CN106279124B - 一种用于检测酪氨酸酶的荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种用于检测酪氨酸酶的荧光探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于酪氨酸酶检测的荧光探针及其制备方法与应用。该荧光探针化合物的结构式为式Ⅰ。该酪氨酸酶检测试剂盒，它包括酪氨酸酶检测的荧光探针和溶剂；所述酪氨酸酶检测的荧光探针为所述化合物；其应用于酪氨酸酶检测及生物样品分析中。本发明具有操作简便，成本低，检测波长长，不受氧化性物质干扰等优点，易于推广和应用。

Description

一种用于检测酪氨酸酶的荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于分子检测和分子成像领域，涉及一种用于检测酪氨酸酶的荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
酪氨酸酶是酪氨酸合成的关键酶，可特异性催化生物酚类的羟化以及进一步的醌化反应，在多种生理学过程中都发挥着至关重要的作用。在临床上，酪氨酸酶是黑色素癌的重要标志物。另外，酪氨酸酶被认为与白化病以及帕金森疾病有重要关系。由此可见，酪氨酸酶的检测具有非常重要的意义。由于目前用来检测酪氨酸酶荧光探针以及试剂盒存在易受活性氧物质干扰等弊端，因此，发展一种含有新型识别基团且不受活性氧物质干扰的检测酪氨酸酶的荧光探针具有非常大的应用价值。
半菁骨架因其具有长的波长和良好的稳定性而被广泛应用于生物分析中，而基于半菁检测酪氨酸酶的且不受活性氧物质干扰的荧光探针尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测酪氨酸酶的荧光探针及其制备方法与应用。
本发明提供的荧光探针，其结构式为式Ⅰ。
本发明还提供了上述化合物式Ⅰ的制备方法，包括如下步骤：将式II所示半菁与氢化钠于有机溶剂中混合后搅拌，再加入3-羟基苄溴进行反应，反应完毕得到所述式I所示化合物，为深蓝色固体粉末；
上述方法的搅拌步骤中，搅拌的时间为10-20分钟，具体为15分钟；
所述搅拌的步骤在惰性气氛或氩气气氛中进行；
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃、乙腈、二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺；
所述反应步骤中，温度为50～70℃，具体为60℃；时间为12～24h；
式II所示半菁与氢化钠的投料摩尔比为1：2-3；
式II所示半菁与3-羟基苄溴的投料摩尔比为1：1-4，具体为1：2。
另外，上述本发明提供的式I所示化合物在制备荧光探针或制备用于检测酪氨酸酶的荧光探针中的应用及在酪氨酸酶检测和/或酪氨酸酶成像中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述检测中，激发波长为670nm；发射波长为708nm。
本发明还要求保护一种酪氨酸酶检测试剂盒，它包括酪氨酸酶检测的荧光探针和溶剂组成的荧光探针储备液；
所述酪氨酸酶检测的荧光探针为所述式I所示化合物。
所述试剂盒中，所述酪氨酸酶检测的荧光探针在所述荧光探针储备液中的摩尔浓度为0.01～10mM，具体为0.2mM；
所述溶剂选自甲醇和二甲基亚砜中的至少一种。
本发明提供的检测待测样品中酪氨酸酶含量的方法，包括如下步骤：
1)制作标准曲线：
以670nm为激发波长，测定一系列不同浓度的酪氨酸标准反应液在发射波长为708nm处的荧光强度，记为F；
并测定试剂空白在发射波长为708nm处的荧光强度，记为F0，以酪氨酸酶的浓度C为横坐标，以荧光强度变化值ΔF＝F-F0为纵坐标，绘制标准曲线；
所述一系列不同浓度的酪氨酸酶标准反应液为将式I所示化合物的溶液、酪氨酸酶的标准储备溶液和缓冲液混合进行反应3h-7h后而得；
2)检测待测样品中酪氨酸酶的含量：
将所述步骤1)中所述酪氨酸酶的标准储备溶液替换为待测样品的水溶液，按照所述步骤1)所述方法检测所述待测样品在发射波长为708nm处的荧光强度，记为F'；同时测定试剂空白在发射波长为708nm处的荧光强度，记为F0'；
将(F'-F0')带入所述步骤1)所得标准曲线，即得到所述待测样品中酪氨酸酶的浓度，进而得到所述待测样品中酪氨酸酶的含量。
上述方法中，所述一系列不同浓度的酪氨酸酶标准反应液中，所述酪氨酸酶的浓度为0～80U/mL，具体浓度依次可为0、10、20、40、60和80U/mL；
所述一系列不同浓度的酪氨酸酶标准反应液的体积均为2mL；
所述式I所示化合物的溶液中，式I所示化合物的摩尔浓度为0.01～10mM，具体可为200μM；
溶剂选自甲醇和二甲基亚砜中的至少一种；
所述式I所示化合物的溶液的体积均为50μL；
所述酪氨酸酶的标准储备溶液为酪氨酸酶的水溶液；浓度为1000U/mL；
所述缓冲液为pH值为6～9的磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐选自Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种；所述磷酸盐的浓度为0.01～0.5M；
所述步骤1)所得标准曲线对应的线性回归方程为：ΔF＝3.25C+6.40，R＝0.991，其中，ΔF为荧光强度变化值，ΔF＝F-F0；C为酪氨酸酶的浓度，单位为U/mL。
另外，上述本发明提供的试剂盒在酪氨酸酶检测或生物样品分析中的应用，也属于本发明的保护范围；
其中，所述生物样品具体为细胞，更具体可为人宫颈癌细胞HeLa或鼠黑色素瘤细胞B16细胞；
所述酪氨酸酶检测或生物样品分析中，所述酪氨酸酶检测的荧光探针的测试浓度具体为100nM-20μM，如5μM。
本发明制备出了基于半菁的长波长的荧光探针(式Ⅰ)，该探针可选择性地被酪氨酸酶羟基化从而实现对该酶的测定；而且，本发明探针(式Ⅰ)制备的试剂盒能用于细胞酪氨酸酶的检测。
本发明具有以下优点：
1、本发明荧光探针是紫色的固体，在溶液中呈浅紫色，与酪氨酸酶反应后，肉眼即可观察到溶液变为明显的蓝色。
2、本发明具有长的荧光激发波长(670nm)和发射波长(708nm)
3、本发明对酪氨酸酶的响应呈线性关系，可以用于该酶的定量测定。
4、本发明应用时显色反应仅在酪氨酸酶存在的条件下发生，其它常见的无机盐、氨基酸、水解酶，特别活性氧物质等均不产生干扰。
5、本发明化合物溶解性好，其用有机溶剂配成的母液试剂盒可直接用于缓冲体系中酪氨酸酶的检测。
6、本发明具备好的生物相容性，可用于细胞酪氨酸酶的检测；因此，该探针是一种优良的可广泛用于酪氨酸酶检测的分析试剂。
7、本发明具有操作简便，成本低，检测波长等优点，易于推广和应用。
附图说明
图1为本发明式I所示化合物的化学反应方程式与合成路线。
图2为本发明试剂盒对酪氨酸酶的紫外可见吸收及颜色响应图，其中图2a为式Ⅰ所示化合物(5μM)的吸收光谱，图2b为式Ⅰ所示化合物(5μM)与酪氨酸酶(200U/mL)反应后的吸收光谱。
图3为本发明试剂盒对不同浓度酪氨酸酶的荧光响应图，酪氨酸酶的浓度从下到上依次为0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100和200U/mL。
图4为本发明试剂盒的荧光增量对酪氨酸酶浓度的标准曲线。
图5为本发明试剂盒对不同的氧化性物质响应的柱状图。
图6为本发明试剂盒分别用于HeLa和B16细胞的共聚焦成像图。
图7为本发明试剂盒分别用于正常培养的B16细胞以及预先与抑制剂孵育过的B16细胞的共聚焦成像图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1、酪氨酸酶检测的荧光探针(式Ⅰ)的制备
按照图1所示的化学反应流程图进行制备。
步骤1)：将0.78mmol间苯二酚溶于乙腈中，加入0.78mmol的碳酸钾，在Ar气保护下，继续搅拌15分钟后，加入0.31mmol IR-780，60℃下继续反应5小时，过滤，然后滤液减压蒸干，得到的粗产品。用柱层析分离提纯得到半菁，为紫色固体。
步骤2)：将0.5mmol半菁溶于无水乙腈中，然后加入1mmol的氢化钠，在Ar气保护下搅拌15分钟，然后再加入3-羟基苄溴。60℃下反应12小时后，减压蒸干，得到的粗产品。用层析分离，得到最终产物(式Ⅰ)，产品为紫色固体。
结构确证结果如下：1H NMR(400MHz,298K,CDCl3):δ8.60(d,J＝14.4Hz,1H),7.88(d,J＝6.8Hz,1H),7.44(s,1H),7.40-7.34(m,2H),7.32(t,J＝7.6Hz,2H),7.20(s,1H),7.10(t,J＝7.6Hz,1H),6.96(d,J＝7.6Hz,1H),6.90(t,J＝3.2Hz,1H),6.79(t,J＝8.0Hz,2H),6.32(d,J＝14.8Hz,1H),4.30(t,J＝6.8Hz,2H),2.69(d,J＝19.2Hz,4H),1.96-1.91(m,4H),1.83(s,6H),1.07(t,J＝7.2Hz,3H).13C-NMR(100MHz,298K,CDCl3):δ177.8,162.5,161.8,158.4,154.3,145.8,142.1,141.2,137.0,134.2,129.6,128.8,128.6,127.5,126.8,123.9,116.8,115.9,115.5,115.4,114.5,114.1,112.0,103.1,101.5,71.1,51.0,47.0,29.0,28.3,24.2,21.2,20.3,11.6.HR-ESI-MS,calcd for C35H36NO3[M]+:m/z518.26897；found:m/z 518.26860.
由上述谱图数据，可确认本实施例制备得到的化合物的结构如下：
实施例2、酪氨酸酶检测试剂盒的制备
称取1.29mg实施例1所得式I所示化合物作为荧光探针，溶于10mL溶剂二甲基亚砜，配成荧光探针储备液(又称母液，0.2mM)，即得到酪氨酸酶检测试剂盒。
本发明试剂盒检测酪氨酸酶具体按照以下步骤进行：
1)制作标准曲线：
以670nm为激发波长，测定酪氨酸酶的浓度分别为0、10、20、40、60和80U/mL的酪氨酸酶标准反应液各2mL，在发射波长为708nm处的荧光强度，记为F；
并测定试剂空白在发射波长为708nm处的荧光强度，记为F0；
以酪氨酸酶的浓度C为横坐标，荧光强度变化值ΔF＝F-F0为纵坐标，绘制标准曲线；
上述一系列不同浓度的酪氨酸酶标准反应液各由0.2mM的酪氨酸酶试剂盒中的荧光探针储备液50μL、酪氨酸酶标准储备溶液(溶剂为水，浓度为1000U/mL)和缓冲液混匀而得，所述缓冲液为pH值为7.4的0.01M Na2HPO4缓冲液；
2)检测待测样品中酪氨酸酶的含量：
将上述步骤1)中酪氨酸酶标准储备溶液替换为待测样品，按照上述步骤1)所述方法检测所述待测样品在发射波长为670nm处的荧光强度，记为F'；
同时测定试剂空白在发射波长为708nm处的荧光强度，记为F0'；
将所述F'-F0'带入所述步骤1)所得标准曲线，即可得到待测样品中酪氨酸酶的含量。
光谱性质的检测：将125μL的上述母液滴加到一定量的0.01M磷酸盐缓冲溶液中，然后加入不同量的酪氨酸酶溶液，再用0.01M的磷酸盐缓冲溶液定容到5mL。37℃反应3小时后，测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以670nm激发；激发和发射狭缝宽度均为10nm；电压700V。
如图2所示为本发明试剂盒对酪氨酸酶的紫外可见吸收及颜色响应图。图2a为式Ⅰ所示化合物(5μM)的吸收光谱，b为式Ⅰ所示化合物(5μM)与酪氨酸酶(200U/mL)反应后的吸收光谱。
如图3所示为本发明试剂盒对酪氨酸酶的荧光响应图，酪氨酸酶浓度范围为0-200U/mL。图3中酪氨酸酶的浓度从下到上依次为0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100和200U/mL。
如图4所示为本发明试剂盒对酪氨酸酶浓度的标准曲线，酪氨酸酶浓度范围为0-80U/mL。
如图5所示为本发明试剂盒对氧化性物质的响应柱状图，氧化性物质的浓度为100μM，式Ⅰ所示化合物的浓度为5μM。
以上实验说明本试剂盒具有如下特点：
1、由图2可知，探针在溶液中呈现浅紫色，但随着酪氨酸酶的加入，溶液变为蓝色，在708nm处产生荧光；
2、由图3可知，荧光强度随酪氨酸酶浓度的增加而增强；
3、由图4可知，使用5μM的荧光探针时，荧光增量与酪氨酸酶的浓度在0～80U/mL范围内呈线性关系，可用于酪氨酸酶的定量测定。将荧光探针的浓度由5μM替换为100nM-20μM时，荧光增量与酪氨酸酶的浓度在0～80U/mL范围内同样呈线性关系，可知，该荧光探针的测试浓度为100nM-20μM。
4、由图5可知，氧化性物质与5μM荧光探针几乎无响应。
实施例3、酪氨酸酶检测试剂盒的应用
一、检测细胞中的酪氨酸酶
1)在37℃和5％CO2条件下，用含有10％(v/v)胎牛或小牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL的链霉素的DMEM培养基培养细胞(培养的细胞为人宫颈癌细胞HeLa和鼠的黑色素瘤细胞B16细胞)。细胞使用之前用DMEM清洗。
2)在细胞中加入1mL DMEM，再加入荧光探针(5μM)孵育2h后进行共聚焦荧光成像，激发波长为635nm，收集波段为650-750nm。
如图6所示为本发明试剂盒分别用于人宫颈癌细胞HeLa(酪氨酸酶低表达)和鼠的黑色素瘤细胞B16(酪氨酸酶高表达)的共聚焦成像图。
如图7所示为本发明试剂盒用于预先与酪氨酸酶抑制剂曲酸孵育过的B16细胞的共聚焦成像图。由上述结果表明本发明试剂盒可以测定细胞中的酪氨酸酶。
最后应说明的是：上述实施例仅举出以式Ⅰ为荧光试剂，反应体系中含探针为5μM，缓冲溶液为0.01M磷酸盐且反应时间为3h的情况。其余荧光试剂浓度和反应时间的结果不一一列出，然而并非用于限定本发明。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，应当可以作出各种修改与变更。

Claims (11)

1.式I所示化合物，
2.一种制备权利要求1所述式I所示化合物的方法，包括如下步骤：
将式II所示半菁与氢化钠于有机溶剂中混合后搅拌，再加入3-羟基苄溴进行反应，反应完毕得到所述式I所示化合物；
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述搅拌步骤中，搅拌的时间为10-20分钟；
所述搅拌的步骤在惰性气氛中进行；
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃、乙腈、二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺；
所述反应步骤中，温度为50～70℃；时间为12～24h；
式II所示半菁与氢化钠的投料摩尔比为1：2-3；
式II所示半菁与3-羟基苄溴的投料摩尔比为1：1-4。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述搅拌步骤中，搅拌的时间为15分钟；
所述搅拌的步骤在氩气气氛中进行；
所述反应步骤中，温度为60℃；
式II所示半菁与3-羟基苄溴的投料摩尔比为1：2。
5.权利要求1所述式I所示化合物在制备荧光探针或制备用于检测酪氨酸酶的荧光探针中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述检测中，激发波长为670nm；发射波长为708nm。
7.一种酪氨酸酶检测试剂盒，它包括酪氨酸酶检测的荧光探针和溶剂组成的荧光探针储备液；
所述酪氨酸酶检测的荧光探针为权利要求1所述式I所示化合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，所述酪氨酸酶检测的荧光探针在所述荧光探针储备液中的摩尔浓度为0.01～10mM；
所述溶剂选自甲醇和二甲基亚砜中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，所述酪氨酸酶检测的荧光探针在所述荧光探针储备液中的摩尔浓度为0.2mM。
10.权利要求7-9中任一所述试剂盒在制备酪氨酸酶检测或生物样品分析产品中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述生物样品为细胞；
所述酪氨酸酶检测或生物样品分析中，所述酪氨酸酶检测的荧光探针的测试浓度为100nM-20μM。
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