CN104472363A - 促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸b积累的诱导法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B积累的诱导法，包括以下步骤：1)、丹参毛状根的初培养：在每100mL的6,7-V培养基中接种0.3～0.4g丹参毛状根，于100～150rpm、24～26℃的培养条件下黑暗培养17～19天；2)、丹参毛状根的继续培养：然后添加5-氮杂胞苷溶液，使6,7-V培养基中5-氮杂胞苷的终浓度为9～11μM；于100～150rpm、24～26℃的培养条件下黑暗培养5～7天。本发明通过使用5-氮杂胞苷处理丹参毛状根，从而促进丹参毛状根中次生代谢产物迷迭香酸和丹酚酸B的积累。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B积累的诱导法。
背景技术
丹参(Salvia miltiorrhiza)为唇形科植物丹参的根及根茎，有活血祛瘀，清热安神、养血益气之功效。丹酚酸是丹参有效成分之一，主要包括迷迭香酸和丹酚酸B等。由于在治疗心血管系统疾病中的突出表现和无毒负作用的特点，丹参的应用和研究也越来越广泛。
目前现有的丹参毛状根可采用6,7-V培养基进行培养。一般称取新鲜丹参毛状根0.15～0.2g接种于50mL的6,7-V培养基中进黑暗培养。丹参毛状根在生产丹参有效成分方面有着巨大潜力，但活性成分含量较低已成为制约丹参毛状根应用的瓶颈。
含30g/L蔗糖的6,7-V培养基的配方如表1所示，pH值为5.8，121℃灭菌20min。
表1、6,7-V培养基的配方
5-氮杂胞苷(5-aza)为无色结晶体，溶于水和甲醇。它能迅速磷酸化并结合入RAN和DNA，通过破坏核酸顺利翻译为蛋白质，而抑制了蛋白质的合成。此外它通过抑制乳清酸核苷酸脱羧酶而影响嘧啶的合成。它是作用于S期的细胞周期特异性药。其主要用于：1、组织培养用：诱变剂，抑制核糖核酸合成；2、抗肿瘤药物、抗代谢剂：主要适应证是对常规治疗无效的急性髓性白血病；亦用于乳腺癌、黑色素瘤、肠癌等。已有研究表明，利用5-氮杂胞苷处理白桦悬浮细胞，能够有效提高白桦次生代谢产物总三萜和齐墩果酸的积累。
但是，目前现有技术没有告知5-氮杂胞苷(5-aza)能够用于促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B的积累。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B积累的诱导法，本发明通过使用5-氮杂胞苷处理丹参毛状根，从而促进丹参毛状根中次生代谢产物迷迭香酸和丹酚酸B的积累。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B积累的诱导法，包括以下步骤：
1)、丹参毛状根的初培养：
在每100mL的6,7-V培养基中接种0.3～0.4g丹参毛状根，于100～150rpm、24～26℃的培养条件下黑暗培养17～19天；
2)、丹参毛状根的继续培养：
然后添加5-氮杂胞苷溶液，使6,7-V培养基中5-氮杂胞苷的终浓度为9～11μM；于100～150rpm、24～26℃的培养条件下黑暗培养(诱导培养)5～7天；从而实现促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B的积累。
作为本发明的促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B积累的诱导法的改进：
5-氮杂胞苷溶液的配制方法为：
将0.1221g的5-氮杂胞苷溶于5ml无菌水中，用0.22μm无菌滤头过滤除菌；得5-氮杂胞苷溶液(于4℃冰箱保存)。
作为本发明的促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B积累的诱导法的进一步改进：
步骤2)中5-氮杂胞苷的终浓度为10μM。
作为本发明的促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B积累的诱导法的改进：
所述步骤1)和步骤2)的培养条件均为：110rpm，25℃；
步骤1)的黑暗培养时间为18天，步骤2)的黑暗培养(诱导培养)时间为6天。
备注说明：丹参毛状根的初培养和继续培养均在超净台中进行(此为常规技术)。
收集经本发明方法诱导处理后的丹参毛状根，用蒸馏水冲洗，再用干净的纸吸干水份，最后在50～60℃烘箱中干燥至恒重后进行迷迭香酸和丹酚酸B的含量检测(为常规技术)。例如可采取以下步骤：
干燥毛状根研钵中磨碎，过0.45mm筛，精密称取0.01g，加入1mL甲醇-水提取液(由甲醇：水＝7:3的体积比混合而得)，25℃，于40K HZ超声参数下超声提取45min(每间隔10min震荡)，提取液12000rpm离心10min，取上清液过0.45μm滤膜，备用。
含量测定采用Waters 2996二元高效液相色谱仪，色谱柱为Waters SunFire C18(4.6mm*250mm,5μm)。流速1mL min-1，柱温30℃，上样体积20μL.检测波长280nm，流动相乙腈和水，梯度洗脱，测定迷迭香酸和丹酚酸B含量。
备注说明：
丹参毛状根采用发根农杆菌(ATCC15834)侵染丹参试管无菌苗获得，此为常规技术。
以步骤2)中设置不使用5-氮杂胞苷(5-aza)为对照(即，以相同体积量的无菌水替代5-氮杂胞苷溶液)，本发明与对照所得结果对比如下：
5-氮杂胞苷对丹参次生代谢产物迷迭香酸积累的效果表明，10μM 5-氮杂胞苷处理丹参毛状根时，迷迭香酸含量达到0.732mg/g，是对照的238.2％。
5-氮杂胞苷对丹参次生代谢产物丹酚酸B积累的效果表明，10μM 5-氮杂胞苷处理丹参毛状根时，丹酚酸B含量达到1.544mg/g，是对照的203.2％。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为分别使用无菌水(CK)和5-氮杂胞苷诱导时，丹参毛状根中2种活性成分(迷迭香酸和丹酚酸B)的含量对比图。
具体实施方式
实施例1、一种能够促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B积累的诱导法，依次进行以下步骤：
1)、丹参毛状根的初培养：
在超净台中，在每100mL的6,7-V培养基中接种0.3g丹参毛状根，于110rpm，25℃黑暗培养18天；
2)、5-氮杂胞苷的配制：
将0.1221g的5-氮杂胞苷溶于5ml无菌水中，用0.22μm无菌滤头过滤除菌，得5-氮杂胞苷溶液；该-氮杂胞苷溶液可于4℃冰箱保存；
3)、丹参毛状根的继续培养：
丹参毛状根黑暗培养18天后，添加步骤2)所得的5-氮杂胞苷溶液，使5-氮杂胞苷的终浓度为10μM；于110rpm，25℃黑暗条件下诱导培养6天。
诱导培养6天后收集毛状根，用蒸馏水冲洗，再用干净的纸吸干水份，最后在50℃烘箱中干燥至恒重后进行迷迭香酸和丹酚酸B的含量检测(检测方法为常规方法)。
以等量的无菌水诱导为对照(ck)，即，无菌水的体积量等于5-氮杂胞苷溶液的体积量。
所得结果如图1所示。
结果如下：
5-氮杂胞苷对丹参次生代谢产物迷迭香酸积累的效果表明，10μM 5-氮杂胞苷处理丹参毛状根时，迷迭香酸含量达到0.732mg/g，是对照的238.2％。
5-氮杂胞苷对丹参次生代谢产物丹酚酸B积累的效果表明，10μM 5-氮杂胞苷处理丹参毛状根时，丹酚酸B含量达到1.544mg/g，是对照的203.2％。
对比例1-1、将实施例1中5-氮杂胞苷的终浓度由10μM改成5μM，其余等同于实施例1。
对比例1-2、将实施例1中5-氮杂胞苷的终浓度由10μM改成15μM，其余等同于实施例1。
对比例2-1、将实施例1步骤1)中的黑暗培养的时间由18天改成20天，相应的将步骤3)的诱导时间由6天改成4天；其余等同于实施例1。
对比例2-2、将实施例1步骤1)中的黑暗培养的时间由18天改成16天，相应的将步骤3)的诱导时间由6天改成8天；其余等同于实施例1。
对比例3-1、将5-氮杂胞苷改成氮杂脱氧胞苷；其余等同于实施例1。
对比例3-2、将5-氮杂胞苷改成Sinefungin；其余等同于实施例1。
将上述所有的对比例所得的丹参毛状根按照实施例1所述方法进行迷迭香酸、丹酚酸B含量的检测，结果如下表2所述：
表2
| 迷迭香酸含量(mg/g) | 丹酚酸B含量(mg/g) | |
| 对比例1-1 | 0.54 | 0.95 |
| 对比例1-2 | 0.67 | 1.34 |
| 对比例2-1 | 0.53 | 1.01 |
| 对比例2-2 | 0.62 | 1.25 |
| 对比例3-1 | 0.50 | 0.93 |
| 对比例3-2 | 0.61 | 1.26 |
| 实施例1 | 0.732 | 1.544 |
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B积累的诱导法，其特征是包括以下步骤：
1)、丹参毛状根的初培养：
在每100mL的6,7-V培养基中接种0.3～0.4g丹参毛状根，于100～150rpm、24～26℃的培养条件下黑暗培养17～19天；
2)、丹参毛状根的继续培养：
然后添加5-氮杂胞苷溶液，使6,7-V培养基中5-氮杂胞苷的终浓度为9～11μM；于100～150rpm、24～26℃的培养条件下黑暗培养5～7天。
2.根据权利要求1所述的促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B积累的诱导法，其特征是：
5-氮杂胞苷溶液的配制方法为：
将0.1221g的5-氮杂胞苷溶于5ml无菌水中，用0.22μm无菌滤头过滤除菌，得5-氮杂胞苷溶液。
3.根据权利要求1或2所述的促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B积累的诱导法，其特征是：
步骤2)中5-氮杂胞苷的终浓度为10μM。
4.根据权利要求3所述的促进丹参毛状根中迷迭香酸和丹酚酸B积累的诱导法，其特征是：
所述步骤1)和步骤2)的培养条件均为：110rpm，25℃；
步骤1)的黑暗培养时间为18天，步骤2)的黑暗培养时间为6天。
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