CN107227289B - 一种山茶花细胞提取物及其提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种山茶花细胞提取物及其提取方法和应用。本发明用酶解法从材料中分离出山茶花单细胞，获得单细胞接种在MS培养基中进行黑暗培养，直至长出愈伤组织，再通过悬浮培养获得大量的山茶花细胞培养物，收集山茶花细胞培养物对其过滤、浓缩和冻干处理，获得的山茶花细胞提取物具有很强的抗氧化作用，是理想的美容抗衰老用品。本发明通过接种山茶花进行组织培养来为获取山茶花细胞提取物提供原材料，原材料不再受地域、气候等自然条件限制，而且化学性质稳定，为推广应用山茶花提取物奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种山茶花细胞提取物及其提取方法和应用。
背景技术
山茶花，又名茶花，为山茶科山茶属植物，因其植株形姿优美，花形艳丽缤纷，受到世界园艺界的珍视，是中国传统的观赏花卉，亦是世界名贵花木之一。山茶花含有丰富的黄酮类、皂苷类、多酚类化合物，具有优异的抗氧化抗自由基的功效，以其制备的化妆品具有抗自由基、抗衰、淡斑、保湿、防晒的效果。山茶花具有诸多功效，在中国广泛种植，资源充足，但大多用于城市景观绿化，供人们欣赏，每年山茶花的花卉因凋零未被利用而白白浪费。
目前，山茶花的提取多采用有机溶剂高温回流提取或蒸馏提取或直接用水做溶剂高温提取，这两种方法都需要进行高温长时间蒸煮。上述提取方法及提取物存在以下缺点：山茶花中存在较多的杂质，所得的提取液中抗氧化、抗自由基功效活性成分低，不利于后续工序的精制纯化，每个批次提取物的成分也不确定；工序多、工艺繁琐复杂、所需时间较长；安全性低，生产过程中使用大量有机溶剂，极易残留在成品中，不利于身体健康；会造成环境污染，生产过程中会向环境中排放大量有机溶剂。
要推广使用山茶花的活性物质，必须能够有效地提取到大量的山茶花提取物。现有植物提取一般是采用植株进行提取，但植株生长需要多年时间，而且受到地域，气候，季节以及病虫害等的影响与威胁，其提取物品质不稳定，其效果难以控制。因此，研究如何获取大量的品质稳定的山茶花提取物是推广应用山茶花提取物必须解决的难题。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，本发明提供一种山茶花细胞提取物及其提取方法和应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种山茶花细胞提取物的提取方法，包括以下步骤：
S1、山茶花单细胞的分离：无菌山茶花中加入MS(Murashige and Skoog)培养基中培养，并加入纤维素酶和果胶酶进行酶解，调pH至5～6，在26～30℃、30～60rpm条件下，消化2～4小时，过滤除杂，滤液离心去上清液，获得山茶花细胞株；
S2、山茶花细胞的培养：将获得的山茶花单细胞株接种到含有生长素2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸、2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)、细胞分裂素6-BA(6-苄氨基嘌呤、6-benzylaminopurine)的MS培养基中，23～27℃黑暗培养，直至长出愈伤组织；将得到的愈伤组织分割成小块，转入到MS液体培养基中置于发酵罐中进行悬浮培养，通入过滤空气且速率为0.04～0.06m3/s，在24～28℃、120～160rpm的条件下培养7～10天。
优选地，所述山茶花细胞提取物的提取方法，还包括步骤S3、山茶花细胞提取物的冻干：收集培养液，浓缩，过滤除菌后进行冻干处理，冻干温度为-30～-40℃，真空度为180～220Pa，冻干时间为30～40小时，即得到山茶花细胞提取物冻干粉。
优选地，所述无菌山茶花通过以下方法制备：取无病虫害、生长饱满的山茶花幼蕾，在含洗涤剂的自来水中浸泡10～40min，将表面不光滑或长绒毛的部位清洗干净，转到超净工作台上，晾干。
更优选地，所述山茶花清洗后还进行表面消毒，消毒的方法为：75％乙醇消毒15～40s，无菌水冲洗干净，分别再用饱和次氯酸钙消毒5～25min和0.1％氯化汞消毒5～15min，无菌水冲洗干净，放在无菌滤纸上吸干表面水分。
优选地，所述洗涤剂为洗衣粉、洗衣液或洗洁精。
优选地，步骤S1中每1.0g无菌山茶花中加入10ml MS(Murashige and Skoog)培养基、0.05ml质量分数0.3％的纤维素酶溶液和0.05ml质量分数0.3％的果胶酶溶液。
优选地，步骤S1中无菌山茶花在28℃、40rpm消化3小时。
优选地，步骤S2中将获得的山茶花单细胞株接种到含有1.0mg/L 2，4-D、1.126mg/L 6-BA的MS培养基中，25℃黑暗培养，直至长出愈伤组织；将得到的愈伤组织分割成小块，转入到MS液体培养基中置于发酵罐中进行悬浮培养，通入过滤空气且速率为0.05m3/s，在26℃、140rpm的条件下培养9天。
优选地，所述步骤3中收集培养液后用0.45μM的滤膜过滤，浓缩并调整浓缩液中蛋白浓度为50±0.5μg/ml，浓缩液用0.22μM过滤除菌后进行冻干处理，冻干温度为-35℃，真空度为200Pa，冻干时间为36小时。
一种山茶花细胞提取物，由上述提取方法制备得到。
山茶花细胞提取物在制备抗衰老和/或抗氧化化妆品中的应用。
本发明用酶解法从材料中分离出山茶花单细胞，获得单细胞接种在MS培养基中进行黑暗培养，直至长出愈伤组织，再通过悬浮培养获得大量的山茶花细胞培养物，收集山茶花细胞培养物对其过滤、浓缩和冻干处理，获得的山茶花细胞提取物具有很强的抗氧化作用，是理想的美容抗衰老用品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明通过接种山茶花进行组织培养来为获取山茶花细胞提取物提供原材料，原材料不再受地域、气候等自然条件限制，而且化学性质稳定，为推广应用山茶花提取物奠定了基础。
2、本发明的山茶花细胞提取物具有较强的抗氧化能力及抗皱效果，适合应用于抗衰老的化妆品中。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合具体实施方式做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
实施例1
取无病虫害、生长饱满的山茶花幼蕾，在含洗衣粉或洗洁精的自来水中浸泡30min，将表面不光滑或长绒毛的部位清洗干净，必要时用毛刷刷洗干净然后转到超净工作台上，晾干。对一些容易污染、较难灭菌的外植体进行表面消毒时，用单一消毒剂不能得到好的消毒效果，所以常选用两种消毒剂交替浸泡法。在本实施例中，洗涤剂浸泡后的山茶花先经过75％乙醇消毒30s，无菌水中冲洗1遍，然后分别用饱和次氯酸钙消毒5～25min和0.1％氯化汞消毒5～15min，无菌水冲洗6遍，放在无菌滤纸上吸干表面水分，得无菌山茶花。
用得到的无菌山茶提取山茶花细胞提取物，具体方法如下：
S1、山茶花单细胞的分离：将无菌山茶花转移至无菌干净的烧杯中，每1.0g山茶花加入10ml MS培养基、0.05ml质量分数0.3％的纤维素酶溶液和0.05ml质量分数0.3％的果胶酶溶液，调pH在5～6之间，在28℃、40rpm条件下消化3小时。本实施例中使用的纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶总称，能够降解果胶，使细胞分开；果胶酶指分解植物主要成分果胶质的酶类，可降解细胞壁。经过这两种酶处理，可以分离出大量单个的山茶花细胞；若不进行酶处理，则分离出的山茶花细胞很少甚至无法分离出山茶花细胞。
用200目无菌网筛对消化液进行过滤，除去杂质；抽取20μl山茶花细胞过滤液，加进Countstar细胞计数器中，进行细胞计数，根据计数结果，按细胞密度进行细胞培养；其余过滤液在250g离心力下离心10min后，除去上清液，获得山茶花单细胞株。
S2、山茶花细胞的培养：将获得的山茶花单细胞株接种到含有1.0(mg·L-1)的2,4-D、1.126(mg·L-1)的6-BA的MS培养基中，25℃黑暗培养，直至长出愈伤组织；经过初步培养后，将得到的愈伤组织用无菌解剖刀分割成小块，使愈伤组织块小于3mm，转入到MS液体培养基中置于发酵罐中进行悬浮培养，通入过滤空气且速率为0.05m3/s，在26℃的环境下和转速为140rpm/min的条件下培养9天。
S3、山茶花细胞提取物的冻干：收集培养用0.45μM的滤膜对其进行过滤，浓缩，采用蛋白质定量试剂盒(BCA)检测浓缩上清的蛋白浓度，调整浓缩液中蛋白浓度为50±0.5μg/ml。将得到的浓缩上清用0.22μM过滤除菌。除菌后进行冻干处理，冻干温度为-35℃，真空度为200Pa，冻干时间为36小时，即得到山茶花细胞提取冻干粉。将冻干粉分装成1ml/支。
山茶花细胞在培养过程中会分泌蛋白因子等次生代谢产物，这些次生代谢产物存在于培养液中，因此培养液也具有抗衰老等生物学作用。
对比实施例1
按照实施例1所述方法制备无菌山茶花。取无菌山茶花加入等体积的蒸馏水，超声破碎后，再绞碎，200g离心10min，上清液经冷冻干燥后研磨成粉末，过40目筛。
效果实施例1、清除DPPH自由基试验
DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)分析方法是依据DPPH自由基具有单电子，在含有自由基的化学反应中作为一种监测反应的物质，用以抗氧化成分的体外抗氧化性评价。
分别将0.125g、0.25g、0.5g、1.0g、2.0g和4.0g实施例1制备的山茶花细胞提取物加溶媒(溶解冻干粉的制剂)至100g进行稀释，得到含有提取液0.125％、0.25％、0.5％、1.0％、2.0％和4.0％的检测液作为实验组。分别将0.125g、0.25g、0.5g、1.0g、2.0g和4.0g对比例1制备的山茶花提取物加溶媒至100g进行稀释，得到含有提取液0.125％、0.25％、0.5％、1.0％、2.0％和4.0％的检测液作为对照组。分别检测实验组和对照组不同浓度检测液的DPPH自由基清除率，结果如表1所示。
表1、不同浓度检测液的DPPH自由基清除率
由表1中的数据可以看出，实验组和对照组均随着检测液中提取液含量的增加，检测液的DPPH自由基清除率不断增加，当浓度大于1.0％时，DPPH自由基清除率趋于平稳，说明山茶花提取液在浓度1.0％时即可以达到较好的抗氧化性。且相同浓度的检测液条件下，实验组的DPPH自由基清除率明显高于对照组，几乎是对照组的两倍，说明本发明的山茶花细胞提取物具有优异的抗氧化性能。
效果实施例2、清除ABTS自由基试验
ABTS(2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸))在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS·+，在抗氧化物存在时ABTS·+的产生会被抑制，在734nm或405nm测定ABTS的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力，广泛应用于天然水溶性酚类物质抗氧化活性的测定。
分别将0.125g、0.25g、0.5g、1.0g、2.0g和4.0g实施例1制备的山茶花细胞提取物加溶媒(溶解冻干粉的制剂)至100g进行稀释，得到含有提取液0.125％、0.25％、0.5％、1.0％、2.0％和4.0％的检测液作为实验组。分别将0.125g、0.25g、0.5g、1.0g、2.0g和4.0g对比例1制备的山茶花提取物加溶媒至100g进行稀释，得到含有提取液0.125％、0.25％、0.5％、1.0％、2.0％和4.0％的检测液作为对照组。分别检测实验组和对照组不同浓度检测液的ABTS自由基清除率，结果如表2所示。
表2、不同浓度检测液的ABTS自由基清除率
由表2中的数据可以看出，实验组和对照组均随着检测液中提取液含量的增加，检测液的ABTS自由基清除率不断增加，当浓度大于1.0％时，ABTS自由基清除率趋于平稳，说明山茶花细胞提取物在浓度1.0％时即可以达到较好的抗氧化性。且相同浓度的检测液条件下，实验组的ABTS自由基清除率明显高于对照组，说明本发明的山茶花细胞提取物具有优异的抗氧化性能。
效果实施例3、对人体抗衰老作用的测试
按自愿原则选择年龄在29-56，无严重心、肝、肾脏等主要脏器疾患的脸部有明显皱纹者为受试者，共36例，全部为女性，平均年龄35岁。分为A、B、C三组，每组12人，A组使用实施例1制备的山茶花细胞提取物作为受试物，B组使用对比例1的山茶花提取物作为受试物，C组使用溶媒作为受试物。
A组：将2ml溶酶完全倒入中0.05g山茶花细胞提取物冻干粉中，充分混匀，全部均匀地涂抹至人脸部，每两天涂抹一次，连续涂抹15次，试验期间停止使用脸部有关化妆品。实验期间使用同一批次的山茶花细胞提取物。
B组：将2ml溶酶完全倒入中0.05g山茶花提取物冻干粉中，充分混匀，全部均匀地涂抹至人脸部，每两天涂抹一次，连续涂抹15次，试验期间停止使用脸部有关化妆品。实验期间使用同一批次的山茶花提取物。
C组：取同一批次的山茶花细胞提取物配对的溶酶，将2ml溶酶全部均匀地涂抹至人脸部，每两天涂抹一次，连续涂抹15次，试验期间停止使用脸部有关化妆品。
使用前后对比脸谱仪测试光线下面部皮肤表面皱纹度(数值越小代表皱纹程度越轻)，结果如表3所示。
表3、两种冻干粉使用前后皱纹度(x±SD，n＝1)
| 组别 | 使用前 | 使用后 |
| A | 8.32±8.69 | 5.82±8.09 |
| B | 8.38±8.54 | 7.12±8.23 |
| C | 8.42±8.10 | 9.48±8.02 |
从表3结果可以得出，C组作为阴性对照，使用前后无明显差别，B组使用后对皮肤皱纹有所改善，A组使用前后效果明显，其改善皮肤皱纹的效果明显优于B组，证明山茶花细胞提取物连续使用15次后，对于皮肤上的皱纹有很好的改善，具有抗衰老的功效。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种山茶花细胞提取物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、山茶花单细胞的分离：无菌山茶花中加入 MS(Murashige and Skoog)培养基中培养，并加入纤维素酶和果胶酶进行酶解，调pH至5~6，在26~30℃、30~60rpm条件下，消化2~4小时，过滤除杂，滤液离心去上清液，获得山茶花细胞株；
S2、山茶花细胞的培养：将获得的山茶花单细胞株接种到含有2,4-D、6-BA 的MS 培养基中，23~27℃黑暗培养，直至长出愈伤组织；将得到的愈伤组织分割成小块，转入到MS液体培养基中置于发酵罐中进行悬浮培养，通入过滤空气且速率为0.04~0.06m3/s，在24~28℃、120~160rpm的条件下培养7~10天。
S3、山茶花细胞提取物的冻干：收集培养液，浓缩，过滤除菌后进行冻干处理，冻干温度为-30~-40℃，真空度为180~220Pa，冻干时间为30~40小时，即得到山茶花细胞提取物冻干粉。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述无菌山茶花通过以下方法制备：取无病虫害、生长饱满的山茶花幼蕾，在含洗涤剂的自来水中浸泡10~40min，将表面不光滑或长绒毛的部位清洗干净，转到超净工作台上，晾干。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述山茶花清洗后还进行表面消毒，消毒的方法为：75%乙醇消毒15~40s，无菌水冲洗干净，分别再用饱和次氯酸钙消毒5~25min和0.1%氯化汞消毒5~15min，无菌水冲洗干净，放在无菌滤纸上吸干表面水分。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤S1中每1.0g无菌山茶花中加入10ml MS培养基、0.05ml质量分数0.3%的纤维素酶溶液和0.05ml质量分数0.3%的果胶酶溶液。
5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，步骤S1中无菌山茶花在28℃、40rpm消化3小时。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤S2中将获得的山茶花单细胞株接种到含有1.0mg/L 2，4-D 、1.126mg/L 6-BA 的MS 培养基中，25℃黑暗培养，直至长出愈伤组织；将得到的愈伤组织分割成小块，转入到MS液体培养基中置于发酵罐中进行悬浮培养，通入过滤空气且速率为0.05m3/s，在26℃、140rpm的条件下培养9天。
7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤S3中收集培养液后用0.45μM的滤膜过滤，浓缩并调整浓缩液中蛋白浓度为50±0.5μg/ml，浓缩液用0.22μM过滤除菌后进行冻干处理，冻干温度为-35℃，真空度为200Pa，冻干时间为36小时。
8.一种山茶花细胞提取物，由权利要求1-7任一项所述提取方法制备得到。
9.权利要求8所述的山茶花细胞提取物在制备抗衰老和/或抗氧化化妆品中的应用。
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