CN108414488B - 一种用于检测铜离子的特异性荧光探针、方法及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测铜离子的特异性荧光探针、方法及试剂盒 Download PDF

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    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells

Abstract

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种用于检测铜离子的特异性荧光探针、方法及试剂盒，所述铜离子荧光探针核酸序列，所述核酸序列至少包括18个核苷酸，所述核酸序列的3’端修饰叠氮基团、5’端修饰荧光基团。本发明使用单链核酸，且对组成所述核酸的碱基排列无要求，经济可行，制备简便；用具有一定长度的核酸序列连接叠氮基团与荧光基团，使叠氮基团与荧光基团之间具有一定的间距，二者不会互相影响，而只发射荧光基团的荧光，大大降低了背景机制的影响，提高了所述荧光探针检测的准确性。

Description

一种用于检测铜离子的特异性荧光探针、方法及试剂盒
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种用于检测铜离子的特异性荧光探针、方法及试剂盒。
背景技术
铜元素是生物体内所必需的一种微量重金属元素和必需的营养素，在细胞中的含量仅次于铁和锌，而铜离子是铜元素的重要存在形式，在各种有机体的基本生理过程中均发挥着重要作用，如作为金属酶(如细胞色素氧化酶、过氧化物歧化酶、酪氨酸酶、多巴胺β-羟化酶、赖氨酰氧化酶和铜蓝蛋白等二十多种酶类)的催化辅助因子的形式，广泛参与生命体系中电子传递、氧化还原等一系列过程，在生物体内的酶反应、酶转录以及一些氧化还原过程发挥重要的作用。人体血液中铜离子的正常含量为100～150μg/dL(15.7～23.6μmol/L)，合适含量的铜离子是生物体维持正常工作的基本保证，如果生物体内的铜离子含量偏小，会导致生长和代谢的紊乱，而含量过多同样也会对生物体产生巨大的毒害作用。铜离子过量通常是由于环境中重金属离子污染造成的，通过食物链在生物体富集，影响肝肾的正常代谢，造成神经退行性疾病以及引发癌症。为此，我国规定生活饮水中铜离子含量不得超过1.0mg/L，城镇污水处理厂排放标准中铜含量不得超过0.5mg/L。因此，对铜离子进行检测以控制其含量具有十分重要的意义。
目前检测铜离子浓度的方法主要有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体-质谱法、电感耦合等离子体-原子发射光谱法、石英晶体微天平检测技术、电化学技术等。这些技术虽然有一定的灵敏度和特异性，但仪器比较贵重且需要专业人员操作，检测耗费较大，难以在铜离子的检测中普及应用。荧光检测方法由于具有较高的灵敏度和选择性且使用方便等优点，成为学者们研究的热点，并已被广泛应用于铜离子的检测。
中国专利文献CN107064515A公开了一种基于点击化学的铜离子检测方法及检测试剂盒，二价铜离子在还原剂作用下被还原成一价铜离子，从而激活点击化学反应，连接两段核酸序列，磁珠分离后可进一步组装具有催化活性的催化型核酸结构，可切断底物核酸，从而使底物核酸两段的荧光基团和淬灭基团分离，通过荧光检测鉴定铜离子浓度，该方法具有较高的灵敏度和特异性，对铜离子的检测限为2pM。然而，上述公开的技术需要使用多种核酸序列，且每种核酸序列的碱基排布均有严格的要求，从而导致检测成本高；此外，该技术的检测方法包括多个步骤，有的步骤甚至需要严格规定反应温度及时间，如需要在95℃加热5min后立即冰浴10min，反应条件苛刻，操作不简便，耗时过长(需要220分钟)，并且还容易受到外界环境干扰，严重影响了上述方法的可重复性和稳定性。综上，上述技术在检测铜离子时存在着操作繁琐、耗时长、经济性和稳定性较差的问题。
发明内容
因此，本发明要解决的是现有的铜离子检测方法所存在的操作繁琐、耗时长、经济性和稳定性差的问题，从而提供一种操作简单、快捷、经济可行且稳定性好的铜离子检测方法。进一步地，本发明还提供了一种用于上述检测方法的铜离子特异性荧光探针及包含其的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种铜离子荧光探针，所述铜离子荧光探针包括核酸序列，所述核酸序列至少包括18个核苷酸，所述核酸序列的3’端修饰叠氮基团、5’端修饰荧光基团。
进一步地，所述荧光基团源自荧光素类化合物。
更进一步地，所述荧光素类化合物为羧基荧光素、异硫氰酸荧光素或四氯荧光素。
进一步地，所述核酸序列的5’端向3’端延伸的过程中包含ATA CCA GCT TAT TCAATT碱基序列。
本发明还提供了一种铜离子的检测方法，包括以下步骤：
(1)在pH＝7.0～8.0的水溶液中，将权利要求1-4任一项所述的铜离子荧光探针与还原剂混合均匀；
(2)将含铜(II)离子的待测液加入至步骤(1)的体系中，混匀后并进行荧光检测。
进一步地，步骤(1)中，所述pH＝7.0～8.0的水溶液为磷酸盐缓冲溶液。
进一步地，在步骤(1)的体系中，所述铜离子荧光探针的物质的量浓度为10μmol/L。
进一步地，所述还原剂选自抗坏血酸钠、维生素C、柠檬酸盐中的一种或多种。
进一步地，步骤(2)中所述待测液中铜(II)离子的物质的量浓度为15～450ng/mL。
进一步地，步骤(2)中，在将含铜(II)离子的待测液加入至步骤(1)的体系中前还包括将至少3种不同铜(II)离子浓度的标准液分别加入至步骤(1)的体系中，并根据检测结果绘制铜离子浓度与荧光强度值的标准曲线图。
进一步地，步骤(2)中，荧光激发波长为480nm。
进一步地，步骤(1)中还包括，向所述pH＝7.0～8.0的水溶液中加入三唑类化合物的步骤。
进一步地，所述三唑类化合物与所述待测液中铜(II)离子物质的量比为(178～5300)：1。
更进一步地，所述三唑类化合物为三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺和/或三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺。
本发明还提供了一种铜离子检测试剂盒，包括上述的铜离子荧光探针、pH＝7.0～8.0的水溶液与还原剂。
进一步地，所述铜离子检测试剂盒还包括三唑类化合物。
本发明提供的铜离子检测方法的工作原理为：采用具有一定长度的核酸序列连接叠氮基团与荧光基团，使两者之间具有一定的间距而不会互相影响，当有Cu2+存在时，Cu2+首先靠近叠氮基团并与其结合，随之，还原剂(以抗坏血酸钠为例)将Cu2+还原为不稳定的Cu+，而后Cu+与两分子核酸序列形成不稳定的三配位配合物，导致体系的荧光强度降低，由此可达到检测铜(II)离子的目的。当体系中同时存在三唑类化合物(以三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺，TBTA为例)时，Cu+会被三唑类化合物捕捉，如图1所示，形成以Cu+为配位中心、一分子三唑类化合物及两分子核酸序列为配体的稳定配合物，在该配合物中，由于Cu+与荧光基团的距离被拉近，进而淬灭了荧光基团的荧光。
本发明的技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的铜离子荧光探针，所述荧光探针为两端分别修饰了叠氮基团和荧光基团的核酸序列，所述核酸序列至少包括18个核苷酸，使用单链核酸，且对组成所述核酸的碱基排列无要求，经济可行，制备简便；用具有一定长度的核酸序列连接叠氮基团与荧光基团，使叠氮基团与荧光基团之间具有一定的间距，二者不会相互影响，而只发射荧光基团的荧光，大大降低了背景机制的影响，提高了所述荧光探针检测的准确性。
2.本发明提供的铜离子荧光探针，选用特定的荧光素作为荧光基团，其具有高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性，Stokes位移较大，有效消除了常规荧光化合物具有自淬灭现象；此外，本发明中的荧光素荧光发射波长位于520nm左右，属于长波长区，可避免复杂体系的短波长区背景荧光的干扰。
3.本发明提供的铜离子的检测方法，操作简单，反应条件温和，无需复杂的标记过程及苛刻的操作环境，反应进行1min左右即可用荧光光谱仪检测结果，大大降低了检测时间和成本，有望于铜离子检测的普及应用。
4.本发明提供的铜离子的检测方法，还包括在反应体系中加入三唑类化合物，所述三唑类化合物可通过点击化学制备得到，其能选择性捕捉Cu(I)，并与其形成配位化合物而稳定地存在于体系中，有效提高了所述检测方法的稳定性及选择性；加入的三唑类化合物与Cu(I)形成稳定化合物进而淬灭荧光，其淬灭效率超过99％，荧光淬灭效果明显。
5.本发明提供的铜离子的检测方法，在铜(II)离子的物质的量浓度为15～450ng/mL内，对于铜(II)离子呈现良好的线性关系，线性相关系数R2为0.9978，检测限低至4.3ng/mL，远低于我国铜离子在生活饮水及城镇污水处理厂排放中的最低限标准。
6.本发明提供的铜离子检测试剂盒，其操作过程十分简单，且反应均是在室温下进行，反应条件温和，响应速度很快，反应进行1min左右即可用荧光光谱仪检测结果，检测时间和成本均有很大的优势，有望大范围推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的铜离子荧光探针水溶液中加入TBTA后的检测原理图；
图2为本发明实施例3的检测体系中加入不同浓度的铜离子后，检测体系荧光强度的变化曲线图；
图3是本发明实施例3的检测体系中加入不同浓度的铜离子后，检测体系的荧光强度变化与铜离子浓度的线性关系图；
图4是本发明实验例3未加入TBTA的检测体系中加入不同金属离子的荧光强度减少的倍数图；
图5是本发明实验例3加入TBTA的检测体系中加入不同金属离子的荧光强度减少的倍数图；
图6是本发明实验例3的检测体系中分别加入和不加入铜离子的荧光强度变化曲线图，其中：a)N3-DNA-FAM溶液；(b)N3-DNA-FAM+抗坏血酸钠(SA)+TBTA的混合溶液；(c)N3-DNA-FAM+Cu(II)离子的混合溶液；(d)N3-DNA-FAM+抗坏血酸钠(SA)+Cu(II)离子的混合溶液；(e)N3-DNA-FAM+抗坏血酸钠(SA)+TBTA+Cu(II)离子的混合溶液。C(N3-DNA-FAM)＝0.125μmol/L；CCu(II)＝2.5μg/mL。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
实施例1
本实施例提供了一种铜离子荧光探针，其成分为：5’-FAM-DNA-N3-3’，FAM为羧基荧光素，组成单链DNA的核苷酸序列为SEQ ID No：1(ATA CCA GCT TAT TCA ATT)，其制备方法具体为：
(1)将5-FAM亚磷酸酰胺单体溶解在无水乙腈中，形成浓度为0.1mol/L的溶液；
(2)将dA、dC、dG、T四种亚磷酸酰胺单体溶解在无水乙腈中，形成0.065mol/L的溶液；
(3)将上述步骤(1)、(2)所得溶液和0.1mol/L的3’叠氮亚磷酸酰胺单体同时放入DNA合成仪中，按照3’到5’方向输入上述核苷酸序列(ID No：1)，合成10min，合成结束后，用1.5mL的叔丁胺-甲醇-水(三者的体积比为1:1:2)溶液，60℃下水浴4h，得到5’-FAM-DNA-N3-3’产物，DNA的核苷酸序列为SEQ ID No：1(ATA CCA GCT TAT TCA ATT)；
(4)采用脱盐、高效液相色谱技术对步骤(3)所得产物进一步纯化，收集备用。
实施例2
本实施例提供了一种铜离子荧光探针，其成分为：5’-FITC-DNA-N3-3’，FITC为异硫氰酸荧光素，组成单链DNA的核苷酸序列为SEQ ID No：2(CCT CTC CGT GTC TTG TAC TTCCCG TCA GAG AGT)，其制备方法具体为：
(1)将FITC亚磷酸酰胺单体溶解在无水乙腈中，形成浓度为0.1mol/L的溶液；
(2)将dA、dC、dG、T四种亚磷酸酰胺单体溶解在无水乙腈中，形成0.065mol/L的溶液；
(3)将上述步骤(1)、(2)所得溶液和0.1mol/L的3’叠氮亚磷酸酰胺单体同时放入DNA合成仪中，按照3’到5’方向输入上述核苷酸序列(ID No：2)，合成10min，合成结束后，用1.5mL的叔丁胺：甲醇：水(1:1:2)溶液，60℃下水浴4h，得到5’-FITC-DNA-N3-3’产物，DNA的核苷酸序列为SEQ ID No：2(CCT CTC CGT GTC TTG TAC TTC CCG TCA GAG AGT)；
(4)采用脱盐、高效液相色谱技术对步骤(3)所得产物进一步纯化，收集备用。
实施例3
本实施例提供了一种基于铜离子荧光探针的检测方法，操作步骤为：
(1)将实施例1中的铜离子荧光探针溶解在0.01mol/L的磷酸盐(PBS)缓冲液中配制成浓度为10μmol/L的铜离子荧光探针溶液；
将TBTA溶解在水与甲醇的混合液(两者体积比为1：1)中，形成5.0mmol/L的TBTA溶液；
分别取3.0μL 10μmol/L铜离子荧光探针溶液、10μL 1.0μmol/L的抗坏血酸钠溶液及5.0μL 5.0mmol/L的TBTA溶液，加到180μL PBS缓冲液(C＝0.01mol/L，pH＝7.4)中，室温下混合均匀；
(2)向步骤(1)的混合液中分别加入浓度为0、15、30、45、150、300、450、1500、3000、4500ng/mL的待测铜(II)离子溶液，室温下混匀，用荧光光谱仪检测室温条件下检测体系的荧光动力学过程，激发波长480nm，发射波长520nm。
本实施例的检测体系中加入铜离子溶液后，检测体系的荧光强度随铜(II)离子浓度的变化趋势如图2所示。由图2可以看出，加入铜(II)离子之后体系的荧光强度减小，且随着铜(II)离子浓度的增加，荧光强度逐渐减小。如图3所示，在铜(II)离子浓度为15～450ng/mL范围内，荧光强度的变化符合线性关系方程F0/F＝0.003C+0.96(F0为检测体系中未加铜离子溶液对应的荧光强度值，F为检测体系中加入铜离子溶液对应的荧光强度值，C代表加入的待测铜离子溶液中铜(II)离子的浓度)。
(3)配制铜(II)离子浓度为15～450ng/mL的待测样品，并将其加入至步骤(1)的混合液中，检测该体系的荧光强度值，并将之代入上述线性方程，即可计算得到待测样品中铜(II)离子的浓度。
实验结果表明，在本实施例的方法对铜(II)离子的检测限约为4.3ng/mL。
实施例4
本实施例提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括实施例1或2中的铜离子荧光探针、pH为7.4的PBS缓冲液与抗坏血酸钠。
实施例5
本实施例提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括实施例1或2中的铜离子荧光探针、pH为7.4的PBS缓冲液、抗坏血酸钠和TBTA。
实验例1特异性实验
1.将实施例1中的铜离子荧光探针溶解在0.01mol/L的PBS缓冲液中配制成浓度为10μmol/L的铜离子荧光探针溶液，分别取3.0μL 10μmol/L铜离子荧光探针溶液及10μL1.0mmol/L的抗坏血酸钠溶液加到185μLPBS缓冲液(c＝0.01mol/L，pH＝7.4)中，室温下混合均匀，然后加入浓度为0.8μg/mL的Cu2+溶液，测量体系的荧光强度值，并计算(F0-F)/F值；
同上述操作，分别用浓度为12.5μg/mL的其它金属离子代替Cu2+，其他金属离子分别为：K+、Ca2+、Cd2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Pb2+、Hg2+、Fe3+、Cr3+，分别测量检测体系的荧光强度，并计算对应的(F0-F)/F值；
上述(F0-F)/F的计算结果如图4所示。
2.将实施例1中的铜离子荧光探针溶解在0.01mol/L的PBS缓冲液中配制成浓度为10μmol/L的铜离子荧光探针溶液；将TBTA溶解在水与甲醇的混合液(两者体积比为1：1)中，形成5.0mmol/L的TBTA溶液；分别取3.0μL 10μmol/L铜离子荧光探针溶液、10μL 1.0mmol/L的抗坏血酸钠溶液及5.0μL 5.0mmol/L的TBTA溶液，加到180μL PBS缓冲液(c＝0.01mol/L，pH＝7.4)中，室温下混合均匀，后加入浓度为0.8μg/mL的Cu2+溶液，测量体系的荧光响应值，并计算(F0-F)/F值。
同上述操作，分别用浓度为12.5μg/mL的其它金属离子代替Cu2+，其他金属离子分别为：K+、Ca2+、Cd2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Pb2+、Hg2+、Fe3+、Cr3+，测量体系的荧光强度值，并计算相应的(F0-F)/F值。
上述(F0-F)/F的计算结果如图5所示。
对比图4与图5可以看出，TBTA的存在对含铜(II)离子体系的荧光淬灭强度有明显的放大效应，而对其它金属离子无明显影响。可见，检测体系中加入TBTA能大大降低其它相似金属离子的干扰，提高本发明检测方法的选择性和稳定性。
实验例2可行性实验
(1)将实施例1中的铜离子荧光探针溶解在0.01mol/L的PBS缓冲液中配制成浓度为10μmol/L的铜离子荧光探针溶液，取3.0μL铜离子荧光探针溶液加入至197μL PBS缓冲溶液中，测定该溶液的荧光强度；
(2)将3.0μL 10μmol/L的铜离子荧光探针溶液、5.0μL 5.0mmol/L的TBTA溶液、10μL 1.0mmol/L的抗坏血酸钠(SA)溶液一起加入至182μL PBS缓冲溶液，测定该溶液的荧光强度；
(3)将3.0μL 10μmol/L的铜离子荧光探针溶液、2.5μL 0.2mg/mLCu(II)离子溶液一起加入至194.5μL PBS缓冲溶液，测定该溶液的荧光强度；
(4)将3.0μL 10μmol/L的铜离子荧光探针溶液、10μL 1.0mmol/L的抗坏血酸钠溶液、2.5μL 0.2mg/mL Cu(II)离子溶液一起加入至184.5μL PBS缓冲溶液，测定该溶液的荧光强度；
(5)将3.0μL 10μM的铜离子荧光探针溶液、5.0μL 5.0mmol/L的TBTA溶液、10μL1.0mmol/L的抗坏血酸钠溶液、2.5μL 0.2mg/mL Cu(II)离子溶液一起加入至179.5μL PBS缓冲溶液，测定该溶液的荧光强度；
将上述步骤(1)、(2)、(3)、(4)、(5)中所测得的荧光强度绘制在一张图中，如图6所示。由图6可以看出，抗坏血酸钠和TBTA对单独的铜离子荧光探针溶液的荧光强度并没有明显影响，而却对含Cu(II)离子的铜离子荧光探针溶液体系才有明显淬灭荧光作用，并且TBTA化合物的存在大大提高了体系荧光的淬灭强度。此外，单独存在抗坏血酸钠时也可使含Cu(II)离子的铜离子荧光探针溶液体系的荧光强度明显降低。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所
<120> 一种用于检测铜离子的特异性荧光探针、方法及试剂盒
<130> NHA201800029
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 1
ataccagctt attcaatt 18
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<400> 2
cctctccgtg tcttgtactt cccgtcagag agt 33

Claims (11)

1.一种铜离子的检测方法，包括以下步骤：
（1）在pH=7.0～8.0的水溶液中，铜离子荧光探针与还原剂混合均匀；所述铜离子荧光探针包括核酸序列，所述核酸序列的3’端修饰叠氮基团、5’端修饰荧光基团；所述核酸序列为5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3’；所述荧光基团源自荧光素类化合物；所述荧光素类化合物为羧基荧光素、异硫氰酸荧光素或四氯荧光素；
（2）将含铜（II）离子的待测液加入至步骤（1）的体系中，混匀后并进行荧光检测；
该检测的方法的工作原理为：采用具有一定长度的核酸序列连接叠氮基团与荧光基团，使两者之间具有一定的间距而不会互相影响，当有Cu2+存在时，Cu2+首先靠近叠氮基团并与其结合，随之，还原剂将Cu2+还原为不稳定的Cu+，而后Cu+与两分子核酸序列形成不稳定的三配位配合物，导致体系的荧光强度降低，由此可达到检测铜（II）离子的目的。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述pH=7.0～8.0的水溶液为磷酸盐缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在步骤（1）的体系中，所述铜离子荧光探针的物质的量浓度为10 μmol/L。
4.根据权利要求2或3所述的检测方法，所述还原剂选自抗坏血酸钠、维生素C、柠檬酸盐中的一种或多种。
5.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述待测液中铜（II）离子的浓度为15～450 ng/mL。
6.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，在将含铜（II）离子的待测液加入至步骤（1）的体系中前还包括将至少3种不同铜（II）离子浓度的标准液分别加入至步骤（1）的体系中，并根据检测结果绘制铜离子浓度与荧光强度值的标准曲线图。
7.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中，荧光激发波长为480nm，荧光发射波长为520 nm。
8.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中还包括，向所述pH=7.0～8.0的水溶液中加入三唑类化合物的步骤；
当体系中存在三唑类化合物时，Cu+会被三唑类化合物捕捉，形成以Cu+为配位中心、一分子三唑类化合物及两分子核酸序列为配体的稳定配合物，在该配合物中，由于Cu+与荧光基团的距离被拉近，进而淬灭了荧光基团的荧光。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述三唑类化合物为三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺和/或三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺。
10.一种铜离子检测试剂盒，其特征在于，由铜离子荧光探针、pH=7.0～8.0的水溶液和还原剂组成；所述铜离子荧光探针包括核酸序列，所述核酸序列的3’端修饰叠氮基团、5’端修饰荧光基团；所述核酸序列为5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3’；所述荧光基团源自荧光素类化合物；所述荧光素类化合物为羧基荧光素、异硫氰酸荧光素或四氯荧光素；
检测方法包括以下步骤：
（1）在pH=7.0～8.0的水溶液中，铜离子荧光探针与还原剂混合均匀；
（2）将含铜（II）离子的待测液加入至步骤（1）的体系中，混匀后并进行荧光检测；
该检测的方法的工作原理为：采用具有一定长度的核酸序列连接叠氮基团与荧光基团，使两者之间具有一定的间距而不会互相影响，当有Cu2+存在时，Cu2+首先靠近叠氮基团并与其结合，随之，还原剂将Cu2+还原为不稳定的Cu+，而后Cu+与两分子核酸序列形成不稳定的三配位配合物，导致体系的荧光强度降低，由此可达到检测铜（II）离子的目的。
11.一种铜离子检测试剂盒，其特征在于，由铜离子荧光探针、pH=7.0～8.0的水溶液、还原剂和三唑类化合物组成；所述铜离子荧光探针包括核酸序列，所述核酸序列的3’端修饰叠氮基团、5’端修饰荧光基团；所述核酸序列为5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3’；所述荧光基团源自荧光素类化合物；所述荧光素类化合物为羧基荧光素、异硫氰酸荧光素或四氯荧光素；
检测方法包括以下步骤：
（1）在pH=7.0～8.0的水溶液中，铜离子荧光探针与还原剂混合均匀；
（2）将含铜（II）离子的待测液加入至步骤（1）的体系中，混匀后并进行荧光检测；
步骤（1）中还包括，向所述pH=7.0～8.0的水溶液中加入三唑类化合物的步骤；
该检测的方法的工作原理为：采用具有一定长度的核酸序列连接叠氮基团与荧光基团，使两者之间具有一定的间距而不会互相影响，当有Cu2+存在时，Cu2+首先靠近叠氮基团并与其结合，随之，还原剂将Cu2+还原为不稳定的Cu+，而后Cu+与两分子核酸序列形成不稳定的三配位配合物，导致体系的荧光强度降低，由此可达到检测铜（II）离子的目的；
当体系中存在三唑类化合物时，Cu+会被三唑类化合物捕捉，形成以Cu+为配位中心、一分子三唑类化合物及两分子核酸序列为配体的稳定配合物，在该配合物中，由于Cu+与荧光基团的距离被拉近，进而淬灭了荧光基团的荧光。
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