CN108823143A - 一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，具体步骤如下:获取紫苏无菌苗；取无菌苗外植体诱导质地优良的愈伤组织；以紫苏愈伤组织为原材料，采用Box‑Behnken中心组合设计和响应面法对液体悬浮培养生产迷迭香酸的最佳条件进行优化；紫苏细胞悬浮培养最优条件的确定及验证。发明方法的迷迭香酸产量提高近10倍，同时更快速地获取高产迷迭香酸的愈伤组织，节约成本、节约室内培养空间、可以周年生产、培养效益明显增加，不受季节及自然生态条件的限制，能够稳定、高效、快速地获得大量含量较高的紫苏愈伤组织，为紫苏细胞大规模培养迷迭香酸提供理论依据和技术参考；具有广阔的应用前景和显著的社会经济效益。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞培养生产次生代谢产物的技术领域，具体为一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法。
背景技术
紫苏(Perilla frutescens(L.)Britt.)，别名荏、白苏、赤苏等，为唇形科一年生草本植物，原产于中国，主要分布于中国、印度、日本、韩国等国家，是我国卫生部首批颁布的既是食品又是药品的60种中药材之一。紫苏叶中含有多种具有生理活性的天然化学成分，如花青素、木犀草素、芹菜素、儿茶素、迷迭香酸(Rosmarinic Acid,RosA)等，其中迷迭香酸含量较高。迷迭香酸是一种天然的水溶性抗氧化剂，具有多种生物活性，具有明显的抗炎、抗氧化、免疫抑制等作用，广泛应用于食品、医药和化妆品领。因此迷迭香酸的生产越来越受到人们的广泛关注，如何有效提高植物中迷迭香酸的含量也成为当今研究的热门话题之一。
植物细胞悬浮培养是植物细胞生长的微生物化，具有细胞分散性好，形状及大小一致、生产迅速、易于控制等优势，已被广泛应用于生理生化、分子生物学等基础研究以及育种、次生代谢物生产等领域。自从1956年，Routine和Nickel首次提出用植物细胞培养技术生产有用次级代谢产物以来，据不完全统计应用于植物细胞培养技术生产次生代谢产物的植物已达百种以上。紫苏细胞悬浮培养生产次生代谢物质如花青素、三萜类化合物等已有报道，但关于细胞悬浮培养生产迷迭香酸研究报道少且产量较低。本研究旨在通过响应面法优化紫苏细胞悬浮培养生产迷迭香酸的条件，为紫苏细胞大规模培养次生代谢产物提供理论依据和技术参考。
发明内容
本发明为解决天然的植物次生代谢产物迷迭香酸产量较低，而化学合成迷迭香酸非绿色，成本高的问题，提供了一种紫苏细胞悬浮生产高产迷迭香酸的方法，本方法不受季节及自然生态条件的限制，能够稳定、高效、快速地获得大量含量较高的紫苏愈伤组织，为紫苏细胞大规模培养迷迭香酸提供理论依据和技术参考。
为实现上述目的本发明采用以下技术方案：一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，包括如下步骤：
(1)紫苏无菌苗的获得
将紫苏种子进行清洗灭菌，除去毒性较高的HgCl2，将灭菌后的种子接种到含30mL无激素的MS基本培养基的组培瓶中萌发，一定温度光照下，下胚轴长至2～3cm，子叶展开时可作为外植体；
(2)愈伤组织的诱导
在无菌条件下，将生长正常、茁壮的紫苏无菌苗下胚轴切段，子叶切块，接种于含植物激素组合的诱导培养基上，下胚轴横放于培养基上，轻按使切口两端充分接触培养基，子叶平铺于培养基表面；
(3)建立紫苏细胞悬浮培养体系，获得稳定的紫苏悬浮培养细胞系；
将诱导培养基上生长旺盛，表面干燥，质地松散的浅黄色愈伤组织转到B5液体培养基中进行悬浮培养，悬浮培养若干天后用80目的无菌尼龙网对悬浮培养物进行过滤，将大细胞团块除去，保留分散性较好的小细胞团以及单细胞，再加入新鲜的液体培养基进行系带培养，如此反复在B5液体培养基连续继代3-4次，将不规则细胞淘汰，最终建立起稳定的悬浮细胞系；
(4)优化液体悬浮培养生产迷迭香酸的最佳激素配比
采用Box-Behnken试验设计方案，选择苯丙氨酸浓度，酪氨酸浓度、酵母提取物浓度以及激素类似物CPPU浓度为考察变量，以迷迭香酸含量为响应值设计中心组合试验；试验处理共29组，每组重复三次。最终建立表征迷迭香酸积累量与苯丙氨酸、酪氨酸、酵母提取物以及CPPU添加量关系的二次多项式回归方程的预测模型，并使用Design Expert 8.0软件初步确定紫苏细胞悬浮培养高产迷迭香酸的最佳方案；
(5)细胞干重及迷迭香酸含量测定
将悬浮细胞倒在尼龙网上，真空抽滤，60℃烘12h后称干重，每个处理重复三次，准确称取待测愈伤组织粉末0.1g，加入2mL 60％乙醇溶液，超声波60℃提取20min，离心，获得提取液，60％乙醇定容至2mL，采用FeSO4显色法测定悬浮培养物中迷迭香酸含量；
(6)紫苏细胞悬浮培养最优条件的确定及验证
使用Design Expert 8.0软件确定紫苏细胞悬浮培养的最佳方案，再根据上述条件做验证实验，以充分验证所建模型的有效性，说明回归方程能否较真实地反映各因素对悬浮培养生产迷迭香酸的影响。
作为本发明进一步的方案：将紫苏种子用自来水冲洗两次后先经70％(V/V)乙醇消毒30s，用无菌水洗涤3次，接着分别在0.1％升汞溶液中浸泡l0min，然后用无菌水洗涤3-5次，每次不少于5min，以彻底除去毒性较高的HgCl2。
作为本发明进一步的方案：所述步骤(1)中，中紫苏种子为9月中下旬收获的自然成熟种子，棕褐色、籽粒饱满，一定温度光照下具体为：在25士1℃下，每日光照16h，13天龄的无菌苗。
作为本发明进一步的方案：所述步骤(1)中，MS基本培养基中附加3％蔗糖，琼脂，pH5.8，121℃灭菌20min。
作为本发明进一步的方案：所述步骤(2)中，将11-13日龄的紫苏幼苗下胚轴切成0.5～1cm的小段，子叶切成0.5cm2的小块，接种于含植物激素组合(B5+6-BA 3.0mg/L+NAA0.3mg/L)的诱导培养基中上，培养室的温度控制在25～28℃，每日光照时间为10～12h，光照强度为1600～2000Lux。
作为本发明进一步的方案：所述步骤(3)中，液体悬浮培养的基本培养条件为，培养温度25～28℃，培养时间8-15d，pH值为8，接种密度30g/L，蔗糖浓度30g/L，摇床转速120r/min。
本发明在确定了悬浮培养基本条件的基础上，从细胞水平和基因水平入手，以诱导迷迭香酸积累的重要前提物质(酵母提取物、苯丙氨酸、酪氨酸)和激素类似物CPPU为优化变量，采用Box-Behnken中心组合设计和响应面法对最佳培养条件进行优化，并建立表征迷迭香酸积累量与苯丙氨酸、酪氨酸以及酵母提取物添加量关系的二次多项式回归方程的预测模型，并使用Design Expert 8.0软件初步确定紫苏细胞悬浮培养高产迷迭香酸的最佳方案。
在液体悬浮培养基本条件及优化条件的基础上，做三次平行试验以验证最佳条件，其误差小于0.5％，以表明紫苏液体悬浮培养生产迷迭香酸的预测值与实测值之间具有良好的拟合性，充分验证了所建模型的有效性，说明回归方程能否较真实地反映各因素对悬浮培养生产迷迭香酸的影响。
本发明中所用的B5培养基的主要特点是含有较低的铵，相对MS基本培养基而言，较少的铵可以有效降低其对愈伤组织的生长抑制作用，也可以有效防止愈伤组织的褐化现象。
特别注意的是在进行液体悬浮培养之前，务必挑选松脆型愈伤组织作为悬浮原料，因为这样的愈伤组织内有大量较大的细胞间隙，细胞排列无次序，容易分散成单细胞或少数几个细胞组成的小细胞团，是进行悬浮培养的最适宜材料。现有的提取迷迭香酸的方法有植提法和悬浮细胞培养法。植提法只能以大田中已经成熟的植物为材料提取植物体内有限的迷迭香酸，并且在提取的过程中不可避免地运用有机溶剂，该方法的实施不仅严重受到季节的限制，而且有机溶剂的使用对迷迭香酸的进一步应用存在潜在威胁。现有的悬浮细胞培养法虽然解决了材料的季节性限制问题以及有机溶剂的使用问题，但其迷迭香酸的产量并没有得以提高。
本发明的有益效果是：与现有的生产迷迭香酸的方法相比，本发明提供的是一种紫苏细胞悬浮培养生产迷迭香酸的优化方法。本方法在遵循及验证其他方法的基础上，特别从细胞水平和基因水平出发，着重以诱导迷迭香酸积累的重要前提物质(酵母提取物、苯丙氨酸、酪氨酸)以及激素类似物(氯吡苯脲CPPU)为优化变量，采用Box-Behnken中心组合设计和响应面法对最佳培养条件进行优化，建立表征迷迭香酸积累量与这些优化变量之间关系的二次多项式回归方程的预测模型，确定了紫苏细胞悬浮培养高产迷迭香酸的最佳方案且得以验证。其中，激素类似物(CPPU)是经过国家批准的植物生长调节剂,可以有效促进细胞分裂和增大；苯丙氨酸和酪氨酸是植物中迷迭香酸代谢途径的两个重要前提物质，在植物体内酶的催化作用下可以反应生成4-香豆酰Co-A和3,4-二羟基苯乳酸，二者在迷迭香酸合成酶的作用下生成迷迭香酸；酵母提取物的存在可以有效提升苯丙氨酸氨裂解酶和酪氨酸氨基转移酶的活性，从而有效提高迷迭香酸的产量。
总之本发明方法采用B5培养基并对前提物等三个因素特别优化后，迷迭香酸产量提高近10倍，同时还可以更快速地获取高产迷迭香酸的愈伤组织，节约成本、节约室内培养空间、可以周年生产、培养效益明显增加，不受季节及自然生态条件的限制，能够稳定、高效、快速地获得大量含量较高的紫苏愈伤组织，为紫苏细胞大规模培养迷迭香酸提供理论依据和技术参考。具有广阔的应用前景和显著的社会经济效益。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
(1)紫苏无菌苗的获得
将紫苏种子用自来水冲洗两次后先经70％(V/V)乙醇消毒30s，用无菌水洗涤3次，接着分别在0.1％升汞溶液中浸泡l0min，然后用无菌水洗涤3-5次，每次不少于5min，以彻底除去毒性较高的HgCl2。将灭菌后的种子接种到含30mL无激素的MS基本培养基(附加3％蔗糖，琼脂，pH5.8，121℃灭菌20min)的组培瓶中萌发。在25士1℃下，每日光照16h。13天龄的无菌苗，下胚轴长至2～3cm，子叶展开时可作为外植体。
(2)愈伤组织的诱导
在无菌条件下，将步骤(1)获得的生长正常、茁壮的紫苏无菌苗下胚轴切为0.5cm的小段，子叶切为0.2cm2的小块，接种于含BA(3mg/mL)，NAA(0.3mg/mL)激素组合的MS固体培养基上，置于培养间(25士1℃)培养，日光灯管每天补充光照16小时，光强2000Lux，隔20天继代一次。
(3)建立紫苏细胞悬浮培养体系，获得稳定的紫苏悬浮培养细胞系。
在无菌条件下，将步骤(2)获得的表面干燥，生长旺盛，质地疏松的浅黄色愈伤组织夹碎细化后，转接到B5液体培养基中进行悬浮培养。培养温度为25～28℃，培养时间8-15d，pH值为8，接种密度30g/L，蔗糖浓度30g/L，摇床转速为120r/min，6-BA浓度为3mg/mL，NAA浓度为0.3mg/mL，悬浮培养若干天后用80目的无菌尼龙网对悬浮培养物进行过滤，将大细胞团块除去，保留分散性较好的小细胞团以及单细胞，再加入新鲜的液体培养基进行系带培养。如此反复在B5液体培养基连续继代3-4次(培养时间逐渐缩短)，将不规则细胞淘汰，最终建立起稳定的悬浮细胞系。
(4)优化液体悬浮培养生产迷迭香酸的最佳激素配比及迷迭香酸含量测定
采用Box-Behnken试验设计方案，选择苯丙氨酸浓度、酪氨酸浓度、酵母提取物浓度以及CPPU浓度为考察变量，以迷迭香酸含量为响应值设计中心组合试验。实验处理共29组，每组重复三次。最终建立表征迷迭香酸积累量与苯丙氨酸、酪氨酸以及酵母提取物添加量关系的二次多项式回归方程的预测模型
Y＝21.25－0.26X1－0.82X2+1.24X3+1.50X4+1.10X1X2－0.32X1X3－1.73X1X4+0.51X2X3－0.86X2X4+1.34X3X4－2.28X1 2－6.62X2 2+0.53X3 2－4.79X4 2，
其中，X1：CPPU，X2：酵母提取物，X3：酪氨酸，X4：苯丙氨酸，并使用Design Expert8.0软件初步确定紫苏细胞悬浮培养高产迷迭香酸的最佳方案：CPPU浓度2.50mg/mL、酵母提取物浓度5.00mg/L、酪氨酸浓度0.07mg/L、苯丙氨酸浓度0.09g/L，迷迭香酸含量可达23.61mg/g。
(5)紫苏细胞悬浮培养最优条件的确定及验证
使用Design Expert 8.0软件得到紫苏细胞悬浮培养的最佳方案为：CPPU浓度2.50mg/mL、酵母提取物浓度5.00mg/L、酪氨酸浓度0.07mg/L、苯丙氨酸浓度0.09g/L，此条件下迷迭香酸积累量达到23.61mg/g。根据上述条件做验证试验，紫苏细胞悬浮培养生产迷迭香酸平均含量为23.58mg/g，其误差为0.13％，接近预测值，表明紫苏液体悬浮培养生产迷迭香酸的预测值与实测值之间具有良好的拟合性，充分验证了所建模型的有效性，说明回归方程能较真实地反映各因素对悬浮培养生产迷迭香酸的影响。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)紫苏无菌苗的获得
将紫苏种子进行清洗灭菌，除去毒性较高的HgCl2，将灭菌后的种子接种到含30mL无激素的MS基本培养基的组培瓶中萌发，一定温度光照下，下胚轴长至2～3cm，子叶展开时可作为外植体；
(2)愈伤组织的诱导
在无菌条件下，将生长正常、茁壮的紫苏无菌苗下胚轴切段，子叶切块，接种于含植物激素组合的诱导培养基上，下胚轴横放于培养基上，轻按使切口两端充分接触培养基，子叶平铺于培养基表面；
(3)建立紫苏细胞悬浮培养体系，获得稳定的紫苏悬浮培养细胞系；
将诱导培养基上生长旺盛，表面干燥，质地松散的浅黄色愈伤组织转到B5液体培养基中进行悬浮培养，悬浮培养若干天后用80目的无菌尼龙网对悬浮培养物进行过滤，将大细胞团块除去，保留分散性较好的小细胞团以及单细胞，再加入新鲜的液体培养基进行系带培养，如此反复在B5液体培养基连续继代3-4次，将不规则细胞淘汰，最终建立起稳定的悬浮细胞系；
(4)优化液体悬浮培养生产迷迭香酸的最佳激素配比
采用Box-Behnken试验设计方案，选择苯丙氨酸浓度，酪氨酸浓度、酵母提取物浓度以及激素类似物CPPU浓度为考察变量，以迷迭香酸含量为响应值设计中心组合试验；试验处理共29组，每组重复三次。最终建立表征迷迭香酸积累量与苯丙氨酸、酪氨酸、酵母提取物以及CPPU添加量关系的二次多项式回归方程的预测模型，并使用Design Expert 8.0软件初步确定紫苏细胞悬浮培养高产迷迭香酸的最佳方案；
(5)细胞干重及迷迭香酸含量测定
将悬浮细胞倒在尼龙网上，真空抽滤，60℃烘12h后称干重，每个处理重复三次，准确称取待测愈伤组织粉末0.1g，加入2mL 60％乙醇溶液，超声波60℃提取20min，离心，获得提取液，60％乙醇定容至2mL，采用FeSO4显色法测定悬浮培养物中迷迭香酸含量；
(6)紫苏细胞悬浮培养最优条件的确定及验证
使用Design Expert 8.0软件确定紫苏细胞悬浮培养的最佳方案，再根据上述条件做验证实验，以充分验证所建模型的有效性，说明回归方程能否较真实地反映各因素对悬浮培养生产迷迭香酸的影响。
2.根据权利要求1所述的紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中将紫苏种子进行清洗灭菌的具体步骤为：将紫苏种子用自来水冲洗两次后先经70％(V/V)乙醇消毒30s，用无菌水洗涤3次，接着分别在0.1％升汞溶液中浸泡l0min，然后用无菌水洗涤3-5次，每次不少于5min，以彻底除去毒性较高的HgCl2。
3.根据权利要求1所述的紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中，中紫苏种子为9月中下旬收获的自然成熟种子，棕褐色、籽粒饱满，一定温度光照下具体为：在25士1℃下，每日光照16h，13天龄的无菌苗。
4.根据权利要求1所述的紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中，MS基本培养基中附加3％蔗糖，琼脂，pH5.8，121℃灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中，将11-13日龄的紫苏幼苗下胚轴切成0.5～1cm的小段，子叶切成0.5cm2的小块，接种于含植物激素组合(B5+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L)的诱导培养基中上，培养室的温度控制在25～28℃，每日光照时间为10～12h，光照强度为1600～2000Lux。
6.根据权利要求1所述的紫苏高产迷迭香酸悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中，液体悬浮培养的基本培养条件为，培养温度25～28℃，培养时间8-15d，pH值为8，接种密度30g/L，蔗糖浓度30g/L，摇床转速120r/min。
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- 2018-05-24 CN CN201810506814.0A patent/CN108823143A/zh active Pending
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