CN110313405A

CN110313405A - 一种甘草花药愈伤组织分化再生植株的方法

Info

Publication number: CN110313405A
Application number: CN201910760158.1A
Authority: CN
Inventors: 杨迪
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-08-16
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2019-10-11

Abstract

本发明公开了一种甘草花药愈伤组织分化再生植株的方法，包括如下步骤：愈伤组织分化培养、愈伤组织继代培养、生根培养、炼苗移栽。本发明还公开了一种甘草花药愈伤组织分化培养基，其成分包括大量元素，微量元素，铁盐乳酸亚铁，有机成分肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、赖氨酸、组氨酸、精胺、阿拉伯半乳糖蛋白，生长调节剂ZT、NAA、三十烷醇，附加成分1‑甲基环丙烯、5‑氮杂胞苷、苜蓿水提液，以及蔗糖和结冷胶。采用本发明的方法，甘草花药愈伤组织的平均分化率为32.13%，与现有技术相比有了显著提高，对于提高甘草花药培养效率、进一步开展甘草单倍体育种工作具有重要意义。

Description

一种甘草花药愈伤组织分化再生植株的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甘草花药愈伤组织分化再生植株的方法。

背景技术

甘草（Licorice）又名甜草根、粉草、国老等，为豆科、蝶形花亚科、甘草属多年生草本植物，根与根状茎粗状，直径1-3厘米，外皮褐色，里面淡黄色，具甜味。甘草以干燥的根及根茎入药，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药之功效，常用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。甘草在全世界约有29种6变种，我国约有18种3变种。据《中华人民共和国药典》记载，甘草药材原植物有3种，即乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）和光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）。此外，我国还有刺果甘草、黄甘草、云南甘草等品种。乌拉尔甘草广泛分布于西北各省区，如内蒙古、甘肃、宁夏、新疆、青海、山西、陕西等，甚至在东北地区也有乌拉甘草分布，其天然蕴藏量大、分布范围广，同时也是医药界使用最多的甘草品种，因此乌拉甘草通常也被简称为甘草。胀果甘草又名膨果甘草，主产于我国新疆南疆地区和甘肃西北部。光果甘草又名欧甘草、欧亚甘草，仅分布于新疆、青海，产量与乌拉尔甘草、胀果甘草相比相对较少。作为一味常用大宗药材，甘草的化学成分及药理作用一直是国内外药理界的研究热点。研究表明，甘草最主要的化学成分是三萜类化合物和黄酮类化合物，其次还分离得到香豆素类、生物碱、多糖、有机酸、氨基酸等多种成分。有关甘草提取物及其主要成分的药理作用，国内外进行了大量的研究。结果表明甘草存在抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝、抗癌、抗疟原虫、保护神经中枢系统、保护心脑血管系统、抗肾损伤、治疗呼吸系疾病统、调节内分泌、增强免疫功能等诸多活性。除作为传统药材和现代医药原料外，甘草还可以作为矫味剂添加到糖果、饮料、香烟中，作为美白剂添加到化妆品中，作为表面活性剂以促进难吸收药物的吸收。

甘草多年来一直是国内外市场上的畅销产品。尤其是近20年来，甘草的销售量一直呈上升趋势。由于甘草价格高涨，造成人们对野生甘草的毁灭性采挖，不仅破坏了草原生态系统的良性循环，而且使野生甘草资源本身趋于枯竭。我国于20世纪80年代末开始进行甘草的人工驯化并取得成功。家种甘草主产区有甘肃、宁夏、内蒙、新疆，次产区有东北、河北、山西等。但目前市场上的甘草只有20%是人工种植的。制约甘草人工种植产业发展的关键在于栽培甘草完全来自野生，由于种内的遗传多样性造成基因型间差别很大，外形不够一致，径级差别明显，有效成分含量不一致和不稳定，给中药标准化生产加工和质量控制带来很大困难。与粮食和经济作物相比，我国药用植物基础研究还很薄弱，所以在很长一段时间内，我国的药用植物遗传育种工作主要还要依靠常规育种。系统选育和杂交育种培育出的新品种遗传性状相对稳定，安全性高，但培育周期过长，少则四五年，多则要十年以上，从而成为常规育种的瓶颈。

生物技术是21世纪发展最快、最有生命力的一门高技术前沿学科。生物技术的兴起为我国药用植物的研究及发展提供了机遇和手段。伴随着高等植物细胞工程、基因工程等生物技术的日趋成熟，药用植物的生产在数量和品质上都取得了显著的进步。药用植物生物技术育种手段主要包括组织培养、倍性育种、基因工程和分子标记技术等，将常规育种与这些生物技术育种手段相结合已成为药用植物育种发展的新趋势。

根据育种目标的要求，采用染色体数减半的方法选育植物新品种的途径称为单倍体育种。由于单倍体只含有其双亲的一套染色体组，所以单倍体植株几乎是完全不育的。但如果将由任何杂种形成的单倍体进行染色体加倍后成为纯种，则将体现单倍体作为育种环节的特殊重要性。花药培养是是产生单倍体的主要途径之一，该方法是把整个花药接种到培养基上，在离体培养条件下，促使其小孢子诱导形成单倍体植株。花药培养的优点主要表现在以下几个方面：（1）由于从单倍体的染色体加倍可以获得纯合的二倍体和多倍体，在遗传上非常稳定，不发生性状分离，因此，花培育种能极早稳定分离后代，这样可以省去多代自交，快速地获得自交系，缩短育种年限，并且可以克服杂种性状的分离；（2）单倍体植物与诱变育种相结合，可以加速诱变育种的进程；（3）单倍体不存在显隐性问题，其基因型完全可以由表现型反映出来，花培加倍后的纯合二倍体植株，可排除杂合体中显性因子掩盖隐性因子造成的干扰，提高选择的准确性和可靠性，而且花粉植株会表现丰富的多样性，如株高、生育期、育性及抗性等，这些性状相互交叉，组成了具有多种形态特征的花培株系，因此，花培育种既可充分利用植物的种质资源，又可获得性状的多样性。

我国花药培养研究始于1970年，其研究初期主要集中在小麦、水稻、玉米、烟草等禾谷类作物和经济作物上。随后也获得了花粉来源的三叶橡胶、甘蔗、杨树、茄子、甜菜和油菜等单倍体植株。以后又在果树如柑桔、葡萄、草莓、苹果和荔枝等水果中获得花粉单倍体植株。我国的药用植物花药培养研究也取得了一定进展，文献报道较多的有枸杞、人参、平贝母、丹参等。但就甘草而言，其花药培养的研究进展缓慢，还有很多问题未能解决，主要集中在愈伤组织的诱导率低、分化率低、成苗率低、植株再生率低等问题上。我们对影响甘草花药培养的一些关键因素进行了深入研究，已经探索出一种提高甘草花药愈伤组织诱导率的方法，在此基础上我们继续研究了甘草花药愈伤组织的分化、继代，试管苗的生根、移栽技术，以进一步改进甘草花药培养技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘草花药愈伤组织分化再生植株的方法，尤其是提供一种甘草花药愈伤组织分化培养基，利用该方法可以提高甘草花药愈伤组织的分化率，进而提高甘草花药培养效率。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种甘草花药愈伤组织分化再生植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）愈伤组织分化培养：挑选合适的甘草花药愈伤组织接种至分化培养基上，每瓶接种3~5块，置于温度24~26℃、光照时间10~14h/d、光照强度1500~2000lx的条件下培养；

2）愈伤组织继代培养：在愈伤组织分化培养至25~30d时，将长势良好的愈伤组织继代到新鲜的分化培养基上，继续培养25~30d可分化出不定芽；

3）生根培养：当分化出的不定芽长至1~2cm时，将其切下转接到生根培养基上，每瓶接种 2~3 个不定芽，在光照条件下培养20~28d获得生根的试管苗；

4）炼苗移栽：当试管苗长出1~2cm根系时，先将瓶口打开，在培养箱炼苗2~3d，然后在培养室内炼苗3~4d；将炼苗后的试管苗从培养瓶中取出，用清水洗净残留在根部上的培养基，移栽到已经过灭菌的基质上，进行常规栽培管理。

所述步骤1）中甘草花药愈伤组织的挑选标准为：直径1~2mm左右，颜色呈现淡绿色，结构比较致密。

所述步骤1）中分化培养基的成分为：NH₄NO₃1050~1150mg/L，KNO₃1180~1300mg/L，KH₂PO₄·H₂O 107~123mg/L，柠檬酸钙310~330mg/L，MgSO₄·7H₂O 160~180mg/L，MgCl₂100~120mg/L，MnSO₄·4H₂O 19~23mg/L，KI 0.80~0.86mg/L，H₃BO₃5.5~6.1mg/L，ZnSO₄·7H₂O2.0~3.0mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2~0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02~0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O0.02~0.03mg/L，乳酸亚铁29.8~33.4mg/L，肌醇80~100mg/L，烟酸0.6~1.0mg/L，盐酸硫胺素8.5~9.5mg/L，盐酸吡哆醇0.8~1.2mg/L，赖氨酸2.0~3.0mg/L，组氨酸3.0~4.0mg/L，精胺20~30mmol/L，1-甲基环丙烯0.8~1.2mg/L，ZT 0.4~0.6mg/L，NAA 0.04~0.06mg/L，三十烷醇1.0~1.6mg/L，阿拉伯半乳糖蛋白190~210mg/L，5-氮杂胞苷36~44μmol/L，苜蓿水提液50~80ml/L，蔗糖25~35g/L，结冷胶9~11g/L，pH值调节为5.6~6.0。

所述步骤3）中生根培养基的成分为：1/2MS基本培养基+NAA 0.05mg/L+氯化胆碱3mg/L+蔗糖10g/L+结冷胶3.5g/L，pH值调节为5.6~6.0。

所述步骤3）中生根培养的条件为：温度23~27℃、光照时间12~16h/d、光照强度2000~3000lx。

所述步骤4）中培养室的温度保持在20~28℃，湿度保持在70~80%，自然光照。

所述苜蓿水提液的制备方法为：将苜蓿植株剪碎后加入蒸馏水，每1500mL水中加入300g鲜品，充分浸泡48h后用4层纱布过滤，滤液置于4℃冰箱备用。

本发明具有以下有益效果：

1）本发明的分化培养基调整了大量元素和部分微量元素的浓度，以乳酸亚铁代替无机铁盐，以结冷胶作为凝固剂，使其更适合于甘草花药愈伤组织的分化培养；除了常规的肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素外，还添加了更多的有机成分如赖氨酸、组氨酸、精胺、阿拉伯半乳糖蛋白，生长调节剂为ZT、NAA和三十烷醇，附加成分还有1-甲基环丙烯、5-氮杂胞苷、苜蓿水提液。该分化培养基具有显著提高甘草花药愈伤组织分化率的效果，在实施例中平均分化率可达32.13%。

2）由于甘草花药愈伤组织分化培养时间较长，本发明在分化过程中对愈伤组织进行继代培养，可以为愈伤组织提供充足的营养物质，同时减少培养过程中产生的有毒物质。

3）本发明对甘草花药愈伤组织分化出的不定芽进了生根培养和炼苗移栽，平均生根率为88.05%，移栽成活率为80.9%。本发明对于建立甘草高效花药培养体系，进一步开展甘草单倍体育种工作具有重要意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

1材料与方法

1.1供试材料

乌拉尔甘草和胀果甘草花药经诱导培养形成的愈伤组织，为发明人前期试验所得。

1.2试验方法

1）愈伤组织分化培养：挑选直径1~2mm左右，颜色呈现淡绿色，结构比较致密的甘草花药愈伤组织接种至分化培养基上，每瓶接种3~5块，置于温度25℃、光照时间12h/d、光照强度1750lx的条件下培养；

分化培养基的成分为：NH₄NO₃1100mg/L，KNO₃1240mg/L，KH₂PO₄·H₂O 115mg/L，柠檬酸钙320mg/L，MgSO₄·7H₂O 170mg/L，MgCl₂110mg/L，MnSO₄·4H₂O 21mg/L，KI 0.83mg/L，H₃BO₃5.8mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2.5mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，乳酸亚铁31.6mg/L，肌醇90mg/L，烟酸0.8mg/L，盐酸硫胺素9.0mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，赖氨酸2.5mg/L，组氨酸3.5mg/L，精胺25mmol/L，1-甲基环丙烯1.0mg/L，ZT0.5mg/L，NAA 0.05mg/L，三十烷醇1.3mg/L，阿拉伯半乳糖蛋白200mg/L，5-氮杂胞苷40μmol/L，苜蓿水提液70ml/L，蔗糖30g/L，结冷胶10g/L，pH值调节为5.8。苜蓿水提液的制备方法为：将苜蓿植株剪碎后加入蒸馏水，每1500mL水中加入300g鲜品，充分浸泡48h后用4层纱布过滤，滤液置于4℃冰箱备用。

2）愈伤组织继代培养：在愈伤组织分化培养至25~30d时，将长势良好的愈伤组织继代到新鲜的分化培养基上，继续培养25~30d可分化出不定芽。

实施例2、阿拉伯半乳糖蛋白对甘草花药愈伤组织分化的影响

阿拉伯半乳糖蛋白（AGP）是广泛存在于细胞中的一类重要糖蛋白，与胚性细胞或胚状体形成密切相关。为了研究阿拉伯半乳糖蛋白对甘草花药愈伤组织分化的影响，我们按照实施例1的方法，只改变分化培养基中阿拉伯半乳糖蛋白的浓度，设置了0mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L这6组处理，其中0mg/L即为不添加阿拉伯半乳糖蛋白的对照组，将乌拉尔甘草和胀果甘草的花药愈伤组织接种进行分化和继代培养，统计每组处理分化出绿芽的愈伤组织块数，计算愈伤组织分化率，结果见下表1。愈伤组织分化率（%）=（分化出绿芽的愈伤组织块数/接种的愈伤组织总块数）×100%。

从表1可以看出，随着阿拉伯半乳糖蛋白浓度由0到600mg/L逐渐增加，乌拉尔甘草和胀果甘草的花药愈伤组织分化率的变化趋势基本一致。当阿拉伯半乳糖蛋白浓度为200mg/L时，两种材料的愈伤组织分化率均达到最大值，分别为乌拉尔甘草34.36%，胀果甘草29.75%，与对照组相比乌拉尔甘草愈伤组织分化率的增幅更大。随着阿拉伯半乳糖蛋白浓度继续增加，两种材料的愈伤组织分化率缓慢下降，到600mg/L浓度时，乌拉尔甘草的愈伤组织分化率为30.67%，胀果甘草的愈伤组织分化率为27.06%，但仍显著高于对照组。由以上结果可以看出阿拉伯半乳糖蛋白对甘草花药愈伤组织的分化具有促进作用，添加浓度以200mg/L为宜。

实施例3、5-氮杂胞苷对甘草花药愈伤组织分化绿苗的影响

5-氮杂胞苷（5-azacytidine）是一种重要的表观遗传调控试剂，它能降低基因组 DNA甲基化水平，表观遗传机制在植物发育、非生物逆境抗性等方面起着关键作用。为了研究5-氮杂胞苷对甘草花药愈伤组织分化的影响，我们按照实施例1的方法，只改变分化培养基中5-氮杂胞苷的浓度，设置了0μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L这6组处理，其中0μmol/L即为不添加5-氮杂胞苷的对照组，将乌拉尔甘草和胀果甘草的花药愈伤组织接种进行培养，统计每组处理分化出绿芽的愈伤组织块数，计算愈伤组织分化率，结果见下表2。

从表2可以看出，随着5-氮杂胞苷浓度由0到100μmol/L逐渐增加，乌拉尔甘草和胀果甘草的花药愈伤组织分化率均呈现先升高后降低的趋势。与对照组相比，当5-氮杂胞苷浓度在20~60μmol/L时，两种材料的愈伤组织分化率均有不同程度提高，其中为40μmol/L时，两种材料的愈伤组织分化率均达到最大值，分别为乌拉尔甘草34.68%，胀果甘草29.90%；当5-氮杂胞苷浓度超过60μmol/L时，两种材料的愈伤组织分化率显著下降，60μmol/L时分化率与对照组接近，80μmol/L时分化率甚至低于对照组。由以上结果可以看出，低浓度的5-氮杂胞苷对甘草花药愈伤组织分化有促进作用，但高浓度的5-氮杂胞苷会产生抑制作用，因此5-氮杂胞苷的添加浓度以40μmol/L为宜。

实施例4、1-甲基环丙烯对甘草花药愈伤组织分化绿苗的影响

1-甲基环丙烯属于乙烯受体抑制剂。在植物组织及细胞培养过程中往往会形成乙烯，而乙烯是抑制器官发生和体细胞胚胎发生的，随着培养时间的延长，培养容器中的乙烯含量会逐渐积累，进而对培养材料的生长发育以及芽的分化产生抑制作用。为了研究1-甲基环丙烯对甘草花药愈伤组织分化的影响，我们按照实施例1的方法，只改变分化培养基中1-甲基环丙烯的浓度，设置了0mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L这6组处理，其中0mg/L即为不添加1-甲基环丙烯的对照组，将乌拉尔甘草和胀果甘草的花药愈伤组织接种进行培养，统计每组处理分化出绿芽的愈伤组织块数，计算愈伤组织分化率，结果见下表3。

从表3可以看出，随着1-甲基环丙烯浓度由0到4.0mg/L逐渐增加，乌拉尔甘草和胀果甘草的花药愈伤组织分化率均呈现先升高后降低的趋势。当1-甲基环丙烯浓度为1.0mg/L时，两种材料的愈伤组织分化率均达到最大值，分别为乌拉尔甘草34.68%，胀果甘草30.25%，较对照组有显著提高；其次为2.0mg/L的处理，乌拉尔甘草的愈伤组织分化率为28.30%，胀果甘草的愈伤组织分化率为25.45%。当1-甲基环丙烯浓度为4.0mg/L时，两种材料的愈伤组织分化率略高于对照组，说明此浓度对甘草花药愈伤组织的分化没有明显促进作用。由以上结果可以看出，1-甲基环丙烯的添加浓度以1.0mg/L为宜。

实施例5、不同分化培养基对甘草花药愈伤组织分化绿苗的影响

为了比较不同分化培养基对甘草花药愈伤组织分化的影响，我们按照实施例1的方法，将分化培养基替换成1/2MS基本培养基+BA0.05mg/L+IAA0.01mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖3%+结冷胶0.7%，该培养基来源于文献《甘草花药培养中愈伤组织诱导和芽再生植株》，将乌拉尔甘草和胀果甘草的花药愈伤组织接种进行培养，统计分化出绿芽的愈伤组织块数，计算愈伤组织分化率，并与实施例1的结果进行比较，见下表4。

从表4可以看出，在试验材料和试验方法相同的条件下，实施例1即采用本发明的分化培养基，两种甘草花药愈伤组织的分化率要显著高于实施例5，乌拉尔甘草愈伤组织的分化率为34.40%，胀果甘草愈伤组织的分化率为29.85%，平均分化率为32.13%，较实施例5中11.12%的平均分化率提高了21个百分点。

实施例6

以实施例1中乌拉尔甘草和胀果甘草花药愈伤组织分化出的不定芽为试验材料，进行以下试验：

1）生根培养：当分化出的不定芽长至1~2cm时，将其切下转接到生根培养基（1/2MS基本培养基+NAA 0.05mg/L+氯化胆碱3mg/L+蔗糖10g/L+结冷胶3.5g/L，pH值调节为5.8）上，每瓶接种 2~3 个不定芽，在温度25℃、光照时间14h/d、光照强度2500lx件下培养28d，统计试管苗的生根率。

2）炼苗移栽：当试管苗长出1~2cm根系时，先将瓶口打开，在培养箱炼苗2~3d，然后在培养室内炼苗3~4d，培养室的温度保持在20~28℃，湿度保持在70~80%，自然光照；将炼苗后的试管苗从培养瓶中取出，用清水洗净残留在根部上的培养基，移栽到已经过灭菌的基质上，进行常规栽培管理，移栽15d后统计试管苗的移栽成活率。

上述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims

1.一种甘草花药愈伤组织分化再生植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种甘草花药愈伤组织分化再生植株的方法，其特征在于，所述步骤1）中甘草花药愈伤组织的挑选标准为：直径1~2mm左右，颜色呈现淡绿色，结构比较致密。

3.根据权利要求1所述的一种甘草花药愈伤组织分化再生植株的方法，其特征在于，所述步骤1）中分化培养基的成分为：NH₄NO₃1050~1150mg/L，KNO₃1180~1300mg/L，KH₂PO₄·H₂O107~123mg/L，柠檬酸钙310~330mg/L，MgSO₄·7H₂O 160~180mg/L，MgCl₂100~120mg/L，MnSO₄·4H₂O 19~23mg/L，KI 0.80~0.86mg/L，H₃BO₃5.5~6.1mg/L，ZnSO₄·7H₂O 2.0~3.0mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2~0.3mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.02~0.03mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.02~0.03mg/L，乳酸亚铁29.8~33.4mg/L，肌醇80~100mg/L，烟酸0.6~1.0mg/L，盐酸硫胺素8.5~9.5mg/L，盐酸吡哆醇0.8~1.2mg/L，赖氨酸2.0~3.0mg/L，组氨酸3.0~4.0mg/L，精胺20~30mmol/L，1-甲基环丙烯0.8~1.2mg/L，ZT 0.4~0.6mg/L，NAA 0.04~0.06mg/L，三十烷醇1.0~1.6mg/L，阿拉伯半乳糖蛋白190~210mg/L，5-氮杂胞苷36~44μmol/L，苜蓿水提液50~80ml/L，蔗糖25~35g/L，结冷胶9~11g/L，pH值调节为5.6~6.0。

4.根据权利要求1所述的一种甘草花药愈伤组织分化再生植株的方法，其特征在于，所述步骤3）中生根培养基的成分为：1/2MS基本培养基+NAA 0.05mg/L+氯化胆碱3mg/L+蔗糖10g/L+结冷胶3.5g/L，pH值调节为5.6~6.0。

5.根据权利要求1所述的一种甘草花药愈伤组织分化再生植株的方法，其特征在于，所述步骤3）中生根培养的条件为：温度23~27℃、光照时间12~16h/d、光照强度2000~3000lx。

6.根据权利要求1所述的一种甘草花药愈伤组织分化再生植株的方法，其特征在于，所述步骤4）中培养室的温度保持在20~28℃，湿度保持在70~80%，自然光照。

7.根据权利要求3所述的一种甘草花药愈伤组织分化再生植株的方法，其特征在于，所述苜蓿水提液的制备方法为：将苜蓿植株剪碎后加入蒸馏水，每1500mL水中加入300g鲜品，充分浸泡48h后用4层纱布过滤，滤液置于4℃冰箱备用。