CN112730355B - 一种级联催化的纳米多酶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种级联催化的纳米多酶及其制备方法和应用，所述的级联催化的纳米多酶为包括铽离子、铁离子、氯金酸和2,6‑吡啶二羧酸通过溶剂热一锅反应合成的纳米材料。该级联催化的纳米多酶具有过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的双重催化活性，能级联催化氧化葡萄糖及其产物，并通过铽离子的发光显示葡萄糖的浓度。本发明还公开了该级联催化的纳米多酶的制备方法及在测定葡萄糖浓度方面的应用。本发明的级联催化的纳米多酶催化活性高、稳定性好、成本低廉，且制备方法简单，可作为指示剂或利用级联催化的纳米多酶的荧光强度测定葡萄糖的浓度。

Description

一种级联催化的纳米多酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种发光级联催化的纳米多酶及其制备方法和应用，属于酶、催化、发光检测技术领域。
背景技术
葡萄糖是人体主要的能量来源，但是血液中高浓度的葡萄糖导致糖尿病、中风、肾衰竭、周围神经病变等疾病发生，测定血糖以及尿糖对糖尿病及其它疾病的诊断和治疗具有重要意义。酶分析法是临床上血糖分析的主要方法，其中葡萄糖氧化酶-过氧化物酶分析法操作简便，是我国卫生部推荐的血糖测定方法。
利用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶体系测定血糖的方法有：邹静等报道了一种用对苯醌固定葡萄糖氧化酶酶，结合辣根过氧化物酶和愈创木酚反应体系荧光测定血糖的方法(分析试验室，2016，35，1070-1073)。陈婷梅等报道了一种用葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶及底物愈创木酚荧光测定血糖的方法(分析试验室，2011，30，6-10)。李乔婧等报道了一种用葡萄糖氧化酶，结合辣根过氧化物酶和酪氨酸反应体系荧光测定血糖的方法(分析化学，2011，39，1181-1185)。张丽芬等报道了一种葡萄糖氧化酶，结合大豆种皮过氧化物酶和愈创木酚反应体系吸光度法测定血糖的方法(理化检验(化学分册)，2010，46，512-514)。伍莉萍等报道了一种固定化葡萄糖氧化酶，结合鲁米诺和氯化高铁血红素发光体系，流动注射化学发光法测定血糖的方法(华西医科大学学报，2000，31，422-424)。V.Kalia等报道了一种用烷基胺玻璃固定化葡萄糖氧化酶，结合辣根过氧化酶-安替比林-苯酚显色体系吸光度法测定血糖的方法(生物工程学报，1998，14，336-338)。中国专利公布号CN 109270060A，2019年，韩磊等，一种具有串联酶活性的铱纳米酶及其应用，公开了一种具有串联酶活性的铱纳米酶检测葡萄糖的方法；中国专利公布号CN 103728287 A，2014年，陈伟等，纳米氧化铜模拟过氧化物酶测定葡萄糖的荧光分析方法，公开了一种用葡萄糖氧化酶，结合纳米氧化铜和对苯二酚体系荧光检测葡萄糖的方法。尹娟娟等报道了一种用葡萄糖氧化酶，结合Fe3O4纳米酶-TMB显色体系检测葡萄糖的方法(分析试验室，2019，38，1486-1489)。
酶分析法中天然酶容易失活、使用周期短、价格昂贵；酶分析法测定血糖常需要葡萄糖氧化酶和过氧化物酶两种酶，并且与显色剂(其底物)一起使用才能产生颜色信号，颜色信号的灵敏度较低，影响酶分析法的灵敏度。
发明内容
发明目的：为解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明的第一个目的是提供一种既具有葡萄糖氧化酶活性又具有过氧化物酶活性，且能级联催化氧化葡萄糖及其产物，并通过铽离子的发光显示葡萄糖的浓度的纳米多酶。本发明的第二目的是提供一种所述级联催化的纳米多酶的制备方法。本发明的第三目的是提供所述级联催化的纳米多酶在测定葡萄糖中的应用。
技术方案：本发明提供了一种级联催化的纳米多酶，所述级联催化的纳米多酶为包括铽离子、铁离子、氯金酸和2,6-吡啶二羧酸通过溶剂热一锅反应合成的纳米材料。
其中，所述的级联催化的纳米多酶中铁离子、金为催化中心，铽离子为发光中心，利用催化反应敏化铽离子发光。
其中，所述的级联催化的纳米多酶是球形的纳米粒子，粒径为50-200nm。
本发明所述的级联催化的纳米多酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将硝酸铽水溶液和硝酸铁水溶液加入到含2,6-吡啶二羧酸的N，N'二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，搅拌；
(2)在搅拌下向步骤(1)所得的溶液中加入分子量4万的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的乙醇溶液，搅拌均匀；
(3)向步骤(2)所得的溶液中加入氯金酸(HAuCl4)水溶液，充分搅拌得到混合液；
(4)将步骤(3)得到的混合液转入反应釜，反应，冷却，离心分离收集沉淀；
(5)用乙醇和水洗涤步骤(4)中得到的沉淀，将沉淀真空干燥，得到级联催化的纳米多酶。
其中，步骤(3)中，所述混合液中的铽离子：铁离子：2,6-吡啶二羧酸：氯金酸的摩尔比为2：1：1：1-2.5。
其中，步骤(4)中，所述反应温度为120-160℃，反应时间为3-6h。
本发明内容还包括所述的级联催化的纳米多酶在测定葡萄糖浓度中的应用。
其种，所述的应用包括将级联催化的纳米多酶作为指示剂测定葡萄糖浓度或利用级联催化的纳米多酶的荧光强度测定葡萄糖的浓度。
其中，所述的应用包括将级联催化的纳米多酶作为指示剂测定葡萄糖浓度的方法，包括以下步骤：将级联催化的纳米多酶指示剂加入到待测样品溶液中，混合均匀，用紫外灯照射溶液，观察溶液的发光颜色，将溶液的发光颜色与标准浓度的葡萄糖溶液产生的发光颜色比较，目视比色法获得待测样品中葡萄糖的浓度。
其中，所述应用包括利用级联催化的纳米多酶的荧光强度测定葡萄糖的方法，包括以下步骤：将级联催化的纳米多酶加入到一系列已知浓度的标准葡萄糖溶液中，混合均匀，测定溶液的荧光强度，绘制荧光强度与葡萄糖浓度的工作曲线；然后将级联催化的纳米多酶加入到葡萄糖待测样品溶液中，混合均匀，测定溶液的荧光强度，根据荧光强度与葡萄糖浓度的工作曲线以及测得的样品溶液的荧光强度获得样品溶液中葡萄糖的浓度。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：
1)本发明的级联催化的纳米多酶既具有葡萄糖氧化酶的活性又有过氧化物酶的活性，稳定性高，成本低，克服了天然酶易失活、使用周期短、昂贵的不足。
2)本发明的级联催化的纳米多酶具有级联催化功能，能级联催化葡萄糖及其产物，可以取代常规的葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶-显色剂构成的组合体系，直接测定葡萄糖。
3)本发明的级联催化的纳米多酶能通过铽离子的发光显示葡萄糖的浓度，可作为指示剂目视比色法显示葡萄糖的浓度，发光指示比常规的显色剂指示葡萄糖浓度的灵敏度更高，也能荧光分光光度法测定葡萄糖的浓度，并且这种发光是稀土离子的发光，稀土离子长的荧光寿命允许通过时间分辨荧光技术消除各种非特异性荧光的干扰，具有高的信噪比，对测定有背景荧光的生物样品具有优势。
4)本发明的级联催化的纳米多酶制备简单，是一锅反应，无需复杂的有机合成。
附图说明
图1为级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb的扫描电镜图；
图2为级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb的扫描电镜图；
图3为级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb的葡萄糖氧化酶活性和过氧化物酶活性；
图4为级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb级联催化葡萄糖和TMB的颜色变化；
图5为级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb催化葡萄糖的紫外可见吸收光谱；
图6为级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb催化葡萄糖的荧光光谱；
图7为级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb比色测定葡萄糖；
图8为级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb荧光检测葡萄糖的工作曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb的制备
将1mL浓度为0.02mol/L Tb(NO3)3水溶液和1mL浓度0.01mol/L的Fe(NO3)3水溶液加到5mL浓度为0.002mol/L的2,6-吡啶二羧酸的DMF溶液中，磁力搅拌下加入3mL含0.2g分子量4万的PVP的乙醇溶液，形成均匀的溶液。再加入200μL浓度为50mmol/L的HAuCl4溶液，混合液中铽离子、铁离子、2,6-吡啶二羧酸和氯金酸的摩尔比为2：1：1：1。搅拌20分钟，将混合液转移到不锈钢反应釜中，160℃下反应6h，冷却至室温后，在10000转/分钟下离心分离10分钟，收集棕色沉淀。用乙醇和水分别洗涤棕色沉淀两次，80℃真空干燥2h，得所述级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb。如图1所示，级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb为球状纳米粒子，粒径约50-100nm。
实施例2级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb的制备
将1mL浓度为0.02mol/L的Tb(NO3)3水溶液和1mL浓度为0.01mol/L的Fe(NO3)3水溶液加到5mL浓度为0.002mol/L的2,6-吡啶二羧酸的DMF溶液中，磁力搅拌下加入3mL含0.2g分子量4万的PVP的乙醇溶液，形成均匀的溶液。再加入500μL浓度为50mmol/L的HAuCl4溶液，混合液中铽离子、铁离子、2,6-吡啶二羧酸和氯金酸的摩尔比为2：1：1：2.5。搅拌20分钟，将混合液转移到不锈钢反应釜中，150℃下反应5h，冷却至室温后，在10000转/分钟下离心分离10分钟，收集棕色沉淀，用乙醇和水分别洗涤棕色沉淀两次，80℃真空干燥2h，得所述级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb。图2是级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb的扫描电镜图，Au-Fe-DPA-Tb显球状的纳米粒子，粒径约100-200nm。
实施例3级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb的级联催化活性
向880μL浓度为10mmol/L pH值为7.0的N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)缓冲溶液中，加入100μL浓度为0.1mol/L的葡萄糖溶液和10μL浓度为1.5mg/mL实施例2制备的级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb的悬浮液，再加入10μL浓度为10mmol/L的过氧化物酶的底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的水溶液，混合均匀后反应30分钟。观察溶液的颜色变化并记录紫外可见吸收光谱。如图3所示，混合液在级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb的催化下，像天然的葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶组合催化一样，TMB在285nm的吸收峰降低，在370nm和652nm出现了新的氧化型TMB的吸收峰。如图4所示，在级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb作用下溶液从无色变为蓝色，显示了TMB被氧化成蓝色的氧化型TMB。结果显示级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb具有葡萄糖氧化酶的活性的同时还具有过氧化物酶的活性，葡萄糖氧化酶的活性使葡萄糖被催化氧化并产生了过氧化氢，过氧化物酶的活性继续催化过氧化氢氧化TMB，TMB被氧化成蓝色。
实施例4级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb催化氧化葡萄糖
向970μL纯水中分别加入20μL浓度为1mmol/L的葡萄糖水溶液和10μL浓度为1.5mg/mL实施例2制备的级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb的悬浮液，混合均匀，间隔一定时间测定溶液的紫外可见吸收光谱和荧光光谱。图5是反应0、2、5、10、15、20、25、30分钟溶液的紫外可见吸收光谱图，在级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb的催化下，溶液在285nm的吸收峰不断降低，在370nm和652nm的吸收峰不断升高，说明级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb能催化氧化葡萄糖。图6是反应0，10，20，30，40，60分钟溶液的荧光光谱图，Tb3+在545nm的发光强度不断升高，说明催化反应能增强Tb3+的发光。
实施例5级联催化的纳米多酶指示剂目视比色测定葡萄糖
向970μL浓度为10mmol/L pH值为7的HEPES缓冲溶液中加入20μL浓度为1.5mg/mL作为指示剂的实施例2制备的级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb，再加入10μL葡萄糖待测样品溶液，混合均匀反应30分钟后，在紫外灯照射下级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb指示剂能发光。观察溶液的发光颜色与标准浓度的葡萄糖溶液产生的发光颜色比较，目视比色法获得待测样品中葡萄糖的浓度。对照图7标准浓度分别为0、1、2、5、8、10mmol/L的葡萄糖溶液产生的发光颜色，测得样品中葡萄糖的浓度约为2mmol/L。
实施例6应用级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb荧光测定葡萄糖
向980μL浓度为10mmol/L pH值为7的HEPES缓冲溶液中加入10μL浓度为1.5mg/mL实施例2制备的级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb，再加入10μL不同浓度的标准葡萄糖溶液，使得1000μL溶液中葡萄糖的浓度分别为0、0.1、0.5、1、2、5、8、10μmol/L，混合均匀反应30分钟后，在278nm的波长激发下测定溶液545nm的发光强度。如图8所示，葡萄糖浓度与Tb3+发光强度成线性正比关系，检测葡萄糖的灵敏度为0.1μM。
向980μL浓度为10mmol/L pH值为7的HEPES缓冲溶液中加入10μL浓度为1.5mg/mL实施例1制备的级联催化的纳米多酶Au-Fe-DPA-Tb和10μL葡萄糖样品溶液，混合均匀反应30分钟后，在278nm的波长激发下测定溶液545nm的发光强度。根据图8的工作曲线测得的样品中葡萄糖的结果见下表。结果说明本发明法测定葡萄糖的浓度具有良好的准确度和精密度。
样品中葡萄糖的测定结果
葡萄糖浓度(μmol/L) 测定浓度(μmol/L) 回收率(％) 相对标准偏差(％)
2.0 2.08±0.43 104 20.7
8.0 7.86±0.75 98.3 9.5

Claims (9)

1.一种级联催化的纳米多酶，其特征在于，所述级联催化的纳米多酶为包括铽离子、铁离子、氯金酸和2,6-吡啶二羧酸通过溶剂热一锅反应合成的纳米材料，其制备方法包括以下步骤：
（1）将硝酸铽水溶液和硝酸铁水溶液加入到含2, 6-吡啶二羧酸的N，N'二甲基甲酰胺DMF溶液中，搅拌；
（2）在搅拌下向步骤（1）所得的溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮PVP的乙醇溶液，搅拌均匀得到溶液；
（3）向步骤（2）所得的溶液中加入氯金酸HAuCl4水溶液，充分搅拌得到混合液；
（4）将步骤（3）得到的混合液转入反应釜，反应，冷却，离心分离收集沉淀；
（5）用乙醇和水洗涤步骤（4）中得到的沉淀，将沉淀真空干燥，得到级联催化的纳米多酶。
2.根据权利要求1所述的级联催化的纳米多酶，其特征在于，所述的级联催化的纳米多酶是球形的纳米粒子，粒径为50-200 nm。
3.权利要求1或2所述的级联催化的纳米多酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将硝酸铽水溶液和硝酸铁水溶液加入到含2, 6-吡啶二羧酸的N，N'二甲基甲酰胺DMF溶液中，搅拌；
（2）在搅拌下向步骤（1）所得的溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮PVP的乙醇溶液，搅拌均匀得到溶液；
（3）向步骤（2）所得的溶液中加入氯金酸HAuCl4水溶液，充分搅拌得到混合液；
（4）将步骤（3）得到的混合液转入反应釜，反应，冷却，离心分离收集沉淀；
（5）用乙醇和水洗涤步骤（4）中得到的沉淀，将沉淀真空干燥，得到级联催化的纳米多酶。
4.根据权利要求3所述的级联催化的纳米多酶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述混合液中的铽离子、铁离子、2, 6-吡啶二羧酸和氯金酸的摩尔比为2：1：1：1-2.5。
5.根据权利要求3所述的级联催化的纳米多酶的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述反应温度为120-160 ℃，反应时间为3-6 h。
6.权利要求1或2所述的级联催化的纳米多酶在测定葡萄糖浓度中的应用。
7.根据权利要求6所述的级联催化的纳米多酶在测定葡萄糖浓度中的应用，其特征在于，所述的应用包括将级联催化的纳米多酶作为指示剂测定葡萄糖浓度或利用级联催化的纳米多酶的荧光强度测定葡萄糖的浓度。
8.根据权利要求7所述的级联催化的纳米多酶在测定葡萄糖浓度中的应用，其特征在于，所述的级联催化的纳米多酶作为指示剂测定葡萄糖浓度的方法，包括以下步骤：将级联催化的纳米多酶指示剂加入到待测样品溶液中，混合均匀，用紫外灯照射溶液，观察溶液的发光颜色，将溶液的发光颜色与标准浓度的葡萄糖溶液产生的发光颜色比较，目视比色法获得待测样品中葡萄糖的浓度。
9.根据权利要求7所述的级联催化的纳米多酶在测定葡萄糖浓度中的应用，其特征在于，所述的利用级联催化的纳米多酶的荧光强度测定葡萄糖的方法，包括以下步骤：将级联催化的纳米多酶加入到一系列已知浓度的标准葡萄糖溶液中，混合均匀，测定溶液的荧光强度，绘制荧光强度与葡萄糖浓度的工作曲线；然后将级联催化的纳米多酶加入到葡萄糖待测样品溶液中，混合均匀，测定溶液的荧光强度，根据荧光强度与葡萄糖浓度的工作曲线以及测得的样品溶液的荧光强度获得样品溶液中葡萄糖的浓度。
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