CN105154342A - 一种羊肚菌液态菌种的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种羊肚菌液态菌种的培养方法，包括提供一种羊肚菌液态菌种培养基，将羊肚菌原种接种到所述羊肚菌液态菌种培养基中进行密封培养，当所述羊肚菌原种的菌丝萌发后，每天摇动所述羊肚菌液态菌种培养基1次，直至获得羊肚菌栽培种。本发明提供的羊肚菌液态菌种培养方法操作简单，培养出的羊肚菌栽培种菌丝生长快，菌丝产出均匀整齐，受其它菌种污染小，提高了羊肚菌人工种植的存活率和产量，且培养工艺简单易行，成本低。

Description

一种羊肚菌液态菌种的培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种羊肚菌液态菌种的培养方法。

背景技术

羊肚菌是一种珍贵稀有的野生食用菌，营养价值高。目前虽有报道称已实现羊肚菌的人工栽培,但所采用的羊肚菌菌种培养基成分往往会对羊肚菌菌种的生长质量产生较大影响，羊肚菌菌种培养过程中需要经过接种、静置培养和摇瓶培养等多个步骤，而且还需要向所述培养器皿中人工通入无菌空气，造成培养步骤繁琐、劳动强度高。因此，设计一种成分搭配合理的羊肚菌液态菌种培养基和一种培养工艺简单的羊肚菌液态菌种的培养方法对羊肚菌的栽培具有重大的现实意义。

为了解决以上存在的问题，人们一直在寻求一种理想的技术解决方案。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种羊肚菌液态菌种的培养方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是一种羊肚菌液态菌种的培养方法，具体包括以下步骤：

提供一种羊肚菌液态菌种培养基；

将羊肚菌原种接种到所述羊肚菌液态菌种培养基中进行密封培养，当所述羊肚菌原种的菌丝萌发后，每天摇动所述羊肚菌液态菌种培养基1次直至获得羊肚菌栽培种。

优选地，提供所述羊肚菌液态菌种培养基的步骤包括：

将松树枝200-300g、土豆200-400g和水1200ml-1800ml进行混合，然后依次经过煮沸、冷却、过滤处理得到滤液，将糖类物质15-30g加入到所述滤液中并溶解制得羊肚菌液态菌种营养滤液，取所述羊肚菌液态菌种营养滤液150ml置于培养瓶中，然后向所述培养瓶中加入洗净烘干的谷壳10-30g和碳酸钙1-5g，制得羊肚菌液态菌种培养基。

基于上述，制备所述羊肚菌液态菌种营养滤液步骤中，所述糖类物质是指蔗糖、葡萄糖或麦芽糖等，优选地，用水浸泡新鲜麦粒300-400g，并在室温下促使所述麦粒发芽直至麦芽长度约为所述麦粒长度的3-6倍，然后，将所述麦芽烘干并磨成麦芽粉，然后向所述麦芽粉中加入所述麦芽粉5-7倍质量的所述滤液，经糖化、过滤后制得羊肚菌液态菌种营养滤液。

优选地，所述羊肚菌原种菌丝萌发后，每间隔24小时摇动所述羊肚菌液态菌种培养基1次，使得所述羊肚菌液态菌种培养基中的谷壳完全被浸湿。简言之，在培养期间，每天定时摇动所述羊肚菌液态菌种培养基1次，比如每天早上8点、每天上午10点或每天下午3点摇动所述羊肚菌液态菌种培养基1次，使谷壳完全浸没在所述羊肚菌液态菌种培养基中等。

优选地，所述羊肚菌原种是通过对羊肚菌母种进行一级培养或二级培养而获得的。

基于上述，所述羊肚菌母种进行一级培养的步骤包括：

将棉籽壳20-30g、杂木屑15-20g、谷壳20-30g、麸皮15-25g、玉米粉8-12g分别用水浸泡，过滤捞出后分别加水煮沸，捞出沥干，然后进行混合制得混合料，向所述混合料中加入蔗糖5-10g、碳酸钙1-5g和磷肥1-5g，混合均匀制得羊肚菌一级原种培养基；

对所述羊肚菌一级原种培养基进行高温灭菌、冷却处理，然后向所述羊肚菌一级原种培养基中接入羊肚菌母种进行培养，获得羊肚菌一级原种。

基于上述，其中制备羊肚菌一级原种培养基过程中，将所述棉籽壳、杂木屑浸泡30-35小时，且每5小时换水一次，所述谷壳浸泡3-4小时，所述麸皮、玉米粉浸泡1-3小时。

基于上述，所述羊肚菌母种进行二级培养的步骤包括：

将松针100-200g、金针菇100-200g和水1200ml-1800ml进行混合、煮沸，冷却、过滤处理，制得羊肚菌二级原种营养液，然后将小麦20-30g、玉米25-40g、谷壳15-25g、米糠15-25g、蔗糖1-5g、石膏1-5g、磷肥1-5g混合均匀制得羊肚菌二级原种培养基混合料，并加入到与所述羊肚菌二级原种培养基混合料等质量的所述羊肚菌二级原种营养液中，混合均匀制得羊肚菌二级原种培养基；

将所述羊肚菌二级原种培养基进行高温灭菌、冷却处理，然后将羊肚菌一级原种接入到所述羊肚菌二级原种培养基中进行培养，获得羊肚菌二级原种。

基于上述，所述羊肚菌母种的培养方法包括如下步骤：

将土豆50-60g、琼脂8-14g、维生素B剂0.5-0.8g及葡萄糖5-7g加入1500ml的水中进行加热，直至所述琼脂全部煮化，得到羊肚菌母种培养基；对所述羊肚菌母种培养基进行高温灭菌、冷却处理，然后将羊肚菌菌株菌丝接入到所述羊肚菌母种培养基进行培养，获得所述羊肚菌母种。

本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说，

本发明所提供的羊肚菌液态菌种培养方法，在羊肚菌液态菌种培养的过程中，不需要对培养基进行连续摇动，只需每天对羊肚菌液态菌种培养基摇动一次即可，降低了培养过程所利用的设备的利用率，从而降低了生产成本，而且该培养方法简单、易于操作；每天采用定时摇动保证了所述羊肚菌液态菌种菌丝营养液的均匀性。进一步讲，羊肚菌菌丝的生长以谷壳为载体，利用谷壳之间的间隙吸收营养，并附着在液态表面上的谷壳上进行生长，无需额外向其培养基中通入无菌空气，减少了繁杂的操作和许多昂贵的无菌设备，节约了成本并缩短了菌种的培育时间。

更进一步讲，本发明中所述羊肚菌液态菌种培养基的原料经过煮汁后再使用，使得菌种培养基的养料分布比较均匀，有利于羊肚菌菌丝体吸收利用，产出的菌种整齐均匀。在菌种培育的各阶段采用不同的培养基原料，使得不同培养阶段的羊肚菌能够对培养基中的营养成分充分吸收，达到最好的培育效果。

附图说明

图1是实施例1中的粗柄羊肚菌926号的生长曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种羊肚菌液态菌种的培养方法，选用粗柄羊肚菌926号原种作为羊肚菌栽培种的菌株进行培养，具体包括以下步骤：

将松树枝200g、土豆200g和水1800ml混合、煮沸并保持30分钟，然后冷却至室温，过滤后制得滤液；将蔗糖30g加入到所述滤液中并溶解制得羊肚菌液态菌种营养滤液，取所述羊肚菌液态菌种营养滤液150ml置于培养瓶中，然后向所述培养瓶中加入洗净烘干的谷壳20g和碳酸钙5g，制得羊肚菌液态菌种培养基。

将所述羊肚菌液态菌种培养基放置于灭菌锅中，在1.5kg/cm3、110℃下灭菌0.5小时，取出冷却至室温后，将装有所述羊肚菌液态菌种培养基的三角瓶置于接种箱中密封2小时，然后将粗柄羊肚菌926号原种接入到所述羊肚菌液态菌种培养基中，置于30℃的培养室中进行密封培养，当所述羊肚菌原种菌丝萌发后，每天上午10点整定时摇动所述培养基1次至所述培养基中的谷壳完全被浸湿，直至获得粗柄羊肚菌926号栽培种。

为了更好的了解不同时期羊肚菌菌丝体的生长情况，确定液态培养时间，在生长时间为0-144h范围内，利用专用的采样器每12h进行1次取样，测定羊肚菌菌丝生物量。具体操作步骤为：羊肚菌菌种每阶段培养结束后选用采样器抽取所述三角瓶中适量的液体，以转速为4000r/min速度离心15min，然后弃去清液，将得到的羊肚菌菌丝体用蒸馏水清洗数次后，置于真空干燥箱中，40℃下烘干至恒重，计算培养得到的羊肚菌菌丝生物量。每组进行3次平行试验，所得数据取3次试验结果的平均值，以培养时间为横坐标，羊肚菌菌丝生物量为纵坐标，绘制羊肚菌的生长曲线。

计算公式如下：

Y=M/V

式中：Y代表羊肚菌菌丝生物量，单位g/L；

M代表菌丝体干燥后的质量，单位g；

V代表抽取液体的体积，单位L。

所得液态培养羊肚菌生长曲线如图1所示，从图中可以看出，液态培养羊肚菌生长曲线可以分为调整期、对数期、稳定期和衰亡期这四个时期，所得的羊肚菌栽培种的羊肚菌菌丝生物量为13.95g/L，生产成本为0.326元/g；平均生长速度为1.0cm/d，长满培养基时间为5天，且无杂菌生长；而静置培养所得的羊肚菌栽培种菌丝生物量为9.241g/L。

分析认为，在培养过程中，通过充分晃动所述液态菌种培养基，使得所述液态菌种培养基中溶氧量显著增加；另外，由于菌丝体依附于谷壳生长，晃动使得营养成分更均匀，从而使羊肚菌菌丝体生长代谢旺盛，出产产量高。

实施例2

本实施例提供一种羊肚菌液态菌种的培养方法，选用粗柄羊肚菌926号原种作为羊肚菌栽培种的菌株进行培养，具体培养步骤如下：将松树枝300g、土豆400g和水1800ml混合、煮沸并保持30分钟，然后冷却至室温，过滤后制得滤液；取新鲜的麦粒400g，在清水中浸泡12小时，室温下让其发芽，待其芽长约为麦粒的3倍时，取出在60-80℃下烘干，磨成麦芽粉，然后将所述麦芽粉加入所述滤液中，加入的所述滤液是所述麦芽粉的6倍，在50℃的条件下糖化6小时经4层纱布过滤后制得羊肚菌液态菌种营养滤液；取所述羊肚菌液态菌种营养滤液150ml置于培养瓶中，然后向所述培养瓶中加入洗净烘干的谷壳20g和碳酸钙5g，制得羊肚菌液态菌种培养基。

将所述羊肚菌液态菌种培养基放置于灭菌锅中，在1.5kg/cm3、110℃下灭菌0.5小时，取出冷却至室温后，将装有所述羊肚菌液态菌种培养基的三角瓶置于接种箱中密封2小时，然后将粗柄羊肚菌926号原种接入到所述羊肚菌液态菌种培养基中，置于30℃的培养室中进行密封培养，当所述羊肚菌原种菌丝萌发后，每天上午10点整定时摇动所述培养基1次至所述培养基中的谷壳完全被浸湿，直至获得粗柄羊肚菌926号栽培种。

实验测得采用此液态菌种培养基培养出的粗柄羊肚菌926号的生物量为平均值为8.545g/L，生产成本为0.355元/g。

实施例3

本实施例提供一种羊肚菌液态菌种的培养方法，选用粗柄羊肚菌926号原种作为羊肚菌栽培种的菌株进行培养，与实施例1不同的是，所述粗柄羊肚菌926号栽培种的培养过程中所采用的培养基原料如下：麦麸40g、玉米粉20g、黄豆粉10g、KH2PO41g、MgSO41g，实验测得采用此液态菌种培养基培养出的粗柄羊肚菌926号的生物量为平均值为7.148g/L，生产成本为0.465元/g。

实施例4

本实施例提供一种羊肚菌液态菌种的培养方法，选用粗柄羊肚菌926号原种作为羊肚菌栽培种的菌株进行培养，与实施例1、实施例2和实施例3均不同的是，所述粗柄羊肚菌926号栽培种的培养过程中所采用的培养基原料如下：土豆200g、蔗糖30g、酵母膏5g、KH2PO40.5g、MgSO40.5g，实验测得采用此液态菌种培养基培养出的粗柄羊肚菌926号的生物量为平均值为6.754g/L，生产成本为0.41元/g。

实施例5

本实施例提供一种羊肚菌液态菌种的培养方法，与实施例1不同的是，本实施例选用尖顶羊肚菌405号作为羊肚菌的菌株进行培养，具体培养步骤包括：

（1）尖顶羊肚菌405号母种的培养

将土豆60g、琼脂10g、维生素B剂0.5g及葡萄糖5g放入1500ml的水中加热至琼脂全部煮化即得到羊肚菌母种培养基。

取150ml羊肚菌母种培养基放置于250ml的试管中并用棉花封口，将所述试管放置于130℃下的高压锅内灭菌1小时，然后自然冷却至室温，将装有所述羊肚菌母种培养基的所述试管放入密封的无菌接种箱中，并向所述试管中接入尖顶羊肚菌405号菌株菌丝，置于温度为30℃的培养箱中培养，直至生长出尖顶羊肚菌405号母种。

（2）尖顶羊肚菌405号一级原种的培养

将棉籽壳30g、杂木屑20g用水浸泡30小时且每隔5小时换水一次；将20g谷壳浸泡3小时；将麸皮25g、玉米粉8g分别用水浸泡3小时；然后将浸泡好的棉籽壳、麸皮、杂木屑、谷壳、玉米粉分别置于锅中加水煮沸2小时，然后过滤、沥干；然后向沥干后的所述棉籽壳、麸皮、杂木屑、谷壳、玉米粉中加入蔗糖10g、碳酸钙1g和磷肥5g，混合均匀制得羊肚菌一级原种培养基。

将所述羊肚菌一级原种培养基装入100ml的广口瓶中并用牛皮纸封口，每瓶装入量折合干重为40g，将分装好的广口瓶用10㎝×10㎝的聚丙烯双层膜封住瓶孔，在聚丙烯双层膜对着广口瓶位置剪开一个直径为1.5㎝的孔，并用两层牛皮纸封住，用线绳固定封口；将封口后的广口瓶在120-130℃下灭菌3小时，然后在无菌室中自然冷却；将尖顶羊肚菌405号母种按照每瓶接种量为4g接种到所述羊肚菌一级原种培养基中，放置于温度为30℃的恒温箱中培养，培养10天获得尖顶羊肚菌405号一级原种。

（3）尖顶羊肚菌405号二级原种的培养

将松针200g、金针菇200g和1800ml混合、煮沸并保持20分钟，冷却后过滤制得营养滤液，然后分别称取小麦20g、玉米25g、谷壳15g、米糠15g、蔗糖1g、石膏1g、磷肥1g，将上述原料组分混合均匀得到混合料。

向所述混合料中加入同等质量的所述羊肚菌二级原种培养基滤液，混合均匀制，并分成若干等份分别装入多个三角瓶中并用棉花封口，放置于灭菌锅中，在2kg/cm3、110℃下灭菌1小时，取出冷却至室温制得羊肚菌二级原种培养基。

将多个所述三角瓶置于接种箱中密封1小时，将尖顶羊肚菌405号一级原种接入到所述羊肚菌二级原种培养基中，并送入培养室，控制培养室的温度为30℃，培养15天获得尖顶羊肚菌405号二级原种。

（4）尖顶羊肚菌405号羊肚菌栽培种的培养

将松树枝300g、土豆300g和水1800ml混合、煮沸并保持30分钟，然后冷却至室温，过滤后制得营养滤液。

将蔗糖25g加入到所述滤液中并溶解制得羊肚菌液态菌种营养滤液，取所述羊肚菌液态菌种营养滤液150ml置于培养瓶中，然后向所述培养瓶中加入洗净烘干的谷壳20g和碳酸钙5g，制得羊肚菌液态菌种培养基。

将装有所述羊肚菌液态菌种培养基的三角瓶放置于灭菌锅中，1.5kg/cm3、120℃下灭菌1小时，取出冷却至室温，然后置于接种箱中密封3小时，将尖顶羊肚菌405号二级原种接入到所述羊肚菌液态菌种培养基中，置于30℃的培养室进行密封培养，当所述羊肚菌二级原种菌丝萌发后，每间隔1天充分摇动1次，培养10天获得尖顶羊肚菌405号栽培种。

实验测得采用此液态菌种培养基培养出的尖顶羊肚菌405号的平均生长速度为0.7cm/d，长满培养基时间为7天，且无杂菌生长。

实施例6

本实施例提供一种羊肚菌液态菌种的培养方法，与实施例5不同的是，本实施例选用美味羊肚菌918号作为羊肚菌栽培种的菌株进行培养，具体结果如下：实验测得采用此液态菌种培养基培养出的美味羊肚菌918号的平均生长速度为0.8cm/d，长满培养基时间为6天，且无杂菌生长。

最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (8)

1.一种羊肚菌液态菌种的培养方法，包括以下步骤：

提供一种羊肚菌液态菌种培养基；

将羊肚菌原种接种到所述羊肚菌液态菌种培养基中进行密封培养，当所述羊肚菌原种的菌丝萌发后，每天摇动所述羊肚菌液态菌种培养基1次，直至获得羊肚菌栽培种。

2.根据权利要求1所述的羊肚菌液态菌种的培养方法，其特征在于，提供所述羊肚菌液态菌种培养基的步骤包括：

将松树枝200-300g、土豆200-400g和水1200ml-1800ml进行混合，然后依次经过煮沸、冷却、过滤处理得到滤液；

将糖类物质15-30g加入到所述滤液中并溶解制得羊肚菌液态菌种营养滤液，取所述羊肚菌液态菌种营养滤液150ml置于培养瓶中；

向所述培养瓶中加入洗净烘干的谷壳10-30g和碳酸钙1-5g，制得羊肚菌液态菌种培养基。

3.根据权利要求2所述的羊肚菌液态菌种的培养方法，其特征在于，

制备所述羊肚菌液态菌种营养滤液的步骤包括：用水浸泡新鲜麦粒300-400g，并在室温下促使所述麦粒发芽直至麦芽长度约为所述麦粒长度的3-6倍，然后，将所述麦芽烘干并磨成麦芽粉，并向所述麦芽粉中加入所述麦芽粉5-7倍质量的所述滤液，经糖化、过滤后制得羊肚菌液态菌种营养滤液。

4.根据权利要求1-3任一项所述的羊肚菌液态菌种的培养方法，其特征在于，所述羊肚菌原种菌丝萌发后，每间隔24小时摇动所述羊肚菌液态菌种培养基1次，使得所述羊肚菌液态菌种培养基中的谷壳完全被浸湿。

5.根据权利要求4所述的羊肚菌液态菌种的培养方法，其特征在于，所述羊肚菌原种是通过对羊肚菌母种进行一级培养或二级培养而制得的。

6.根据权利要求5所述的羊肚菌液态菌种的培养方法，其特征在于，所述羊肚菌母种进行一级培养的步骤包括：

将棉籽壳20-30g、杂木屑15-20g、谷壳20-30g、麸皮15-25g、玉米粉8-12g分别用水浸泡，过滤后分别加水煮沸、过滤沥干，然后混合，制得混合料；向所述混合料中加入蔗糖5-10g、碳酸钙1-5g和磷肥1-5g，混合均匀制得羊肚菌一级原种培养基；

对所述羊肚菌一级原种培养基进行高温灭菌、冷却处理，然后向所述羊肚菌一级原种培养基中接入羊肚菌母种进行一级培养，获得羊肚菌一级原种。

7.根据权利要求6所述的羊肚菌液态菌种的培养方法，其特征在于，所述羊肚菌母种进行二级培养的步骤包括：

将松针100-200g、金针菇100-200g和水1200ml-1800ml进行混合、煮沸，冷却、过滤处理，制得羊肚菌二级原种营养液，然后将小麦20-30g、玉米25-40g、谷壳15-25g、米糠15-25g、蔗糖1-5g、石膏1-5g、磷肥1-5g混合均匀制得羊肚菌二级原种培养基混合料，并加入到与所述羊肚菌二级原种培养基混合料相同质量的所述羊肚菌二级原种营养液中，混合均匀制得羊肚菌二级原种培养基；

对所述羊肚菌二级原种培养基进行高温灭菌、冷却处理；然后将所述羊肚菌一级原种接入到所述羊肚菌二级原种培养基中进行二级培养，获得羊肚菌二级原种。

8.根据权利要求5所述的羊肚菌液态菌种的培养方法，其特征在于，所述羊肚菌母种的培养方法包括如下步骤：

将土豆50-60g、琼脂8-14g、维生素B剂0.5-0.8g及葡萄糖5-7g加入1500ml的水中进行加热，直至所述琼脂全部煮化，得到羊肚菌母种培养基；

对所述羊肚菌母种培养基进行高温灭菌、冷却处理；然后将羊肚菌菌株菌丝接入到所述羊肚菌母种培养基中进行培养，获得所述羊肚菌母种。