CN115735772B - 5-AzaC在苹果砧木组织生根培养或无糖生根培养中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了5‑氮杂胞苷在苹果砧木组织生根培养或无糖生根培养中的应用，属于植物组织培养技术领域。本发明针对不同苹果砧木品种的组培苗生根率低，不定根数量少等缺点，基于苹果成龄期茎尖连续组培返童恢复扦插生根能力与植物DNA甲基化变化密切相关的生根机制，通过在苹果组培苗生根过程中外源加入5‑AzaC，并调整适宜浓度，降低苹果组培苗DNA甲基化水平后，提升苹果组培苗不定根发生能力。

Description

5-AzaC在苹果砧木组织生根培养或无糖生根培养中的应用

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及5-AzaC在苹果砧木组织生根培养或无糖生根培养中的应用。

背景技术

苹果是世界范围内的重要水果，我国苹果种植面积和产量均居世界前列。为了实现我国苹果产业的可持续发展，建立以矮化密植为核心的高效栽培技术体系成为重中之重，目前国内外主要通过压条和组织培养的技术来繁育无性系矮化砧木。

苹果的组织培养是采用无菌培养技术，将来自优良植物的茎尖、腋芽、叶片、等器官以及他们的组织切片进行离体培养，使之在短期内获得大量遗传性一致的个体的方法。1973年Jones等培育苹果砧木M26和M9的茎尖获得成功，之后美国的Button等利用此技术大量繁殖了英国东茂林试验站育成的苹果砧木M27，促进了其推广应用。我国在这方面也进行了大量工作，加速了苹果新品种的推广应用，另外，由于离体技术处理严格，所以很容易脱除昆虫、一般真菌病害和一些细菌病原及病毒，是复壮品种的有效措施。已成功脱除的病毒和病害有苹果褪绿叶斑病毒、花叶病病毒、轮纹病等。但是目前仍有许多品种的苹果组培苗存在生根能力差、生根率低、生根数量少等缺点。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种5-AzaC在苹果组织生根培养或无糖生根培养中的应用，通过在苹果生根培养基中添加甲基化抑制剂5-AzaC，提升苹果组培苗不定根发生能力。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

5-氮杂胞苷在苹果砧木组织生根培养或无糖生根培养中的应用。

优选的是，所述苹果砧木为成龄材料扦插生根率≤5％的品种，包括‘珠美海棠’、‘M9T337’和‘M26’。

本发明还提供了一种苹果组织培养生根培养基，成分包括1/2MS+0.5mg/LIBA+10-100μmol/L5-AzaC+25-30g/L蔗糖+1.5-3.0g/L植物凝胶。

优选的是，制备方法包括以下步骤：1/2MS、0.5mg/LIBA、25-30g/L蔗糖和1.5-3.0g/L植物凝胶配制培养基，高温灭菌后，加入10-100μmol/L5-AzaC，待凝固得到所述生根培养基。

本发明还提供了一种苹果无糖培养生根培养基，成分包括蛭石和营养液；所述营养液成分包括1/2MS+0.6mg/LIBA+10-100μmol/L5-AzaC，所述1/2MS不添加有机成分。

优选的是，所述营养液成分还包括0.5-0.7g/L抑菌剂。

优选的是，所述蛭石和营养液的体积比为2:1-1.2。

优选的是，制备方法包括以下步骤：蛭石与纯水等质量比混合，高温灭菌后加入无糖盒，厚度3-4cm；按比例配制营养液，加入无糖盒；倾斜无糖盒至液面没过蛭石，得到所述生根培养基。

本发明还提供了一种提高苹果组培苗生根能力的方法，通过无性系连续组培继代培养获得苹果组培苗，将所述组培苗接种到上述苹果组织培养生根培养基或无糖培养生根培养基中进行生根培养。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明针对有许多品种的苹果组培苗有再生效率低，生根能力差，分化能力弱等缺点，基于苹果成龄期茎尖连续组培返童恢复扦插生根能力与植物DNA甲基化变化密切相关的生根机制，通过在苹果组培苗生根过程中外源加入5-AzaC，并调整适宜浓度，降低DNA甲基化水平后，提升苹果组培苗不定根形成。

附图说明

图1：成龄M9T337和SH6连续茎段继代返童后恢复绿枝扦插生根能力；图中：(A)成龄(adult)和返童(rejuvenation)绿枝插穗扦插后35d生根情况；(B)不定根发生率统计；(C)不定根数量统计；(D)不定根长度统计；

图2：M9T337返童(R)和成龄(A)材料全基因组DNA甲基化比较分析；图中：M9T337-A材料mC、mCG、mCHG和mCHH(H＝A,CorT)类型甲基化度高于M9T337-R；(B)与M9T337-A相比，M9T337-R中DNA甲基化差异区域(DMRs)的类型和数量；(C-E)Circosplots显示相比于M9T337-A，M9T337-R中hyper-DMRs和hypo-DMRs的分布；

图3：T337-R和T337-A中DNA甲基化转移酶基因和DNA去甲基化酶基因表达水平；图中，(a)DNA甲基化转移酶基因的表达水平；(b)DNA去甲基化酶基因的表达水平；*P<0.05,**P<0.01；

图4：T337-R中的DNA去甲基化有助于不定根诱导的基因激活；图中，(a)Hypo-DMRs启动子相关基因的Venn图；(b)重叠基因的DNA甲基化和表达(log(FPKM))模式热图；

图5：10μmol/L5-AzaC对苹果‘珠美海棠’组培苗组织生根培养生根率、生根数和根长的影响；

图6：50μmol/L5-AzaC对苹果‘珠美海棠’组培苗组织生根培养生根率、生根数和根长的影响；

图7：100μmol/L5-AzaC对苹果‘珠美海棠’组培苗组织生根培养生根率、生根数和根长的影响；

图8：10μmol/L5-AzaC对苹果‘M9T337’组培苗组织生根培养生根率、生根数和根长的影响；

图9：50μmol/L5-AzaC对苹果‘M9T337’组培苗组织生根培养生根率、生根数和根长的影响；

图10：100μmol/L5-AzaC对苹果‘M9T337’组培苗组织生根培养生根率、生根数和根长的影响；

图11：10μmol/L5-AzaC对苹果‘M26’组培苗组织生根培养生根率、生根数和根长的影响；

图12：50μmol/L5-AzaC对苹果‘M26’组培苗组织生根培养生根率、生根数和根长的影响

图13：100μmol/L5-AzaC对苹果‘M26’组培苗组织生根培养生根率、生根数和根长的影响；

图14：10μmol/L5-AzaC对苹果‘珠美海棠’组培苗无糖生根培养生根率、生根数和根长的影响；

图15：10μmol/L5-AzaC对苹果‘M9T337’组培苗无糖生根培养生根率、生根数和根长的影响；

图16：10μmol/L5-AzaC对苹果‘M26’组培苗无糖生根培养生根率、生根数和根长的影响。

具体实施方式

本发明提供了5-氮杂胞苷(5-AzaC)在苹果砧木组织生根培养或无糖生根培养中的应用，通过在苹果组培苗生根过程中外源加入5-AzaC，降低DNA甲基化水平后，提升苹果组培苗不定根发生率。本发明优选苹果砧木品种为成龄材料扦插生根率≤5％的品种，包括‘珠美海棠’、‘M9T337’和‘M26’。

本发明还提供了一种苹果组织培养生根培养基，成分包括1/2MS+0.5mg/LIBA+10-100μmol/L5-AzaC+25-30g/L蔗糖+1.5-3.0g/L植物凝胶；优选根据苹果品种调整5-AzaC浓度。进一步优选‘珠美海棠’品种生根培养基5-AzaC浓度为50-100μmol/L，更优选100μmol/L。进一步优选‘M9T337’品种生根培养基5-AzaC浓度为10μmol/L或100μmol/L。进一步优选‘M26’品种生根培养基5-AzaC浓度为10-50μmol/L，更优选10μmol/L。

本发明优选苹果组织培养生根培养基制备方法包括以下步骤：1/2MS、0.5mg/LIBA、25-30g/L蔗糖和1.5-3.0g/L植物凝胶配制培养基，高温灭菌后，加入10-100μmol/L5-AzaC，待凝固得到所述生根培养基。进一步优选高温灭菌为：高温蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min；更优选冷却至45-55℃后加入5-AzaC。

本发明还提供了一种苹果无糖培养生根培养基，成分包括蛭石和营养液；所述营养液成分包括1/2MS+0.6mg/LIBA+10-100μmol/L5-AzaC，所述1/2MS不添加有机成分。进一步优选5-AzaC浓度为10-50μmol/L，更优选10μmol/L。

本发明优选营养液中还包括0.5-0.7g/L抑菌剂，进一步优选0.6g/L。作为一种可实施方式，本发明抑菌剂来源于山东智科生物科技有限公司生产的山农一号(I型)和高浓缩植物组培抗污杀菌剂S206。

本发明优选蛭石和营养液的体积比为2:1-1.2；进一步优选2:1-1.1；更优选2:1。作为一种可实施方式，在无糖盒中加入2L蛭石和1L营养液。

本发明优选苹果无糖培养生根培养基制备方法包括以下步骤：蛭石与纯水等质量比混合，高温灭菌后加入无糖盒，厚度3-4cm；按比例配制营养液，加入无糖盒；倾斜无糖盒至液面没过蛭石，得到所述生根培养基。进一步优选蛭石基质和营养液(加入5-AzaC之前)均进行高温灭菌，放入高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min。

本发明还提供了一种提高苹果组培苗生根能力的方法，通过无性系连续组培继代培养获得苹果组培苗，将所述组培苗接种到上述苹果组织培养生根培养基或无糖培养生根培养基中进行生根培养。

本发明优选组织培养，接种后置于培养架暗培养3d，三天后转至组培室正常培养，培养室温度为25±2℃，湿度保持在70％以上；优选无糖培养，培养室温度为25±2℃，接种后置于培养架暗培养，于接种后第2天早上开2盏灯，第4天早上揭去保鲜膜，第7天早上开3盏灯并开始通气，通气时间为15min/h，气体分流阀调为45°，仅在光培养阶段进行，第10-15天内开始通大气，通气时间为30min/h，气体分流阀调为75°，仅在光培养阶段进行；接种后前三天，保持湿度在95％以上，3-7天内湿度保持在90％以上，7-10天内保持适度在85％以上，10天后湿度保持在75％以上；设置房间二氧化碳浓度为800-1200ppm。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

若无特殊说明，本发明实施例所使用方法均为本领域常规方法，所使用试剂、材料均可通过商业途径获得。

实施例1

一种苹果砧木组织培养生根培养基，制备方法如下：

培养基配方为1/2MS+0.5mg/LIBA+25g/L蔗糖+1.5g/L植物凝胶，调pH至5.8-6.0，配置完成后放入高温蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min；将培养基放置至50℃左右时，经75％的酒精消毒后将其放入超净台中，加入10μmol/L5-AzaC，待培养基凝固后即可使用。

实施例2

一种苹果砧木组织培养生根培养基，与实施例1的区别在于，培养基中50μmol/L5-AzaC，2.0g/L植物凝胶。

实施例3

一种苹果砧木组织培养生根培养基，与实施例1的区别在于，培养基中100μmol/L5-AzaC，3.0g/L植物凝胶。

实施例4

一种苹果砧木无糖培养生根培养基，制备方法如下：

对无糖盒进行清洗并消毒，转入无菌室；

将干蛭石与纯水1：1搅拌均匀后，装入帆布袋中束口灭菌。在高压蒸汽灭菌锅121℃下灭菌20min，取出冷却备用；

配制营养液，配方为1/2MS(不加有机物)，附加0.6mg/LIBA，调pH至5.8-6.0，放入高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min，取出冷却，加入0.67g/L抑菌剂，10μmol/L5-AzaC；

将2L蛭石加入无糖盒，厚度3-4cm，再添加1-1.2L营养液，将无糖盒倾斜30度，水位稍没过蛭石，静置备用。

实施例5

一种苹果砧木无糖培养生根培养基，与实施例4区别在于，营养液中0.5g/L抑菌剂，50μmol/L5-AzaC。

实施例6

一种苹果砧木无糖培养生根培养基，与实施例4区别在于，营养液中0.7g/L抑菌剂，100μmol/L5-AzaC。

实施例7

组培返童与绿枝扦插

以成龄M9T337和SH6饱满芽作为外植体，进行消毒后得到初代外植体。在无菌条件下用解剖刀剥取初代外植体的茎尖分生组织接入继代培养基(MS+0.2mg/L6-BA+0.5mg/LIBA)，进行继代培养4周，长成无根植株，该植株即为苹果矮化砧木茎尖分生组织初代组培苗；之后每4周剪取茎段(带一个芽和一片营养叶)进行继代培养，每隔2次继代分出部分组培苗进行生根试验。生根培养5个星期统计生根率、根数和根长。得到生根植株清水洗净基部培养基，移栽到营养钵，在温室培养1周，温室培养1个周后定植到大田，建立已返童苹果矮化砧木采穗圃，得到返童树。在下一个生长季节剪取返童树当年生新捎进行扦插。

根据图1可以看出，通过茎段继代的方式进行返童，能够显著提高其绿枝扦插生根能力。

实施例8

成龄期茎尖连续组培返童恢复扦插生根能力与植物DNA甲基化变化密切相关。成龄材料的DNA甲基化水平要显著高于返童材料。

以实施例7中苹果矮化砧木M9T337成龄(扦插难生根)和返童(扦插易生根)嫩枝插穗的茎皮为试材，通过全基因组DNA甲基化测序(重亚硫酸盐处理后高通量测序)。

根据图2可以看出，总体DNA甲基化水平返童材料(17.18％)低于成龄材料(18.30％)(图2A)，但是进一步分析发现，相较于成龄材料，返童材料中共鉴定到DNA甲基化差异区域(DMR)42044个，其中高甲基化差异区域(hyperDMR)16391个，低甲基化差异区域(hypoDMR)25653个(图2B-E)。

根据图3可以看出，植物基因组甲基化受DNA甲基化转移酶和DNA去甲基化酶调控。与T337-A相比，M9T337-R的DNA甲基化水平可能是由于DNA甲基转移酶基因(MdDRM1-like2和MdDRM2-like3)的表达量降低和DNA去甲基化酶基因(MdROS1-like1和MdROS1-like2)的表达量升高所导致的。

根据图4可以看出，T337成龄材料在复幼过程中发生了基因组去甲基化，使得这些正调控不定根生成的基因被诱导表达，从而促进了不定根的形成。

因此，以甲基化抑制剂5-AzaC作为外源制剂对苹果组培生根过程进行诱导，降低DNA甲基化水平后，苹果成龄期组培苗不定根发生率能够得到一定程度提高。

实施例9

5-AzaC对苹果‘珠美海棠’、‘M9T337’和‘M26’组培苗生根培养的影响

1.培养基配置及灭菌

将试管用自来水冲洗后再用蒸馏水清洗一遍，后装入灭菌袋中，在高温蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min。

培养基配方为1/2MS+0.5mg/LIBA+25-30g/L蔗糖+1.5-3g/L植物凝胶，调pH至5.8-6.0，配置完成后放入高温蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min。

将其他试管苗培养过程中所要用到的牛皮纸，滤纸，组培瓶等一并灭菌。

2.培养基分装

分装前提前半小时将超净工作台打开灭菌，此时可将试管提前75％酒精消毒后放入超净台左侧一并灭菌，灭菌完毕后，关掉紫外灯，打开照明灯，将风速调为慢速。将培养基放置至50℃左右时，经75％的酒精消毒后将其放入超净台中，此时按照实验设计加入0(CK)、10、50和100μmol/L的5-AzaC，晃匀后分装入试管中，每管大概50ml左右培养基。待培养基凝固后即可使用。

3.试管苗接种

接种前，提前半小时将超净工作台和接种工具灭菌器打开灭菌。超净台风速调为快速，打开紫外杀菌灯。接种工具灭菌器温度设置在320℃，灭菌前保证里面插3套工具。

灭菌完毕后，关掉紫外灯，打开照明灯，将风速调为慢速。用75％酒精将洗干的棉口罩沁湿擦工作台，先擦双手，再擦台面，顺序依次为顶面、左面、正对面、右面、操作台面(包括台面上摆放的物品及接种工具灭菌器)、玻璃面内外及玻璃面外围。

点燃酒精灯，将接种工具支架用酒精灯灼烧灭菌，灼烧完毕后灭掉酒精灯。取出灭好的接种工具放在支架上冷却待用。将经高温灭菌的牛皮纸用镊子夹取放置在两个空瓶上备用，镊子用完后重新消毒。

将瓶苗放置在小推车下层，分装培养基后的试管放置在小推车上层，用75％酒精给瓶苗和试管表面、手消毒，将瓶苗和试管放进超净台内备用。

提前将试管放入超净工作台左侧，然后取数瓶母苗放入超净工作台右侧，开始接种。

点燃酒精灯，用冷却的镊子夹取1-2张牛皮纸，翻面放于台面上，将瓶苗瓶盖打开在酒精灯火焰上烤瓶口，夹出瓶苗，用镊子和接种刀切苗，打开试管盖在酒精灯火焰上烤瓶口，将切出的苗子垂直插入新的培养基中，注意区分形态学上下端，保证不反插，腋芽不插入培养基内，插好后将瓶口和瓶盖均在酒精灯上烤，封盖。将接种工具在无菌水中涮洗后插入接种工具灭菌器中重新进行高温消毒，清理台面上的垃圾，重新接苗。每次手拿出超净工作台后，必须用75％酒精消毒后再进入。

接后给新接苗子瓶子上标记品种及编号、接种人、接种日期。

4.试管苗培养

接种后置于培养架暗培养3d，三天后转至组培室正常培养，做好每天培养室内的温湿度记录和种苗的生长情况记录，出现异常情况需及时调整和上报。

培养室温度为25±2℃，湿度保持在70％以上。保持培养室内整洁。

及时清理污染瓶苗，统计后运送至灭菌室高温灭菌后清洗。

5.试验结果

根据图5-图7可以看出，对于苹果‘珠美海棠’试管苗，10μmol/L5-AzaC处理在生根时间，生根率，生根长度等方面均优于对照组处理，在平均生根数量上差距不大；50μmol/L5-AzaC处理在生根时间，生根率，平均生根数量，生根长度等方面均优于对照组处理；100μmol/L5-AzaC处理在生根时间，生根率，平均生根数量，生根长度等方面均优于对照组处理。

根据图8-图10可以看出，对于苹果‘M9T337’试管苗，10μmol/L5-AzaC处理在生根时间，平均生根数量，生根长度等方面均优于对照组处理,在生根率上基本一致；50μmol/L5-AzaC处理在生根时间，平均生根数量，生根长度，生根率等方面均差于对照组处理；100μmol/L5-AzaC处理在生根时间，平均生根数量，生根长度等方面均优于对照组处理，在生根率上基本一致。

根据图11-13可以看出，对于苹果‘M26’试管苗，10μmol/L5-AzaC处理在生根时间，平均生根数量，生根长度，生根率等方面均优于对照组处理；50μmol/L5-AzaC处理在生根时间，生根率等方面均优于对照组处理，在平均生根数量和生根长度上差于对照组处理；100μmol/L5-AzaC处理在生根长度方面优于对照组处理，在生根时间上较差于对照组处理，在生根率和平均生根数上差距不大。

实施例10

5-AzaC对苹果‘珠美海棠’、‘M9T337’和‘M26’组培苗无糖生根培养的影响

1.无糖盒清洗

用95％酒精擦去无糖盒外字迹。自来水冲洗无糖盒，清洗至盒盖盒体无肉眼可见的杂质；然后将无糖盒放入0.8％的次氯酸钠水溶液中浸泡30min，经浸泡消毒后的培养盒用纯水涮洗干净，无刺鼻气味，放置托盘，移入灭菌室。

2.基质(蛭石)灭菌

将干蛭石与纯水1：1搅拌均匀后，装入帆布袋中束口灭菌。在高压蒸汽灭菌锅121℃下灭菌20min，取出冷却备用。

3.营养液的配制及灭菌

配方为1/2MS(不加有机物)附加0.6mg/LIBA，调pH至5.8-6.0，分装入组培瓶中，每瓶200ml。放入高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min，取出冷却备用。

4.装盒

将灭好的蛭石，加入无糖盒，2L厚度3-4cm，在营养液中加入抑菌剂和10μmol/L5-氮杂胞苷(5-AzaC)，抑菌剂用量为0.67g/L，每盒添加1L的营养液，将无糖盒倾斜30°，水位稍没过蛭石，静置备用。设对照组(CK)不加5-AzaC。

5.无糖接种

接种前，提前半小时将超净工作台和接种工具灭菌器打开灭菌。灭菌完毕后，关掉紫外灯，打开照明灯，将风速调为慢速。点燃酒精灯，将接种工具支架用酒精灯灼烧灭菌，灼烧完毕后灭掉酒精灯。取出灭好的接种工具放在支架上冷却待用。将经高温灭菌的牛皮纸用镊子夹取放置在两个空瓶上备用，镊子用完后重新消毒。用冷却的镊子夹取1-2张牛皮纸，翻面放于台面上，将瓶苗瓶盖打开在酒精灯火焰上烤瓶口，夹出瓶苗，用镊子和接种刀切苗，将切出的符合无糖标准的苗子插入无糖培养盒中，接种工具在无菌水中涮洗后插入接种工具灭菌器中重新进行高温消毒，清理台面上的垃圾，重新接苗。接种完成后给无糖盒上标记品种及编号、接种人、接种日期，覆上保鲜膜。

6.无糖培养

培养室温度为25±2℃。

接种后置于培养架暗培养，于接种后第2天早上开2盏灯，第4天早上揭去保鲜膜。第7天早上开3盏灯并开始通气，通气时间为15min/h，气体分流阀调为45°，仅在光培养阶段进行。第10-15天内开始通大气，通气时间为30min/h，气体分流阀调为75°，仅在光培养阶段进行。接种后前3天，保持湿度在95％以上，3-7天内湿度保持在90％以上，7-10天内保持适度在85％以上，10天后湿度保持在75％以上。设置房间二氧化碳浓度为800-1200ppm。

做好每天培养室内的温湿度记录和种苗的生长情况记录，出现异常情况需及时调整和上报。

7.试验结果

根据图14-16可以看出，经10μmol/L5-AzaC处理的无糖培养珠美海棠在生根时间，生根率，根长度等方面优于对照组处理，平均生根数上差距不大；经10μmol/L5-AzaC处理的无糖培养M9T337在生根时间，生根数量，根长度等方面优于对照组处理，在生根率上差距不大；经10μmol/L5-AzaC处理的无糖培养M26在生根时间，生根率，根长度等方面均优于对照组处理，在平均生根数上要差于对照组处理。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.5-氮杂胞苷在苹果砧木组织生根培养或无糖生根培养中的应用，所述应用指将5-氮杂胞苷添加到苹果砧木组织生根培养基或无糖生根培养基中；苹果砧木组织生根培养基成分为1/2MS+0.5mg/L IBA+10-100μmol/L 5-AzaC+25-30g/L蔗糖+1.5-3.0g/L植物凝胶；苹果砧木组织无糖生根培养基成分为蛭石和营养液，所述营养液成分为1/2MS+0.6mg/L IBA+10-100μmol/L 5-AzaC，所述1/2MS不添加有机成分。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苹果砧木为成龄材料扦插生根率≤5％的品种，包括‘珠美海棠’、‘M9T337’和‘M26’。

3.一种苹果组织培养生根培养基，其特征在于，成分为1/2MS+0.5mg/L IBA+10-100μmol/L 5-AzaC+25-30g/L蔗糖+1.5-3.0g/L植物凝胶。

4.根据权利要求3所述的苹果组织培养生根培养基，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

1/2MS、0.5mg/L IBA、25-30g/L蔗糖和1.5-3.0g/L植物凝胶配制培养基，高温灭菌后，加入10-100μmol/L 5-AzaC，待凝固得到所述生根培养基。

5.一种苹果无糖培养生根培养基，其特征在于，成分为蛭石和营养液；所述营养液成分为1/2MS+0.6mg/L IBA+10-100μmol/L 5-AzaC，所述1/2MS不添加有机成分。

6.根据权利要求5所述的苹果无糖培养生根培养基，其特征在于，所述营养液成分还包括0.5-0.7g/L抑菌剂。

7.根据权利要求5所述的苹果无糖培养生根培养基，其特征在于，所述蛭石和营养液的体积比为2:1-1.2。

8.根据权利要求5所述的苹果无糖培养生根培养基，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

蛭石与纯水等质量比混合，高温灭菌后加入无糖盒，厚度3-4cm；按比例配制营养液，加入无糖盒；倾斜无糖盒至液面没过蛭石，得到所述生根培养基。

9.一种提高苹果组培苗生根能力的方法，其特征在于，通过无性系连续组培继代培养获得苹果组培苗，将所述组培苗接种到权利要求3所述苹果组织培养生根培养基或权利要求5所述无糖培养生根培养基进行生根培养；

苹果组培苗为‘珠美海棠’品种，所述苹果组织培养生根培养基5-AzaC 100μmol/L，所述无糖培养生根培养基5-AzaC 10μmol/L；

苹果组培苗为‘M9T337’品种，所述苹果组织培养生根培养基5-AzaC 10μmol/L或100μmol/L，所述无糖培养生根培养基5-AzaC 10μmol/L；

苹果组培苗为‘M26’品种，所述苹果组织培养生根培养基5-AzaC 10μmol/L，所述无糖培养生根培养基5-AzaC 10μmol/L。