CN104744448B - 异黄酮化合物，其药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然药物领域，具体涉及从鸡血藤中分离得到的一种新的异黄酮化合物Ⅰ，含其的药物组合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，体外试验能极显著提高小鼠全血培养上清和脾淋巴细胞培养上清中的IFN-γ浓度水平，反映化合物Ⅰ在抗病毒感染和抗肿瘤方面具有非常好的研究价值和应用前景。
Description
技术领域
本发明属于天然药物领域，具体涉及从鸡血藤中分离得到的一种新的异黄酮化合物Ⅰ，其药物组合物及其制备方法和用途。。
背景技术
鸡血藤是一味传统活血化瘀中药，以其藤汁红如鸡血而得名，药用历史悠久，始见于《本草备要》，历代本草均有记载，《中国药典》规定其原植物为密花豆SpatholobussuberectusDunn，生于山野、深谷、疏林、密林中的阴湿处，它主要分布于广西、广东。鸡血藤又名大血藤、血藤、血风藤、三叶鸡血藤，性温，味苦、甘，归肝、肾经。鸡血藤为中医治疗血症和风湿的重要药物。现代研究表明，鸡血藤具有良好的抗病毒和抗肿瘤作用，能提高病人的免疫力。
鸡血藤化学成分多样，主要含有黄酮类、萜类、木质素类及蒽醌类等化学成分。目前分离得到的代表性化合物包括：表无羁萜醇、胡萝卜苷、β-谷甾醇、7-酮基-β-谷甾醇、刺芒柄花素、芒柄花苷、樱黄素、阿佛洛莫生、大豆素、3,7-二羟基-6-甲氧基二氢黄酮醇、表儿茶精、异甘草苷元、3,4,2’,4’-四羟基查耳酮、甘草查耳酮A、苜猪酚、原儿茶酸、9-甲氧基香豆雌酚和木豆异黄酮等。这其中，很多都是黄酮类化合物。
免疫系统是机体防卫病原体入侵最有效的武器，它能发现并清除异物、外来病原微生物等引起内环境波动的因素。免疫功能是自身天然防御疾病的屏障，免疫功能失调，则免疫监视功能失去作用，不能清除突变细胞，也是引发肿瘤的原因之一。机体的免疫系统分为特异性免疫和非特异性免疫，非特异性免疫是与生俱来的，特异性免疫是主要的方式，这两种免疫方式通常都是协同作用的。参与免疫反应的有T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞及其分泌的免疫因子。IFN-γ在机体细胞免疫中的作用主要是激活免疫反应，不具有直接杀伤病毒的功能，但在机体对抗病毒感染和肿瘤侵袭的过程中具有重要的地位。因此，通过研究化合物对小鼠全血和脾淋巴细胞培养上清中的IFN-γ浓度水平影响的试验方法能够在一定程度上反映一个化合物在抗病毒感染和抗肿瘤方面的研究价值和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种从鸡血藤中分离得到的一种新的异黄酮化合物Ⅰ，其药物组合物及其制备方法和用途。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
本发明新的异黄酮化合物Ⅰ的结构式如下：
本发明的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物Ⅰ和药学上可接受的载体。
本发明的化合物Ⅰ的制备方法：鸡血藤粉碎，75%乙醇回流提取3次，每次3h，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。乙酸乙酯萃取物用硅胶柱色谱分离，依次用氯仿-甲醇按照体积比10:0，9:1，7:1，6:4，0:10梯度洗脱得到5个组分。组分3经硅胶柱色谱，依次用氯仿-甲醇按体积比95:5，80:10，70:10梯度洗脱，得到3个组分。组分2经聚酰胺柱色谱，用氯仿-甲醇体积比9:1洗脱，得到纯的化合物Ⅰ。
本发明的化合物Ⅰ在制备提高血清IFN-γ浓度的药物中的应用。
本发明的化合物Ⅰ在制备抗病毒感染或抗肿瘤药物中的应用。
本发明的上述药物组合物在制备提高血清IFN-γ浓度的药物中的应用。
本发明的上述药物组合物在制备抗病毒感染或抗肿瘤药物中的应用。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物Ⅰ，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
附图说明
图1为化合物Ⅰ结构式；
图2为不同浓度化合物Ⅰ作用下小鼠全血培养上清中的IFN-γ的浓度变化；
图3为不同浓度化合物Ⅰ作用下小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ的浓度变化；
图4为2.5μg/ml化合物Ⅰ作用不同时间下小鼠脾细胞的培养上清中IFN-γ浓度变化；
图5为不同浓度化合物Ⅰ作用下Balb/c小鼠脾细胞的增殖情况；
图6为1μg/ml化合物Ⅰ在不同作用时间下Balb/c小鼠脾细胞的增殖情况。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
实施例1：
1、主要试剂：乙醇、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇购自南京化学试剂有限公司，氯仿和甲醇购自国药集团化学试剂有限公司。
2、提取分离方法：10kg鸡血藤粉碎，75%乙醇回流提取3次（30L×3），每次3h，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用1.5L石油醚、1.5L乙酸乙酯和1.5L水饱和正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。乙酸乙酯萃取物（485g）用硅胶柱色谱分离，依次用氯仿-甲醇按照体积比10:0，9:1，7:1，6:4，0:10梯度洗脱得到5个组分。组分3（218g）经硅胶柱色谱，依次用氯仿-甲醇按体积比95:5，80:10，70:10梯度洗脱，得到3个组分。组分2（76g）经聚酰胺柱色谱，用氯仿-甲醇体积比9:1洗脱，得到纯的化合物Ⅰ（55mg）。
3、结构确证：浅黄色粉末；HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z379.0844，结合核磁可得分子式为C19H16O7，不饱和度为12。1H-NMR（MeOH-d 4,δppm,600MHz）和13C-NMR（MeOH-d 4,δppm,150MHz）数据见表1。结合二维谱及该类化合物核磁数据可确定其结构。
表11HNMR和13CNMR信号归属
实施例2：
一、材料和仪器
化合物Ⅰ为自制，归一化纯度96%。Balb/C小鼠购自南京农业大学实验动物中心，体重18-22g；肝素钠为SigmaAldrich公司产品；ConA购自北京鼎国生物技术有限公司；IFN-γELISA（m）检测试剂盒及TNF-alphaELISA（m）检测试剂盒均为武汉博士德生物工程有限公司产品。RPMI-1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清（FBS）及其他细胞培养试剂购于南京建成生物科技有限公司。
ELISA用37℃恒温箱为北京六一公司产品；微孔板分光光度计为Biotek公司产品；细胞培养用CO2恒温细胞培养箱为ThermoFisher公司产品；MTT试验用平板离心机为湖南湘仪公司产品；涡旋及平板振荡器为北京六一公司产品。
二、试验方法
1、酶联免疫吸附试验检测不同浓度化合物Ⅰ作用下小鼠全血中的IFN-γ浓度变化
1.1小鼠全血的采集
麻醉和消毒：将Balb/C小鼠行乙醚麻醉，将麻醉的小鼠仰卧保定于保定板上，剪去胸部被毛并用酒精棉球擦拭消毒；
采血：1ml注射器内预先加入0.2ml0.1mg/ml的肝素钠溶液，在小鼠左胸第三、四肋间，于心脏搏动最明显处进针，当针头刺入心脏时，血会自动进入针管，每只小鼠可采约0.8ml全血；轻轻反复颠倒针管数次，使采集的血液与肝素钠溶液混匀。待用。
1.2实验分组
实验组：采集的小鼠全血按1:5比例用无血清、含1%青链霉素的RPMI-1640培养基稀释。稀释的全血铺于圆底96孔培养板，每孔200μl。每孔加入100U/ml的IL-2，然后分别加入终浓度为0.1、0.5、1、2.5、5μg/ml的化合物Ⅰ，37℃、5%CO2培养7天。
阳性对照组：采集的小鼠全血按1:5比例用无血清、含1%青链霉素的RPMI-1640培养基稀释。稀释的全血铺于圆底96孔培养板，每孔200μl。每孔加入100U/ml的IL-2，然后分别加入终浓度为10μg/ml的ConA。37℃，5%CO2培养7D。
阴性对照组：采集的小鼠全血按1:5比例用无血清、含1%青链霉素的RPMI-1640培养基稀释。稀释的全血铺于圆底96孔培养板，每孔200μl。每孔加入100U/ml的IL-2。37℃，5%CO2培养7D。
背景对照组：采集的小鼠全血按1:5比例用无血清、含1%青链霉素的RPMI-1640培养基稀释。稀释的全血铺于圆底96孔培养板，每孔200μl，不加IL-2。37℃，5%CO2培养7D。
1.3ELISA检测全血培养上清中IFN-γ的浓度
（1）按照IFN-γELISA（m）检测试剂盒说明书指示准备ELISA实验。
（2）配制10000pg/ml标准品：取1ml样品稀释液加入标准品管（内含10ngIFN-γ标准品粉末）内，盖好后静置10min以上，然后反复颠倒，搓动以助溶解。
（3）配制2000pg/ml标准品：取0.2ml10000pg/ml标准品加入有0.8ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀，做上标记。
（4）配制1000pg/ml~31.2pg/ml标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3ml样品稀释液，分别标记上1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.2pg/ml。取0.3ml2000pg/ml的标准品加入标记1000pg/ml的管中，混匀后同样取出0.3ml,加入下一只管中。其余的管同此类推，直到最后一只样品管。（注：此标准品需在实验前2h准备。）
（5）取10μl生物素标记抗小鼠IFN-γ抗体，加入抗体稀释液990μl，轻轻混匀，配制成生物素标记抗小鼠IFN-γ抗体工作液。（抗体工作液需在实验前2h配制好。）
（6）取10μl亲和素-过氧化物酶复合物（ABC），加入ABC稀释液990μl，轻轻混匀，配制成ABC工作液。（ABC工作液需在实验前1h配制好。）
（7）将稀释好的ABC工作液和TMB显色液预先在37℃中平衡至少30min。
（8）计算本次检测所需的预包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。计算方法为：总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放入冰箱中。
（9）将2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.2pg/ml的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。
（10）抗原包被：将各实验组培养的全血于1500rpm离心5min，收集上清，直接加入样品孔中，每孔100μl。
（11）酶标板加上盖，37℃反应90min。然后甩去板内液体，在吸水纸上拍几下，去除残余液体。此步骤不需洗涤。
（12）一抗孵育：向样品孔中每孔加入100μl准备好的生物素抗小鼠IFN-γ抗体工作液，（TMB空白显色孔除外）。37℃反应60min。
（13）洗涤：用0.01MTBS或0.01MPBS洗涤3次，每次浸泡1min左右（每孔洗液至少300μl）。
（14）二抗孵育：向样品孔中每孔加入100μl准备好ABC工作液，（TMB空白显色孔除外）。37℃反应30min。
（15）洗涤：用0.01MTBS或0.01MPBS洗涤3次，每次浸泡1-2min（每孔洗液至少300μl）。
（16）显色：依次向孔中加入TMB显色液，每孔90μl，37℃避光反应25-30min。（此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显。）
（17）终止：按每孔0.1ml依次向孔中加入TMB终止液，每孔100μl。（此时蓝色即刻转为黄色。）
（18）测量：立即用酶标仪在450nm读取OD值。
（19）分析：将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线，根据样品的吸光值计算出样品的浓度。
2、酶联免疫吸附试验检测不同浓度化合物Ⅰ作用下小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ浓度变化
2.1小鼠脾细胞的收集
（1）将Balb/C小鼠断颈处死后，用75%乙醇溶液浸泡5min，取出小鼠置于超净台内的无菌平皿上；
（2）用无菌镊子夹起腹部皮肤，无菌眼科剪剪开腹部皮毛层，并用75%乙醇棉球擦拭开口部位，再用另一把无菌眼科剪剪开腹膜，使脾脏暴露出来；
（3）用无菌镊子钝性分离脾脏，并浸泡于高压蒸汽灭菌过的DHank’s缓冲液中5min，洗去血水；
（4）在无菌平皿中加入5ml无菌PBS缓冲液，将取出的脾脏置于无菌的200目筛网上，在PBS溶液中研磨，制成细胞悬液，研磨过程中注意保持筛网湿润，干燥会导致细胞活力丧失；
（5）将制备的细胞悬液至于10ml离心管中，1500rpm，离心5min，并去除上清液；
（6）向管中加入3ml配好的红细胞裂解液（Tris-NH4Cl），混匀后静置5ml，1000rpm离心5min，吸弃上清；
（7）向管中加入5ml无菌PBS混匀，1000rpm离心5min，吸弃上清，重复一次即得到小鼠脾淋巴细胞。
2.2实验分组
实验组：提取的小鼠脾细胞用含5%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基2×105个/ml的浓度接种于6孔培养板上。每孔加入100U/ml的IL-2，然后分别加入终浓度为0.1、0.5、1、2.5、5μg/ml的化合物Ⅰ。37℃，5%CO2培养18小时。
阳性对照：提取的小鼠脾细胞用含5%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基2×105个/ml的浓度接种于6孔培养板上。每孔加入100U/ml的IL-2，然后分别加入终浓度为10μg/ml的化合物Ⅰ。37℃，5%CO2培养18小时。
阴性对照：提取的小鼠脾细胞用含5%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基2×105个/ml的浓度接种于6孔培养板上。每孔加入100U/ml的IL-2。37℃，5%CO2培养18小时。
背景对照：提取的小鼠脾细胞用含5%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基2×105个/ml的浓度接种于6孔培养板上，不加IL-2。37℃，5%CO2培养18小时。
2.3ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ的浓度
（1）标准品的稀释、生物素标记抗小鼠IFN-γ抗体工作液的配制、ABC工作液的配制、ABC工作液和TMB显色液的平衡、实验所需样品孔的计算方法及标准曲线的制作方法同“全血培养上清中IFN-γ浓度的检测”。
（2）抗原包被：将各实验组培养的细胞于1500rpm离心5min，收集上清，直接加入样品孔中，每孔100μl。
（3）酶标板加上盖，37℃反应90min。然后甩去板内液体，在吸水纸上拍几下，去除残余液体。此步骤不需洗涤。
（4）一抗孵育、二抗孵育及洗涤、显色、终止、OD值测量和分析方法同“全血培养上清中IFN-γ浓度的检测”。
3、酶联免疫吸附试验检测化合物Ⅰ作用不同时间下小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ浓度变化
3.1小鼠脾细胞的收集：同前。
3.2实验分组：
实验组：提取的小鼠脾细胞用含5%胎牛血清、100U/ml的IL-2和1%青链霉素的RPMI-1640培养基以2×105个/ml的浓度接种于6孔培养板上，加入终浓度为2.5μg/ml的化合物Ⅰ。37℃，5%CO2培养6、12、18、24小时。
阴性对照：提取的小鼠脾细胞用含5%胎牛血清、100U/ml的IL-2和1%青链霉素的RPMI-1640培养基以2×105个/ml的浓度接种于6孔培养板上，加入终浓度为2.5μg/ml的化合物Ⅰ。不进行培养。
3.3ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ的浓度
（1）标准品的稀释、生物素标记抗小鼠IFN-γ抗体工作液的配制、ABC工作液的配制、ABC工作液和TMB显色液的平衡、实验所需样品孔的计算方法及标准曲线的制作方法同前。
（2）抗原包被：将各实验组培养的细胞于1500rpm离心5min，收集上清，直接加入样品孔中，每孔100μl。
（3）酶标板加上盖，37℃反应90min。然后甩去板内液体，在吸水纸上拍几下，去除残余液体。（此步骤不需洗涤。）
（4）一抗孵育、二抗孵育及洗涤、显色、终止、OD测量和分析方法同前。
4、MTT法检测不同浓度化合物Ⅰ作用下小鼠脾细胞增殖的变化
4.1小鼠脾细胞的收集：同前。
4.2实验分组：
实验组：离心收集提取的小鼠脾细胞，用含不含血清的的RPMI-1640培养基洗两次，洗后的细胞用含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基将细胞浓度调至1×104个/ml，按每孔200μl接种于96孔培养板上。每孔加入100U/ml的IL-2，然后分别加入终浓度为0.1、0.5、1、2.5、5μg/ml的化合物Ⅰ。37℃，5%CO2培养18小时。
阳性对照：离心收集提取的小鼠脾细胞，用含不含血清的的RPMI-1640培养基洗两次，洗后的细胞用含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基将细胞浓度调至1×104个/ml，按每孔200μl接种于96孔培养板上。每孔加入100U/ml的IL-2，然后分别加入终浓度10μg/ml的ConA。37℃，5%CO2培养18小时。
阴性对照：离心收集提取的小鼠脾细胞，用含不含血清的的RPMI-1640培养基洗两次，洗后的细胞用含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基将细胞浓度调至1×104个/ml，按每孔200μl接种于96孔培养板上。每孔加入100U/ml的IL-2。37℃，5%CO2培养18小时。
背景对照：离心收集提取的小鼠脾细胞，用含不含血清的的RPMI-1640培养基洗两次，洗后的细胞用含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基将细胞浓度调至1×104个/ml，按每孔200μl接种于96孔培养板上，不加IL-2。37℃，5%CO2培养18小时。（每个样品做5个复孔。）。
4.3MTT法检测小鼠脾细胞的增殖。
（1）呈色：按每孔15μl向孔中依次加入配制好的0.5%MTT溶液，孵育4h，然后终止培养。
（2）使用平板离心机3000rpm离心5min，小心地吸去孔中的培养上清液。
（3）依次向孔中加入150μlDMSO。
（4）将96孔板置于水平摇床上低速振荡10min，使结晶充分溶解。
（5）比色：使用微孔板分光光度计于570nm处读取各孔OD值并进行分析。
5、MTT法检测化合物Ⅰ作用不同时间下小鼠脾细胞增殖的变化
5.1小鼠脾细胞的收集：同前。
5.2实验分组：
实验组：离心收集提取的小鼠脾细胞，用含不含血清的的RPMI-1640培养基洗两次，洗后的细胞用含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基将细胞浓度调至1×104个/ml，按每孔200μl接种于96孔培养板上，加入终浓度为2.5μg/ml的化合物Ⅰ。分别置于37℃，5%CO2培养6、12、18、24小时。
阴性对照：离心收集提取的小鼠脾细胞，用含不含血清的的RPMI-1640培养基洗两次，洗后的细胞用含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基将细胞浓度调至1×104个/ml，按每孔200μl接种于96孔培养板上，加入终浓度为2.5μg/ml的化合物Ⅰ。不进行培养。
5.3MTT法检测小鼠脾细胞的增殖：同前。
6、结果分析
所有实验均进行至少三次重复，数据以三次实验结果的均值±标准差（SD）表示。数据之间的差异采用单因素方差分析法进行计算，对所有分析，当p<0.05为显著差异，p<0.01为极显著差异。数据分析采用SPSS15.0软件进行。
附图1所示为不同浓度化合物Ⅰ作用下Balb/c小鼠全血培养上清中的IFN-γ浓度变化，反映不同浓度化合物Ⅰ对Balb/c小鼠全血分泌IFN-γ功能的影响。由图中可见，与背景对照组和阴性对照组相比，实验组中0.5、1、2.5和5μg/ml加药样品的ELISA结果表现出极显著差异。
附图2所示为不同浓度化合物Ⅰ作用下小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ的浓度变化。反映不同浓度化合物Ⅰ作用对小鼠脾细胞分泌IFN-γ功能的影响。从图中可见，与背景对照组和阴性对照组相比，实验组中0.5、1、2.5和5μg/ml加药样品的ELISA结果表现出极显著差异。
附图3所示为2.5μg/ml化合物Ⅰ作用不同时间下小鼠脾细胞的培养上清中IFN-γ浓度变化，反映化合物Ⅰ作用不同时间对小鼠脾细胞分泌IFN-γ功能的影响。从图中可见，与阴性对照组相比，化合物Ⅰ作用6、12、18和24h后细胞培养上清的ELISA结果均表现出极显著差异。
附图4所示为不同浓度化合物Ⅰ作用下Balb/c小鼠脾细胞的增殖情况。反映不同浓度的化合物Ⅰ对Balb/c小鼠脾细胞增殖功能的影响。从图中可见，与背景对照组和阴性对照组相比，实验组中0.5、1、2.5和5μg/ml加药样品的MTT结果显示出极显著差异，表明以上浓度的化合物Ⅰ能够极显著促进Balb/c小鼠脾细胞的增殖。
附图5所示为1μg/ml化合物Ⅰ在不同作用时间下Balb/c小鼠脾细胞的增殖情况。反映最佳化合物Ⅰ作用浓度下不同的作用时间对Balb/c小鼠脾细胞的增殖功能的影响。从图中可见，与阴性对照组相比较，1μg/ml化合物Ⅰ作用6、12、18和24h后的样品MTT结果均表现出极显著差异。
本实验研究结果表明，化合物Ⅰ能极显著提高小鼠全血培养上清和脾淋巴细胞培养上清中的IFN-γ浓度水平，反映化合物Ⅰ在抗病毒感染和抗肿瘤方面具有非常好的研究价值和应用前景。
实施例3：
片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用有机酸（酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙二酸等）或无机酸（盐酸、硫酸、磷酸等）制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例4：
口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用有机酸（酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙二酸等）或无机酸（盐酸、硫酸、磷酸等）制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
实施例5：
胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用有机酸（酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙二酸等）或无机酸（盐酸、硫酸、磷酸等）制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:10的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
实施例6：
注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用有机酸（酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙二酸等）或无机酸（盐酸、硫酸、磷酸等）制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例7：
无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物Ⅰ，以及利用有机酸（酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙二酸等）或无机酸（盐酸、硫酸、磷酸等）制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
Claims (7)
1.具有下述结构式的异黄酮化合物Ⅰ，
2.药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物Ⅰ和药学上可接受的载体。
3.权利要求1所述的化合物Ⅰ的制备方法，其特征在于：鸡血藤粉碎，75%乙醇回流提取3次，每次3h，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；乙酸乙酯萃取物用硅胶柱色谱分离，依次用氯仿-甲醇按照体积比10:0，9:1，7:1，6:4，0:10梯度洗脱得到5个组分；组分3经硅胶柱色谱，依次用氯仿-甲醇按体积比95:5，80:10，70:10梯度洗脱，得到3个组分；组分2经聚酰胺柱色谱，用氯仿-甲醇体积比9:1洗脱，得到纯的化合物Ⅰ。
4.权利要求1所述的化合物Ⅰ在制备提高血清IFN-γ浓度的药物中的应用。
5.权利要求1所述的化合物Ⅰ在制备抗病毒感染或抗肿瘤药物中的应用。
6.权利要求2所述的组合物在制备提高血清IFN-γ浓度的药物中的应用。
7.权利要求2所述的组合物在制备抗病毒感染或抗肿瘤药物中的应用。
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| 《鸡血藤黄酮类化合物的研究》;郑岩;《中国中药杂志》;20080131;第33卷(第2期);全文 * |
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