羟基苯乳酸是通过TAT以及HPPR催化得到的，迷迭香酸合酶(RAS)作用4-羟基苯乳酸，细胞色素P450蛋白CYP98A14催化4-香豆酰CoA可以得到迷迭香酸；而丹酚酸B的代谢途径还不是很清楚；丹参毛状根被银离子诱导实验中证明迷迭香酸作为前体物质可以合成丹酚酸B。

N-乙基马来酰亚胺(N-Ethylmaleimide，NEM)，分子式为C₆H₇NO₂，分子量125，是一种巯基蛋白酶抑制剂，能抑制木质素合成途径中关键酶肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase，CCR酶)。在木质素途径中，4-香豆酰辅酶A在CCR的作用下生成香豆醛，从而合成H-木质素。木质素生物合成途径是丹酚酸类生物合成的旁路。

本申请采用木质素生物合成抑制剂(NEM)来处理丹参毛状根，抑制木质素的代谢流，增加丹酚酸生物合成的代谢流，通过检测丹酚酸类的积累规律来研究旁路抑制剂对丹酚酸类代谢物生物合成的影响机制。

附图说明

图1为不同浓度NEM对丹参毛状根生物量的影响(FW：fresh weight，鲜重，每组4个生物学重复，*表示P<0.05，差异性显著；**表示P<0.01)；

图2为不同浓度NEM处理下咖啡酸的含量曲线图(每组3个生物学重复，*表示P<0.05，差异性显著；**表示P<0.01，差异性极显著)；

图3为不同时间NEM处理对丹参毛状根生物量的影响(每组4个生物学重复，*表示P<0.05，差异性显著；**表示P<0.01)；

图4为不同时间处理下咖啡酸的含量柱状对比图(每组3个生物学重复，*表示P<0.05，差异性显著；**表示P<0.01，差异性极显著)；

图5为不同处理时间下迷迭香酸的含量柱状对比图(每组3个生物学重复，*表示P<0.05，差异性显著；**表示P<0.01，差异性极显著)；

图6为不同处理时间下丹酚酸B的含量柱状对比图(每组3个生物学重复，*表示P<0.05，差异性显著；**表示P<0.01，差异性极显著)。

具体实施方式

本例实施一种促进丹参毛状根迷迭香酸积累的方法，将丹参毛状根接种到6,7-V液体培养基中继代培养后，向其内加入NEM进行旁路抑制处理，处理完毕后继续培养即可。

其中，旁路抑制处理中，0＜NEM添加浓度≤10mg/L，且处理效果随着处理时长的递增，促进效果越好。具体分析如下：

1.方法

1)利用丹参毛状根培养悬浮培养方法，使用在6,7-V培养基中继代培养的毛状根作为研究材料，取长势良好且均一相同的毛状根0.5g，将其接种到100mL的6,7-V液体培养基中，放在恒温摇床上震荡培养。设定条件如下温度25℃，110rpm，暗培养。

2)设置NEM不同梯度浓度，NEM终浓度分别为0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L，在第25天进行丹参毛状根生物量和咖啡酸的检测；根据NEM的最适浓度来筛选最适时间，在最适浓度下测定NEM处理后不同时间点的生物量和丹酚酸类代谢物；在丹参毛状根培养第18天时用0.5mg/L的NEM处理毛状根，分别在4h、12h、24h、3d、6d取材，测定生物量。

3)提取毛状根的有效成分：用清水将毛状根洗净后，在冷冻干燥机中进行干燥，磨碎后过0.45mm筛，精密称取0.02g，之后加入2mL70％甲醇提取液，用超声处理60min，(此过程需要间断颠倒混合)，然后10min 8000rpm离心，取上清液。

4)本实施例中丹参毛状根有效成分的检测采用高效液相法，二元高效液相色谱仪Waters1525，色谱柱为WatersSunFireC18(250mm×4.6mm，5μm)，采用Waters2996二极管阵列检测器，Empower2数据采集软件对数据进行采集。色谱条件为：水和乙腈为流动相，梯度洗脱：0至10min为5-20％乙腈、10至15min为20-25％乙腈、15至20min为25％乙腈、20至25min为25-20％乙腈、25至28min为20-30％乙腈、28至40min为30％乙腈、40至45min为30-45％乙腈、45至58min为45-58％乙腈、58至67min为58-50％乙腈、67至70min为50-60％乙腈、70至80min为60-65％乙腈、80至85min为65-95％乙腈、85至95min为95％的乙腈、95至96min为95-5％乙腈。每分钟1mL的流速，柱子温度为30℃，所需要的上样体积为10μL。酚酸类检测波长为280nm。

2.材料与试剂的配制

2.1材料与仪器

1)材料：新鲜的丹参毛状根，在25℃，110rpm下培养的丹参毛状根，由本实验室创造和提供。硫酸铵，硫酸镁，氯化钾，磷酸氢二钠，硝酸钾，二水合磷酸二氢钠，氯化钾，硼酸，二水合硫酸锰，二水合锰酸钠，五水合硫酸铜，六水合氯化钴，四水合硫酸锌，七水合硫酸铁，二乙胺四乙酸二钠，氯化钙，烟酸，肌醇，盐酸硫胺，吡多素，蒸馏水，1mol/mL氢氧化钠，1mol/mL盐酸。NEM粉末，NTBC粉末，二甲基亚砜，磷酸缓冲盐，蔗糖，甲醇。

2)器材：烧杯、量筒、容量瓶、称量纸、玻璃棒、滤纸、电子天平、称量纸、250mL锥形瓶、封口膜、恒温摇床、超净工作台、培养皿、滤纸、2mL离心管、移液器枪头、冷冻干燥机、1.5mL离心管、-80℃冰箱、超声仪、浮漂、离心机、滤膜，高效液相色谱仪。

2.2试剂配制

1L 6,7-V培养基配方(pH5.8)

1)6，7-V培养基

2)10mg/mL NEM母液的配置：精密称取NEM 1.00g，加上80mL的蒸馏水溶解，用100mL容量瓶定容，在超净工作台中进行无菌操作，分装到1.5mL的离心管中，保存到-20℃冰箱。

3)70％的甲醇配置：将70mL的甲醇溶液融入到30mL的蒸馏水中，搅拌使其充分混合，用100mL容量瓶定容。

4)磷酸缓冲液(浓度：0.026mM)配置：将260μL的磷酸溶液(0.1M)加入到1000mL容量瓶中，抽滤过的一级纯水定溶。

3.丹参毛状根的液体培养

1)配置1.5L的6,7-V液体培养基，分装到10瓶250mL的锥形瓶中，每瓶100mL，灭菌(115℃，15min)。

2)准备两组培养皿，每组10个，其中一组需在培养皿中放入三层滤纸，灭菌(121℃，20min)。

3)选取长势良好的同一批丹参毛状根，在超净工作台中进行无菌操作，每瓶接0.5g毛状根。

4.最适浓度筛选

4.1NEM最适浓度筛选

1)配置3.5L的6,7-V液体培养基，分装到6瓶500mL的锥形瓶中，每瓶500mL，灭菌(115℃，15min)。

2)准备两组培养皿，每组10个，其中一组需在培养皿中放入三层滤纸；准备30瓶250mL锥形瓶，100mL量筒灭菌(121℃，20min)。

3)在超净工作台中进行分装操，NEM设置的梯度浓度为0mg/L，0.5mg/L，1mg/L，2.5mg/L，5mg/L，10mg/L，每个浓度设置5个生物学重复。

4)选取同一批继代培养中长势良好且均一的丹参毛状根，在超净工作台中进行无菌操作，每瓶接0.5g毛状根，放入恒温摇床培养，25天后取材，材料保存在-80℃冰箱，后检测它们的生物量和咖啡酸含量。

咖啡酸与迷迭香酸的含量呈正相关关系，根据NEM不同浓度下生物量(F_W，图1)和咖啡酸含量(图2)变化趋势进行筛选，NEM处理的最佳浓度为0.5mg/L，在此浓度下，能促进毛状根的生长，咖啡酸的含量也达到最大值。其中，图1中出现先高后低再高然后再低属于实验波动性，在试验中为正常现象，不影响整体趋势。

4.2NEM处理毛状根

1)配置2.5L的6,7-V液体培养基，分装到20瓶250mL的锥形瓶中，每瓶100mL，灭菌(115℃，15min)。

3)选取继代培养中长势良好且均一的丹参毛状根，在超净工作台中进行无菌操作，每瓶接0.3g毛状根，放入恒温摇床培养。

4)在最适浓度NEM为0.5mg/L的条件下筛选最适时间。待丹参毛状根在恒温摇床培养18天时，加入0.5mg/L的NEM。分别在4h、12h、24h、3d、6d取材，材料保存在-80℃冰箱，然后分别检测不同时间点材料的生物量和酚酸类成分。

4.3丹酚酸类物质的提取

1)将上述保存在-80℃冰箱中的材料放在冷冻干燥机中进行2天左右的冷冻干燥。

2)磨碎后过0.45mm筛，精密称取0.02g，之后加入2mL70％甲醇提取液，用超声处理60min，(此过程需要间断颠倒混合)，然后10min 8000rpm离心，取上清液。

4.4有效成分的检测

采用高效液相法检测，条件设置同上。

4.5数据统计

方法采用Excel表格绘制曲线图，柱状图。误差棒根据每组数据的4个生物学重复所做。p值根据样本组与对照组差异性所做。Excel中Z值计算公式为NORMSINV(1-α/2)，p值＝(1-NORMSDIST(Z值))*2。

5.结果与讨论

5.1不同浓度NEM对丹参毛状根生物量的影响

如图1所示，与对照组相比，浓度为0.5mg/L，丹参毛状根生物量有明显的上升，在1mg/L时急速下降，NEM浓度为2.5mg/L时有一段上升，之后的5mg/L，10mg/L，呈直线下降，但总体是下降趋势。所以，综合图表规律，NEM在浓度为0.5mg/L处理下，丹参毛状根生物量达到最大，是最适处理浓度。而当NEM浓度大于2.5mg/L，丹参毛状根的生物量呈下降趋势，说明在一定范围内，高浓度NEM会对丹参毛状根的生长起抑制作用。

另外，在检测咖啡酸(图2)时，在NEM为0.5mg/L的时候，相比于其它处理浓度，咖啡酸的含量达到最大，达到显著水平(P<0.01)，说明0.5mg/L即最适浓度下可以使咖啡酸相较于其他浓度显著积累。综上所述，NEM在低浓度时，促进咖啡酸的累积且NEM为0.5mg/L是最佳的处理浓度。

5.4NEM处理下丹参毛状根生物量随培养时间的变化

处理效果是随着时间的延长而递增，处理对象继代后18天进行NEM处理，在这个实验过程中，在第6天代谢物等会达到最大，其后衰减，然后再过9天培养液中成分耗尽，毛状根整体状态变差。

如图3所示，在最适NEM浓度为0.5mg/L的时候，促进丹参毛状根的生长，验证了前面的实验，同时，第6天丹参毛状根的生物量达到最大(P<0.05)，达到显著水平，远远高于同期的对照组。这些说明适当延长NEM的处理时间对丹参毛状根的生长有促进作用。

5.5NEM处理下丹参毛状根中酚酸类成分的变化

如图4、5和6，分别检测咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B的含量，在第6天的时候，咖啡酸积累量显著增加(P<0.01)。说明，0.5mg/L的NEM处理6天丹参毛状根可以有效促进咖啡酸的积累。同样，迷迭香酸的积累量也显著增加(P<0.01)。然而，丹酚酸B积累量波动较大，不能判断其积累的规律。综上所述，NEM处理可以促进咖啡酸和迷迭香酸的积累。

本申请通过旁路抑制的手段富集丹参酚酸类有效成分迷迭香酸。我们先对丹参生物合成途径中旁路途径进行研究，通过不同浓度的N E M处理丹参毛状根，检测丹参毛状根的生物量和咖啡酸来确定最适浓度；进而在最适浓度的条件下进行不同时间点的取材；最后分别检测不同时间处理后丹参毛状根中有效成分酚酸类物质的含量。实验表明，NEM在最适浓度0.5mg/L的时候可以有效的促进迷迭香酸和咖啡酸的积累量，并且随着时间的增加，效果越显著。说明NEM可能抑制木质素途径中CCR酶的活性，从而抑制木质素途径，降低其代谢流，进而促进苯丙氨酸支路中酚酸类生物合成的代谢流。结果显示，NEM可以促进迷迭香酸、咖啡酸的积累，但对丹酚酸B的累积效应不明显。同时，通过本申请，首次发现并验证：少量NEM能促进毛状根的生物积累量。

以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。

Claims

1.一种促进丹参毛状根迷迭香酸积累的方法，其特征在于：将丹参毛状根接种到改良的6,7-V培养基中继代培养后，向其内加入NEM进行旁路抑制处理；处理完毕后继续培养即可，所述的旁路抑制处理中，0＜NEM添加浓度≤5mg/L，处理时长为4-240h，且处理效果随着处理时长的递增，促进效果越好，

改良的6,7-V培养基由大量溶液、微量溶液、铁盐、氯化钙、盐酸、肌酸、盐酸硫胺、吡多素和蔗糖构成，每升中的配方构成为：

大量溶液 10 mL，

微量溶液 10 mL，

铁盐溶液 10 mL，

氯化钙 2.2 mL，

盐酸 1 mL，

肌醇 2 mL，

盐酸硫胺 1 mL，

吡多素 1 mL，

蔗糖 30 g；

所述的大量溶液，其每升的配方构成为：

硫酸铵 10 g，

硫酸镁 12 g，

氯化钾 20 g，

磷酸氢二钠 2 g，

硝酸钾 80 g，

二水合磷酸二氢钠 16.95 g；

所述的微量溶液，其每升的配方构成为：

氯化钾 0.005 g，

硼酸 0.5 g，

二水合硫酸锰 0.341 g，

二水合锰酸钠 0.025 g，

五水合硫酸铜 0.025 g，

六水合氯化钴 0.025 g

四水合硫酸锌 0.228 g；

所述的铁盐溶液中，

七水合硫酸铁 0.556 g，

二乙胺四乙酸二钠 0.746 g。

2.根据权利要求1所述的一种促进丹参毛状根迷迭香酸积累的方法，其特征在于：所述的NEM添加浓度为0.5mg/L或2.5mg/L。

3.根据权利要求1所述的一种促进丹参毛状根迷迭香酸积累的方法，其特征在于：所述的处理时长为24-144h。

4.根据权利要求1所述的一种促进丹参毛状根迷迭香酸积累的方法，其特征在于：所述的继代培养在恒温摇床上进行，培养温度为20-28℃，转速90-150rpm，暗培养。

5.根据权利要求1所述的一种促进丹参毛状根迷迭香酸积累的方法，其特征在于：所述的继代培养时间为9-25天，继代培养结束时，向其内添加NEM进行旁路抑制处理。

6.根据权利要求1所述的一种促进丹参毛状根迷迭香酸积累的方法，其特征在于：所述NEM处理后培养所得毛状根有效物质的检测方法为：取样→清洗→冷冻干燥→磨碎，甲醇提取→超声处理→离心，取上清液，进行检测起有效成分，其中，所述的磨碎至可过0.45mm筛孔，提取用甲醇体积浓度为70%，超声处理过程中采用间断颠倒混合处理。

7.根据权利要求1-6任一项所述的一种促进丹参毛状根迷迭香酸积累的方法，其特征在于：所述改良的6,7-V培养基的pH为5.8。