CN107328748B - 一种测定样品中亚硫酸氢盐的检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及亚硫酸氢盐检测技术领域，具体涉及一种基于荧光探针方法的亚硫酸氢盐检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包含试剂储备液a和试剂储备液b；所述试剂储备液a是pH值为6～8的磷酸盐缓冲液，所述试剂储备液b为式(I)所示荧光探针的有机溶剂溶液。该荧光探针本身的荧光强度非常强，亚硫酸氢根能够与半菁骨架中的碳‑碳双键发生迈克尔加成反应，使得荧光母体的共轭体系被打断，从而发生荧光猝灭，荧光强度显著减弱，从而检测到亚硫酸氢盐。本试剂盒荧光产生、淬灭的反应速度快，灵敏度高，荧光最大发射波长处于近红外区域，背景信号干扰小，具有更高的分辨率，且探针对亚硫酸氢根具有特异性，不受其他常见的无机盐离子的干扰。

Description

一种测定样品中亚硫酸氢盐的检测方法及应用
技术领域
本发明属于亚硫酸氢盐检测技术领域，涉及基于近红外荧光探针方法的亚硫酸氢盐检测试剂盒及其检测方法，特别涉及一种测定样品中亚硫酸氢盐的检测方法及应用。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的提高，食品安全问题也越来越受到人们的关注。食品添加剂是引起食品问题的主要原因，在众多的食品添加剂中，亚硫酸氢盐是重要的食品防腐保鲜剂。由于亚硫酸氢盐具有还原性，可以防止氧化酶对食品营养成分的破坏和颜色改变，能抑制微生物繁殖，因而具有漂白、防腐、抗氧化等作用，既可以作为果蔬的防腐保鲜剂，也可以作为防止食品变质的抑制剂。经常用于食品及饮料中的抗氧化、防止酶促褐变以及抑菌等过程。
然而，过多的亚硫酸氢盐也是有危害的，它的毒性主要表现在以下几个方面：(1)亚硫酸氢盐类的食品添加剂使用过量，将会严重破坏食品中的营养物质，降低食品的营养价值；亚硫酸氢盐能够与氨基酸、蛋白质等物质发生反应，还能与多种维生素结合，特别是与维生素B1发生不可逆的亲核反应，会造成维生素B1发生裂解，裂解为其它产物，维生素B1就此被全部损失；此外，亚硫酸氢盐还会促使细胞发生变异，诱导不饱和脂肪酸的氧化等危害。(2)人类食入过量的亚硫酸氢盐会出现头痛、恶心、晕眩及气喘等不良反应。有证据表明，一些对亚硫酸氢盐极其敏感的人，遇到非常低浓度的亚硫酸氢盐时，支气管会严重收缩导致哮喘加重。(3)如果是动物长期吃含有亚硫酸氢盐的食物，会出现神经发炎、骨髓萎缩等不良的症状，这会对动物的成长带来障碍。
因此，世界各国对于食品中的亚硫酸氢盐添加量有严格的限定。世界卫生组织规定每人每天亚硫酸氢盐的摄入量不能超过0.7mg/kg。美国FDA规定食品及饮料中的添加量不得超过125μM。目前，国内外检测亚硫酸氢盐普遍采用的方法有比色法、光谱法、色谱法、电化学法、毛细管电泳法和化学发光法。这些方法检测成本较高，测定时间较长，且需要具有一定专业技术水平的人员才能进行操作，只适合在实验室中进行研究分析。并且一般的化学检测方法选择性差、灵敏度低，无法避免食品或生物复杂体系中其它物质的干扰，目前并没有能够实际应用的亚硫酸氢盐检测试剂盒。
因此，研究选择性好、灵敏度高、使用方便、抗干扰能力强的亚硫酸氢盐检测试剂盒对于现场操作的亚硫酸氢盐检测分析方法具有重要意义。
荧光探针主要是依靠荧光信号为检测手段，通常有荧光的增强、淬灭或者发光波长的变化。用于对外来物种进行检测的荧光探针的设计和研究，是近年来受到广泛关注的一个课题。荧光探针通过分子的发光现象和吸收光谱的变化来探测分子间的相互作用，其优点可以概括为以下几个方面：(1)方便快捷，具有很高的灵敏度；(2)可以利用光纤技术实现单细胞的实时检测；(3)如果在吸收光谱上有比较大的变化，可以在不借助于任何仪器的情况下，直接通过颜色的变化来达到检测的目的。许多分子结构因素和它所处的环境因素都可用来控制荧光发光效率和吸收光谱的变化。因此，如TICT发光、MLCT发光、LMCT发光、激基缔合物和激基复合物发光以及和重原子效应、光诱导电子转移、电子能量转移等相关的光物理和光化学特征等都已成功地用于化学检测方法的设计中。
荧光检测技术具有方便快捷、灵敏度高、选择性好等优点,因此荧光识别检测成为选择性检测特定物种的良好选择。近年来对于与生命、环境相关的阳离子(主要是金属离子)的分子荧光探针已经被广泛研究,在环境化学、生物化学以及细胞生物学等方面的应用也取得了一些进展。
申请号为CN201610272168.7的中国申请，公开了一种用于亚硫酸(氢)盐检测的荧光探针及其应用，其所使用的荧光探针发色团为2,3,3-三甲基-1-烷基苯并吲哚季铵盐，是一种强吸电子性质的荧光团，它的荧光最大发射波长处于465nm，该荧光探针的制备是采用卤代烷基苯并吲哚季铵盐与醛缩合反应进行制备，其可以用于细胞中亚硫酸氢钠的检测。根据其实验结果可以知道，该荧光探针的检测原理是荧光探针与样品中的亚硫酸氢盐结合后使荧光增强，从而当荧光增强时说明样品中含有亚硫酸氢盐。该荧光探针的最大发射波长处于465nm，在该波长处，背景信号干扰较大，容易造成分辨率不足，因此在检测的灵敏度和检测限方面有所欠缺，对于活体成像检测技术而言，检测效果较差。
目前，此类荧光探针仅见于实验室研究阶段，还没有得到广泛推广，鉴于此，设计新型的光学探针，构建对亚硫酸氢盐具有高选择性、高灵敏度响应的光学检测体系，以供在实际的食品、农业等领域检测人员选择，对于荧光探针检测方法的推广应用，具有重要的意义，该类检测方法在农业、食品等领域中有着巨大的应用前景。
发明内容
为了解决现有技术中亚硫酸氢盐检测方法选择性差、灵敏度低、抗干扰能力差，需要具有一定专业技术水平的人员才能进行操作，只适合在实验室中进行研究分析的问题，本发明提供了一种基于荧光探针方法的亚硫酸氢盐检测试剂盒及其检测方法。利用特异的化学识别反应，并结合光物理过程扰动原理，发现了可以与亚硫酸氢盐发生特异性作用的荧光探针，并构建对亚硫酸氢盐具有高选择性、高灵敏度响应的检测试剂盒。本发明试剂盒中的探针储备液与亚硫酸氢盐反应后则可发生荧光猝灭，荧光强度会明显减弱，荧光强度变化明显。
本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：
一种基于近红外荧光探针方法的亚硫酸氢盐检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含试剂储备液a和试剂储备液b；所述试剂储备液a是pH值为6～8的磷酸盐缓冲液，所述试剂储备液b为式(I)所示荧光探针的有机溶剂溶液，所述有机溶剂选自二甲基亚砜，N,N-二甲基甲酰胺、乙腈中的至少一种
式(I)。
进一步地，本发明所述的亚硫酸氢盐检测试剂盒中，所述试剂储备液a中的磷酸盐选自Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种，所述磷酸盐的摩尔浓度为10mM～100mM；所述试剂储备液b中式(I)所示荧光探针的浓度为0.01mM～10mM。
进一步地，本发明所述的亚硫酸氢盐检测试剂盒中，所述试剂储备液a中的磷酸盐的摩尔浓度为10mM；所述试剂储备液b中式(I)所示荧光探针的浓度为0.01mM～1mM。在一些实施方案中，所述试剂盒中的试剂储备液a和所述试剂储备液b的体积比为200/1。
进一步地，本发明所述的亚硫酸氢盐检测试剂盒中，所述试剂储备液a的pH值为7.4，其中，磷酸盐的摩尔浓度为10mM。
本发明所述的亚硫酸氢盐检测试剂盒中，荧光探针的检测原理如下：
本发明的试剂盒中以式(I)所示化合物为荧光探针，其以三碳菁IR-780骨架为荧光母体，碳-碳双键(C＝C)作为特异性响应基团，实验发现，该荧光探针本身的荧光强度非常强，亚硫酸氢盐中的亚硫酸氢根(HSO3 –)能够与半菁骨架中的碳-碳双键发生迈克尔加成反应，使得荧光母体的共轭体系被打断，从而发生荧光猝灭，荧光强度显著减弱，因此，此探针可检测到亚硫酸氢盐的存在，并且荧光强度的变化与亚硫酸氢盐的浓度呈比例，因此通过测定相关荧光信号的变化可测定亚硫酸氢盐的含量。
进一步地，本发明所述的亚硫酸氢盐检测试剂盒中，式(I)所示荧光探针的制备包含以下步骤：在碱存在的条件下，式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物反应，得到式(I)所示荧光探针
Figure GDA0002233869790000041
进一步地，本发明所述的亚硫酸氢盐检测试剂盒，式(I)所示荧光探针的制备方法中，所述碱选自有机碱或无机碱；其中，所述有机碱选自三乙胺、吡啶中的至少一种；所述无机碱选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠中的至少一种。
进一步地，本发明所述的亚硫酸氢盐检测试剂盒，式(I)所示荧光探针的制备方法中，式(II)所示的化合物、式(III)所示的化合物和碱的投料摩尔比为1：1～5：0.5～5。在一些实施方案中，式(II)所示的化合物、式(III)所示的化合物和碱的投料摩尔比为1：1～4：1～4；在另一些实施方案中，投料摩尔比为1：2.5：2.5。
进一步地，本发明所述的亚硫酸氢盐检测试剂盒，式(I)所示荧光探针的制备方法中，反应温度为30℃～60℃；在一些实施方案中，反应温度为40℃～50℃。
进一步地，本发明所述的亚硫酸氢盐检测试剂盒，式(I)所示荧光探针的制备方法中，反应在合适的有机溶剂中进行，所述合适的有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、乙腈中的至少一种。有机溶剂的用量以完全溶解反应物为准，无需特别限定其用量。
进一步地，本发明所述的亚硫酸氢盐检测试剂盒，式(I)所示荧光探针的制备方法中，所述的制备方法的反应时间根据投料量的不同为1小时～24小时，投料量增加，反应时间相应延长。在一些实施方案中，所述的制备方法优选在惰性气体，如氮气或氩气中反应。
本发明亚硫酸氢盐检测试剂盒中的荧光探针(I)的制备方法，简便易行，后处理简单，易于规模化生产。
另一方面，本发明还提供了使用本发明所述的亚硫酸氢盐检测试剂盒测定样品中的亚硫酸氢盐的检测方法，其包含以下步骤：
(1)制备标准曲线
以630nm～690nm作为激发波长，测定一系列不同浓度的亚硫酸氢盐标准品溶液在发射波长690nm～750nm处的荧光强度记为F，以亚硫酸氢盐的浓度为横坐标，荧光强度值F为纵坐标绘制标准曲线，其中，所述不同浓度的亚硫酸氢盐标准品溶液是由试剂盒中的试剂储备液a、试剂储备液b和亚硫酸氢盐标准储备溶液配制得到的；
(2)检测样品中亚硫酸氢盐的浓度
将步骤(1)所述亚硫酸氢盐标准品溶液替换为待测样品溶液，按照步骤(1)所述方法检测待测样品在与步骤(1)相同的发射波长时的荧光强度，记为F’，将所述F’代入步骤(1)所得标准曲线，进而得到待测样品中亚硫酸氢盐的浓度。
在一些实施方案中，使用所述的试剂盒时，其中，所述一系列不同浓度的亚硫酸氢盐标准品溶液由试剂盒中的试剂储备液a、试剂储备液b和亚硫酸氢盐标准储备溶液配制而得，所述亚硫酸氢盐标准储备溶液中，试剂储备液b添加量均相等，溶剂主要为试剂储备液a，亚硫酸氢盐标准储备溶液的浓度为1M；所述一系列不同浓度的亚硫酸氢盐标准品溶液的体积均为2mL，浓度依次为0、0.01mM、0.025mM、0.05mM、0.08mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.5mM、0.8mM和1mM；亚硫酸氢盐浓度在0.01mM～0.15mM之间时，荧光强度与亚硫酸氢盐浓度之间呈成反比关系，相关度R达到0.99以上，可进行定量检测。
使用本发明中所述试剂盒时，激发波长可选630nm～690nm波长段，其中在一些实施方案中，选择激发波长635nm；在另一些实施方案中，选择激发波长650nm；发射波长可选690nm～750nm波长段，其中在一些实施方案中，选择发射波长705nm；在另一些实施方案中，选择发射波长700nm。
还在另一方面，本发明还提供了另一种使用所述的亚硫酸氢盐检测试剂盒测定样品中的亚硫酸氢盐的检测方法，其包含以下步骤：
(i)测定空白对照样品的荧光强度或荧光成像
以630nm～690nm作为激发波长，向不含亚硫酸氢盐的对照样品中加入一定浓度的试剂储备液b，一定时间后用试剂储备液a清洗以除去多余的试剂储备液b，然后在发射波长为690nm～750nm处用荧光仪测定体系的荧光强度，或者是用激光共聚焦进行荧光成像；
(ii)测定待测样品荧光强度或荧光成像
向待测样品中加入与步骤(i)相同浓度的试剂储备液b，一定时间后用试剂储备液a清洗以除去多余的试剂储备液b，测定体系在与步骤(i)相同的发射波长处的荧光强度或者拍摄荧光成像，并与步骤(i)测得的荧光强度或荧光成像对比；
当待测样品的荧光强度小于对照样品的荧光强度或者待测样品荧光成像亮度比对照样品荧光成像弱时，则说明待测样品中含有亚硫酸氢盐。
与现有技术相比，本发明的亚硫酸氢盐检测试剂盒，具有以下优点：
1、本发明的亚硫酸氢盐检测试剂盒中试剂储备液b(探针本身)在约670nm处产生强吸收，并在705nm处荧光显著增强，在690nm～750nm之间，均可以检测到本荧光探针的荧光信号。
2、本发明的亚硫酸氢盐检测试剂盒，荧光产生、淬灭的反应速度快，10分钟内荧光即可显色稳定。
3、本发明的亚硫酸氢盐检测试剂盒，检测灵敏度高，亚硫酸氢盐浓度轻微变化时，荧光强度信号变化明显；荧光强度随亚硫酸氢盐浓度的增加而降低，在亚硫酸氢盐浓度在0.01mM～0.15mM之间时，荧光强度与亚硫酸氢盐浓度之间呈反比关系，相关度R达到0.99以上，可进行定量检测。
4、本发明的亚硫酸氢盐检测试剂盒，亚硫酸氢根对荧光淬灭反应具有特异性，不受其他常见的无机盐离子如F-、Cl-、Br-、I-、CN-、NO2 -、NO3 -、HCO3 -、CO3 2-、SO4 2-的干扰。
5、本发明的亚硫酸氢盐检测试剂盒，最大发射波长处于705nm，位于近红外区域(600nm～900nm)，因此，相较于发射波长在400nm～500nm的荧光探针而言，近红外荧光探针具有较低的荧光背景信号干扰，具有更高的分辨率并且具有较低的检测限和较快的响应时间，因此更有优势，是最适于应用于活体成像的一类荧光探针。
附图说明
图1为亚硫酸氢盐检测试剂盒与不同浓度的亚硫酸氢盐反应的荧光光谱。
图2为亚硫酸氢盐检测试剂盒用于检测亚硫酸氢盐浓度时的标准曲线。
图3为亚硫酸氢盐检测试剂盒用于各种干扰物质反应的荧光发射光谱。
图4为亚硫酸氢盐检测试剂盒检测Hela细胞中不同浓度亚硫酸氢盐的荧光强度变化。
图5为亚硫酸氢盐检测试剂盒检测小鼠摄入亚硫酸氢盐后的荧光强度变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。所属领域的技术人员将认识到：本发明所描述的化学反应可以用来合适地制备许多本发明的其他化合物，例如，根据本发明反应条件做一些常规的修改，用于制备本发明的化合物的其它方法都被认为是在本发明的范围之内。
化合物的结构是通过核磁共振(1H-NMR、13C-NMR)来确定的。1H-NMR、13C-NMR化学位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。1H-NMR、13C-NMR的测定是用Bruker Ultrashield-400核磁共振谱仪和Bruker Avance III HD 600核磁共振谱仪，测定溶剂为氘代甲醇(CD3OD)。用TMS(0ppm)或氯仿(7.25ppm)作为参照标准。当出现多重峰的时候，将使用下面的缩写：s(singlet，单峰),d(doublet，双峰),t(triplet，三重峰),m(multiplet，多重峰),br(broadened，宽峰),dd(doublet of doublets，双二重峰),brs(broadened singlet，宽单峰)。偶合常数，用赫兹(Hz)表示。
柱层析一般使用青岛海洋化工200目～300目硅胶为载体。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂如IR-780碘代物和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或者可以采用或者按照本领域已知的方法来合成。
实施例中无特殊说明，反应均在氮气氛下进行；
氮气氛是指反应瓶连接一个约1L容积的氮气气球或钢釜；
说明书中无特殊说明，室温为20℃～30℃，实施例中所描述的温度误差为±5℃。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)反应所使用的展开剂的体系有：石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节。
实施例1：式(I)所示荧光探针的制备
Figure GDA0002233869790000081
实验步骤如下：将间苯二酚(86.0mg,0.78mmol)和碳酸钾(102mg,0.78mmol)溶解于乙腈溶液中(20mL)，在室温及氮气保护下搅拌10分钟，然后将溶解于乙腈(1mL)中的化合物(II)(即IR-780碘代物,207mg,0.31mmol)加入到混合体系中。反应混合物在50℃下反应4小时，反应完毕，减压蒸除溶剂，得粗产品。用硅胶柱层析纯化粗产品，以石油醚(60～90℃)/乙酸乙酯，(v/v)＝1：1作洗脱剂，得到产物为蓝绿色粉末(67.3mg,收率52.6％)。
该荧光探针的结构表征数据结果如下：
氢谱：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)8.03(d,1H,J＝14.2Hz),7.28-7.23(m,3H),7.19(d,1H,J＝9.2Hz),7.04(t,1H,J＝7.6Hz),6.81(d,1H,J＝7.6Hz),6.74(d,1H,J＝8.8Hz),6.51(s,1H),5.61(d,1H,J＝14.2Hz),3.76(t,2H,J＝7.2Hz),2.67(t,2H,J＝6.0Hz),2.61(t,2H,J＝6.0Hz),1.91-1.78(m,4H),1.66(s,6H),1.06(t,3H,J＝7.6Hz).
碳谱：13C NMR(400MHz,CH3OD):δ(ppm)174.5,173.7,163.8,158.5,144.0,142.2,141.6,140.3,131.1,129.9,126.1,123.5,123.2,121.9,116.2,115.9,112.0,103.6,100.1,50.4,46.6,29.6,29.0,25.3,22.1,21.8,11.9.
式(I)所示荧光探针的制备还可以按照以下表1的实验条件进行。
表1：
Figure GDA0002233869790000082
Figure GDA0002233869790000091
按照上表1的实验条件，均可以得到荧光探针(I)，反应温度为40℃～50℃，式(II)所示的化合物、式(III)所示的化合物和碱的投料摩尔比为1：2.5：2.5，综合反应效果最佳。
实施例2：含有荧光探针(I)的试剂盒与不同浓度亚硫酸氢盐反应的光谱性质
按照本领域常规操作方法配制浓度为10mM，pH为7.4的磷酸盐缓冲液(由10mMNaHPO4 8mL，10mM KH2PO4 2mL配置而成)作为试剂储备液a，磷酸盐浓度指的是NaHPO4和KH2PO4的总浓度，将实施例1制备得到的荧光探针(I)配制成浓度为1mM的溶液作为试剂储备液b，所选用的溶剂为乙腈，得到试剂储备液b。经验证，用于配制试剂储备液b有机溶剂的种类不影响检测效果，换用二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺为溶剂时效果一样。试剂盒中的试剂储备液a和试剂储备液b的体积比为200/1。
将荧光探针溶液b(1mM，50μL)溶于试剂储备液a(10mM，5mL)中，然后加入不同体积的亚硫酸氢盐标准储备溶液(水溶液)，储备液中亚硫酸氢盐的浓度为1M；再用10mM磷酸盐缓冲液定容到10mL，按照此方法配制得到一系列不同浓度的亚硫酸氢盐标准品溶液，亚硫酸氢盐的浓度依次为0、0.01mM、0.025mM、0.05mM、0.08mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.5mM、0.8mM和1mM。
分别取2mL各浓度的亚硫酸氢盐标准品溶液，25℃下反应10min。荧光仪F-4600测量其荧光激发光谱和荧光发射光谱，激发波长可在630nm～690nm波长段内进行选择。荧光发射光谱测定时以650nm为激发波长；激发和发射的狭缝宽度为10nm；电压600V，得到不同浓度的亚硫酸氢盐标准品溶液的发射光谱如图1所示。
荧光发射光谱测定时以650nm为激发波长，测定一系列不同浓度的亚硫酸氢盐标准品的溶液在发射波长为705nm处的荧光强度，记为F；以亚硫酸氢盐的浓度C为横坐标，荧光强度F为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线如图2所示。
标准曲线对应的线性回归方程为：F＝–9191.2C(mM)+2779.9(R2＝0.991)，由标准曲线可知，过氧化苯甲酰浓度在0.01mM～0.15mM之间时，浓度与荧光强度之间呈线性关系，相关度R达到0.99以上。在线性范围内，向待测样品中加入试剂储备液b，检测待测样品在发射波长处的荧光强度，将该荧光强度代入标准曲线，就可得到待测样品中过氧化苯甲酰的浓度。其中，亚硫酸氢盐的浓度单位为mM。
根据本领域常规试验方法，在11次重复实验后得出该探针的检测限(S/N＝3)为0.37μM。
图1结果表明，本发明中的亚硫酸氢盐检测试剂盒具有以下特点：
1)试剂储备液b(探针本身)在约670nm处产生强吸收，并在705nm处荧光显著增强，发射波长在670nm～750nm之间，均可以检测到本荧光探针的荧光信号。
2)反应速度快，10分钟内荧光即可显色稳定。
3)灵敏度高，亚硫酸氢盐浓度轻微变化时，荧光强度信号变化明显；荧光强度随亚硫酸氢盐浓度的增加而降低。
4)在亚硫酸氢盐浓度在0.01mM～0.15mM之间时，荧光强度与亚硫酸氢盐浓度，呈反比关系，可以进行定量检测。
磷酸盐缓冲液(PBS)根据本领域的常识进行配制，试剂储备液a中的磷酸盐选自Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种。
磷酸盐的摩尔浓度可以为10mM～500mM；试剂储备液b中式(I)所示荧光探针的浓度可以为1mM～10mM。最常用的试剂储备液a为浓度10mM，pH为7.4的PBS缓冲液，试剂储备液b为浓度1mM的溶液。
实施例3：含有荧光探针(I)的试剂盒与其他离子的反应情况(选择性研究)
将1mM浓度的试剂储备液b溶于试剂储备液a(10mM，pH 7.4)中配成10μM的荧光探针溶液，向其中分别加入各种无机盐离子(0.5mM，以浓度为10mM的试剂储备液a作为溶剂)：F-、Cl-、Br-、I-、CN-、NO2-、NO3-、HCO3-、CO3 2-、SO4 2-和SO3 2-，得到一组混合溶液，均在25℃下反应10min。
对照试验：在10mL混合了上述各种离子的溶液中，加入50μL浓度为1mM的试剂储备液b，再加入亚硫酸氢盐使该溶液中亚硫酸氢根(HSO3 –)的最终浓度为0.5mM。
使用荧光仪F-4600分别测量上述混合溶液的荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以650nm去激发；激发和发射的狭缝宽度为10nm；电压600V。
实验结果如图3所示，图3为含有荧光探针(I)的检测试剂盒用于各种干扰离子物质反应的荧光发射光谱。
实验结果表明，只有亚硫酸氢盐可引起荧光探针产生明显的光信号显著变化响应，证明该荧光探针对亚硫酸氢盐具有高度的选择性，F-、Cl-、Br-、I-、CN-、NO2-、NO3-、HCO3-、CO3 2-、SO4 2-等其他物质的存在均不会不干扰亚硫酸氢盐的测定。
实施例4：含有荧光探针(I)的试剂盒检测Hela细胞中不同浓度亚硫酸氢盐的荧光 强度变化
Hela细胞于玻璃培养皿中贴壁生长；培养液为DMEM培养液，其中含10％胎牛血清、100mg/mL青霉素和100mg/mL链霉素；培养条件为37℃，5％CO2；培养时间为12～24小时。在进行细胞内亚硫酸氢盐的荧光成像前，Hela细胞用浓度为10μM的试剂储备液b(将1mM的试剂储备液b用试剂储备液a进行稀释而成)的胎牛血清的DMEM在37℃下孵育20min，然后用试剂储备液a(浓度为10mM、pH为7.4)清洗三次后用激光共聚焦显微镜TCS SP5在635nm的激发波长下荧光成像。
荧光探针的荧光性质非常显著，在定性检测中只需要较低的浓度就可以检测到明显的荧光强度变化，因此，试剂储备液b在用于生物样品中，一般稀释到10μM左右的浓度使用。
实验结果如图4所示，图4为试剂盒检测Hela细胞中不同浓度亚硫酸氢盐时的荧光强度变化。
图4中4A为没有加试剂储备液b时的荧光成像，4B为添加了试剂储备液b后的荧光成像，4C、4D和4E分别为加入浓度0.05mM、0.1mM、1mM的亚硫酸氢盐处理后的样品，加入试剂储备液b后的荧光成像。
实验结果：由图4中的4A和4B对比可知：Hela细胞本身无荧光，单独加入荧光探针后Hela细胞荧光显著增强。
而由图4中的4C、4D和4E可知，加入不同浓度亚硫酸氢盐之后的Hela细胞荧光强度显著降低，说明亚硫酸氢盐对探针有不同程度的猝灭作用，且随着亚硫酸氢盐浓度的增大猝灭作用增强；荧光强度变化明显，可以依靠荧光强度判断出亚硫酸氢盐的浓度差别。
实施例5：亚硫酸氢盐检测试剂盒检测小鼠摄入亚硫酸氢盐之后的荧光强度变化
成年BALB/c雄性裸鼠(6周)。在进行活体亚硫酸氢盐的荧光成像前，禁食禁水12小时，10mg kg-1甲苯噻嗪和80mg kg-1氯胺酮采用腹腔注射的方式对小鼠进行麻醉，将小鼠置于活体成像仪进行荧光成像，然后采用腹腔注射的方式将荧光探针浓度为10μM的试剂储备液b(将1mM的试剂储备液b用试剂储备液a稀释而成)200μL注射进小鼠的腹腔中30min后进行荧光成像。试剂储备液b稀释的原因在于，本试剂盒中的荧光探针的荧光强度本身较强，在近红外区域背景干扰少，浓度较低时就有较好的活体荧光成像效果。同时采用腹腔注射的方式注射300μL 400mg/kg的NaHSO3溶液(溶于试剂储备液a浓度为10mM、pH为7.4)。处理完成后用活体成像仪进行荧光成像，激发波长为650nm，发射波长为700nm，时间为15min一次，连拍4次。
实验结果如图5所示，图5为随时间变化，注射亚硫酸氢盐的小鼠体内荧光强度变化。图5中5A为没有注射试剂储备液b时的小鼠荧光成像，5B为注射了试剂储备液b后的荧光成像，5C、5D、5E和5F分别为注射荧光探针之后15min、30min、45min和60min后的小鼠活体荧光成像。由图5中的5A和5B可知小鼠相同测试条件下，小鼠本身没有荧光，而注射了荧光探针的小鼠体内荧光强度显著增强。而由图5中的5C～5F可知，亚硫酸氢盐的加入在短时间内即可使得荧光探针本身的荧光发生猝灭，随着时间的延长，荧光强度显著减弱，说明亚硫酸氢盐对荧光探针具有荧光猝灭作用，响应时间短；且随着时间延长，亚硫酸氢根对荧光淬灭作用增强。
以上实施例4和实施例5很好的验证了，应用含有本发明式(I)所示的荧光探针的试剂盒可以通过对比荧光强度变化或荧光成像强度的方式，直观地判断待测样品是否含有亚硫酸氢根，不仅适用于普通生物样本(细胞)，对于复杂生物活体样本同样适用，并且在检测亚硫酸氢盐方面，本发明所提供的试剂盒反应迅速，灵敏程度高，操作简单，对于活体检测对象也具有很好的检测效果，适于广泛应用。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种测定样品中亚硫酸氢盐的检测方法，其特征在于，
包括，基于荧光探针方法的亚硫酸氢盐检测试剂盒，所述试剂盒包含试剂储备液a和试剂储备液b；所述试剂储备液a是pH值为6～8的磷酸盐缓冲液，所述试剂储备液b为式(I)所示荧光探针的有机溶剂溶液，所述有机溶剂选自二甲基亚砜，N,N-二甲基甲酰胺、乙腈中的至少一种
Figure FDA0002233869780000011
所述试剂储备液a中的磷酸盐选自Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种；
所述试剂储备液a中的磷酸盐的摩尔浓度为10mM；所述试剂储备液b中式(I)所示荧光探针的浓度为0.01mM～1mM；
其中，式(I)所示荧光探针的制备，包含以下步骤：在碱存在的条件下，式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物反应，得到式(I)所示荧光探针
Figure FDA0002233869780000012
式(I)所示荧光探针的制备中，所述碱选自有机碱或无机碱；其中，所述有机碱选自三乙胺、吡啶中的至少一种；所述无机碱选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠中的至少一种；式(II)所示的化合物、式(III)所示的化合物和碱的投料摩尔比为1：1～5：0.5～5；反应温度为30℃～60℃；反应在合适的有机溶剂中进行，所述合适的有机溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、乙腈中的至少一种；
还包括，使用上述亚硫酸氢盐检测试剂盒测定样品中的亚硫酸氢盐的检测方法，
其步骤是：
(1)制备标准曲线
以630nm～690nm作为激发波长，测定一系列不同浓度的亚硫酸氢盐标准品溶液在发射波长690nm～750nm处的荧光强度记为F，以亚硫酸氢盐的浓度C为横坐标，荧光强度值F为纵坐标绘制标准曲线，其中，所述不同浓度的亚硫酸氢盐标准品溶液是由试剂盒中的试剂储备液a、试剂储备液b和亚硫酸氢盐标准储备溶液配制得到的；
(2)检测样品中亚硫酸氢盐的浓度
将步骤(1)所述亚硫酸氢盐标准品溶液替换为待测样品，向其中加入试剂储备液b，按照步骤(1)所述方法检测待测样品在与步骤(1)相同的发射波长时的荧光强度，记为F’，将所述F’代入步骤(1)所得标准曲线，进而得到待测样品中亚硫酸氢盐的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种测定样品中亚硫酸氢盐的检测方法，其特征在于，使用亚硫酸氢盐检测试剂盒测定样品中的亚硫酸氢盐的检测方法，
或，其步骤是：
(i)测定空白对照样品的荧光强度或荧光成像
以630nm～690nm作为激发波长，向不含亚硫酸氢盐的对照样品中加入一定浓度的试剂储备液b，一定时间后用试剂储备液a清洗，然后在发射波长为690nm～750nm处用荧光仪测定体系的荧光强度，或者是用激光共聚焦进行荧光成像；
(ii)测定待测样品荧光强度或荧光成像
向待测样品中加入与步骤(i)相同浓度的试剂储备液b，一定时间后用试剂储备液a清洗，测定体系在与步骤(i)相同的发射波长处的荧光强度或者拍摄荧光成像，并与步骤(i)测得的荧光强度或荧光成像对比；
当待测样品的荧光强度小于对照样品的荧光强度或者待测样品荧光成像亮度比对照样品荧光成像弱时，则说明待测样品中含有亚硫酸氢盐。
3.权利要求1或2所述亚硫酸氢盐检测试剂盒和检测方法用于测定样品中亚硫酸氢盐的应用。
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