CN113717163B - 一种具有大斯托克斯位移特征的酪氨酸酶识别近红外荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有大斯托克斯位移特征的酪氨酸酶识别近红外荧光探针的制备与应用。本发明的近红外荧光探针是EQR‑TYR，其结构式为式I。EQR‑TYR本身无荧光，但可以选择性的与TYR发生荧光打开反应，由于具有较大的斯托克斯位移(130nm)，大大降低了系统背景荧光的干扰，提高了对TYR活性检测的灵敏度。同时，各种常见干扰离子或物质对TYR荧光检测几乎无干扰。因此，EQR‑TYR适用于对TYR进行高选择性和高灵敏度的荧光检测。

Description

一种具有大斯托克斯位移特征的酪氨酸酶识别近红外荧光探 针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种具有大斯托克斯位移特征的酪氨酸酶识别近红外荧光探针EQR-TYR及其制备方法与应用。
背景技术
酪氨酸酶(TYR)是一种细胞质黑色素细胞分化蛋白，通过将酪氨酸氧化成醌类化合物，在黑色素的生物合成过程中起到至关重要的作用。TYR可以导致多巴胺的神经毒性和神经变性，从而诱发帕金森病。同时，细胞中TYR的反常表达将导致体内黑色素的过量或者缺乏，从而引起诸如黑色素瘤、皮肤色素沉着、白化病或白癫风等皮肤病。黑色素瘤是最严重的皮肤癌症之一，具有较高的恶性转化率，且早期恶性转移率和致死率都比较高。目前，TYR被公认为黑色素瘤诊断和预诊断的重要生物标志物。因此，开发高选择性和高灵敏性的TYR活性监控技术至关重要，不仅有利于加深TYR生理学和病理学功能的理解，而且对于TYR相关疾病的诊断、预诊断和治疗的监控都有极其重要的作用。
TYR活性传统检测方法包括比色法、电化学方法、光电化学法以及拉曼光谱法等。然而，上述方法因不同程度地存在着诸如耗时长、费时费力、时空分辨率低、抗干扰能力差以及水溶性差等缺陷，尤其是来自细胞的背景干扰，影响方法的灵敏度和准确性。与传统方法相比，化学传感器结合激光共聚焦成像技术因其高灵敏性、高选择性、抗干扰能力、操作简单、对细胞、组织和生物体的无损检测等优点逐渐应用于TYR活性的检测。但是，目前针对TYR活性检测的化学传感器存在着诸如斯托克斯位移小、检测时间长(3h)、易受活性氧物种干扰、检出限过高和水溶性差等缺点。因此，开发出能克服上述缺点的新型化学传感器的任务显得尤为紧迫。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能够高选择性和高灵敏度检测TYR活性的近红外化学传感器分子—EQR-TYR。
本发明所提供的EQR-TYR，其结构如式I：
Figure BDA0003288750680000021
所述EQR-TYR的盐具体可为碘盐。
本发明的另一个目的是提供式I所示的EQR-TYR的制备方法。
本发明所提供的EQR-TYR的制备方法，包括如下步骤(制备流程图见图1)：
1)将环己酮和三溴化磷进行反应合成化合物1(2-溴-1-环己烯-1-甲醛)；2)将化合物1与4-甲氧基水杨醛反应生成化合物2(2,3-二氢-6-甲氧基-1H-呫吨-4-甲醛)；3)将4-甲基喹啉与碘乙烷反应生成化合物3；4)将化合物2和化合物3在无水乙酸酐中进行反应，得到固体物质，再将上述固体物质在三溴化硼的作用下生成式II所示的EQR；5)将EQR与3-羟基苄基溴进行反应，得到式I所示的EQR-TYR。
Figure BDA0003288750680000022
上述方法步骤1)中，所述环己酮和三溴化磷进行反应为将环己酮添加到三溴化磷、二甲基甲酰胺和二氯甲烷共存的混合溶液(溶液温度为0℃)中，然后升温反应。所述反应中，环己酮和三溴化磷的摩尔比为1：1.1；所述二甲基甲酰胺和二氯甲烷的体积比0.224：1。所述反应的温度为室温(20-25℃)，反应时间为12小时。
上述方法步骤2)中，所述化合物1和4-甲氧基水杨醛在碳酸铯的存在下进行反应，具体为：将化合物1，溶于二甲基甲酰胺和4-甲氧基水杨醛，然后向体系中加入碳酸铯。所述反应中，化合物1、4-甲氧基水杨醛和碳酸铯的摩尔比为1.2：1：3。所述反应的温度为室温(20-25℃)，反应时间为24小时。
上述方法步骤3)中，所述4-甲基喹啉和碘乙烷的反应在乙腈中进行。所述反应中，4-甲基喹啉和碘乙烷的摩尔比为1：1.5。所述反应的温度为80℃，反应时间为12小时。
上述方法步骤4)中，具体操作步骤为：首先将化合物2和化合物3溶于无水乙酸酐进行第一步反应得到中间产物，然后在剧烈搅拌条件下，将三溴化硼逐滴加入到中间产物的二氯甲烷溶液(体系温度为0℃)中，升温至室温(20-25℃)进行第二步反应，从而得到EQR。所述第一步反应中，化合物2和化合物3的摩尔比为1：1.25，所述反应的温度为140℃，反应时间为12小时；所述第二步反应中，中间产物与三溴化硼的摩尔比为1：10，所述反应的温度为室温(20-25℃)，反应时间为12小时。
上述方法步骤5)中，所述EQR和3-羟基苄基溴的反应在氮气保护下进行。所述反应在溶剂中进行，所述溶剂具体可为乙腈。所述反应具体操作如下：将3-羟基苄基溴的乙腈溶液逐滴缓慢加入到EQR和碳酸钾共存的乙腈溶液中进行反应。所述反应中，EQR、3-羟基苄基溴和碳酸钾的摩尔比为1：3：2。所述反应的温度为60℃，反应时间为24小时。
上述方法还包括对得到的EQR-TYR进行纯化的步骤，具体如下：将含EQR-TYR的体系冷却至室温(20-25℃)，加入20mL二氯甲烷，并用饱和氯化钠水溶液萃取三次；收集有机相，用无水硫酸钠干燥后，旋蒸除去溶剂；利用柱层析法进行提纯，淋洗液为二氯甲烷/甲醇(100:1,v/v)，最后得到紫色固体产物EQR-TYR。
本发明的再一个目的是提供EQR-TYR的用途。
本发明所提供的EQR-TYR用途选自下述1)-7)中的至少一种：
1)由EQR-TYR制成的荧光探针；
2)EQR-TYR在作为荧光探针或作为检测TYR的荧光探针中的应用；
3)含有EQR-TYR的化学传感器；
4)EQR-TYR在制备化学传感器或制备检测TYR的化学传感器中的应用；
5)EQR-TYR在检测TYR中的应用；
6)上述1)的荧光探针在检测TYR中的应用；
7)上述3)的化学传感器在检测TYR中的应用。
其中，1)所述荧光探针和3)所述化学传感器均可用于TYR的荧光成像或检测TYR。
所述荧光探针或化学传感器应用的对象可为细胞或活的生物体。具体的：可应用于小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞中TYR的荧光成像；也可以应用于小鼠活体中TYR的荧光成像。
本发明发明人通过实验证实：EQR-TYR本身无荧光，但可以选择性的与TYR发生荧光打开反应，生成光学性能优良的体系，且发射波长处于近红外区域(740nm)，较激发波长610nm发生了130nm的斯托克斯位移。上述特征可以大大降低生物体系背景荧光的干扰，提高了对TYR的检测灵敏度和选择性。因此，EQR-TYR适用于对TYR进行高选择性和高灵敏度的检测，该检测可以通过荧光光谱方法进行。
当采用荧光光谱法，以EQR-TYR作为检测试剂对TYR进行检测时，方法检出限为0.035U/mL，说明该传感器分子EQR-TYR对TYR具有很好的响应灵敏度，优于目前已被报道的TYR荧光检测方法的灵敏度。同时，EQR-TYR对TYR的荧光响应具有很好的选择性，常见离子和干扰物种(如K+、Ca2+、Mg2+、Cys、GSH、GLU、Urea、Ascorbic acid、Creatinine、Alkalinephosphatase、BSA、H2O2、·OH、1O2、O2·-、ClO-和ONOO-等)对TYR的测定几乎没有干扰，因此能排除众多干扰离子和物种对检测结果的干扰，检测特异性高。另外，应用EQR-TYR对TYR进行检测时，由于检测灵敏度高，只需要微量的样品即可以完成，拓宽了该方法的应用范围。
附图说明
图1为EQR-TYR的制备流程图。
图2为EQR的核磁共振氢谱。
图3为EQR的核磁共振碳谱。
图4为EQR的高分辨质谱。
图5为EQR-TYR的核磁共振氢谱。
图6为EQR-TYR的核磁共振碳谱。
图7为EQR-TYR的高分辨质谱图。
图8为EQR-TYR与EQR的荧光光谱图(a)；EQR-TYR与TYR(50U/mL)共存体系以及EQR-TYR单独存在的体系在不同pH下的荧光强度变化图(b)；不同温度下EQR-TYR与酪氨酸酶共存体系以及单独EQR-TYR体系的荧光强度变化(c)；EQR-TYR与不同浓度酪氨酸酶共存下的体系响应速度(d)；EQR-TYR与不同浓度TYR共存体系在740nm处荧光强度变化图(e)；EQR-TYR与不同浓度TYR共存体系740nm处的荧光强度与TYR浓度之间的线性关系图(f)。
图9为EQR-TYR对酪氨酸酶检测的选择性(a)；不同浓度曲菌酸对EQR-TYR与TYR(50U/mL)共存体系荧光强度的影响(b)；不同浓度曲菌酸对EQR-TYR和EQR荧光强度的抑制效应(c)。
图10为EQR-TYR的细胞毒性MTT实验结果(a)；EQR-TYR用于B16F10细胞和HeLa细胞成像(b)；EQR-TYR用于小鼠成像实验(c)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、化学传感器分子EQR-TYR的制备
反应流程如图1所示，具体方法如下：
将4.48mL二甲基甲酰胺和20mL二氯甲烷混合后冷却至0℃。在剧烈搅拌下，向体系中逐滴加入5mL的三溴化磷。30分钟后，再向体系中加入4.9mL环己酮。体系室温下(20-25℃)搅拌反应12小时，然后将其倒入30mL纯水中，以碳酸氢钠进行中和。水相以60mL二氯甲烷提取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂后得到黄色油状固体(化合物1，2-溴-1-环己烯-1-甲醛)。化合物1无需提纯，直接用于下一步反应。
取化合物1(0.204g，1.08mmol)，溶于6mL二甲基甲酰胺和4-甲氧基水杨醛(0.137g，0.9mmol)。在剧烈搅拌下，向体系中加入碳酸铯(0.88g，2.7mmol)。体系在室温下(20-25℃)搅拌反应24小时，然后向体系中加入60mL二氯甲烷，并加水洗涤三次(每次20mL)，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，旋蒸除去有机溶剂后得到固体。利用柱层析法进行提纯，以二氯甲烷为淋洗剂，得到亮黄色化合物2(产率63％)。
将4-甲基喹啉(0.48g，3.35mmol)和碘乙烷(0.78g，5mmol)溶于25mL乙腈中，加热至80℃，回流反应12小时。旋蒸除去溶剂后得到的固体，用乙醚超声后抽滤，将过滤所得产物再用乙醚冲洗三次，真空干燥，得到绿色固体化合物3(产率88％)，无需进一步处理，可以直接用于下一步反应。
将化合物2(0.4mmol)和化合物3(0.5mmol)溶解于10mL无水乙酸酐中，加热回流反应12小时。反应完全后，蒸干溶剂，用二氯甲烷重新溶解固体物质，用水洗三次，分液后丢弃水相，将有机相溶剂旋干后得到固体物质。将上述固体物质(0.25mmol)溶解于10mL二氯甲烷中，然后将溶液冷却至0℃。在剧烈搅拌下，向体系中逐滴加入2.5mmoL的三溴化硼。滴加完成后恢复至室温(20-25℃)，搅拌反应12小时。反应结束后，将反应体系倒入冰水中，用饱和碳酸氢钠溶液中和至中性，并用二氯甲烷萃取。利用柱层析法进行提纯，淋洗液为二氯甲烷/甲醇(15:1,v/v)。最后得到紫色固体产物EQR，产率为70％。
取1.0mmol的EQR溶于20mL乙腈中，加入2mmol的碳酸钾。氮气保护下，体系加热至60℃，搅拌反应10分钟。将3mmol 3-羟基苄基溴溶解于2mL乙腈中，并将其缓慢逐滴加入到前述的反应体系中，在60℃下搅拌反应24小时。将体系冷却至室温(20-25℃)，加入20mL二氯甲烷，并用饱和氯化钠水溶液萃取三次。收集有机相，用无水硫酸钠干燥后，旋蒸除去溶剂。利用柱层析法进行提纯，淋洗液为二氯甲烷/甲醇(100:1,v/v)。最后得到紫色固体产物EQR-TYR，产率为42％。
EQR的核磁鉴定结果：1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.44(s,1H),9.04(d,1H),8.79(d,1H),8.48–8.21(m,3H),8.15–8.06(m,1H),7.91–7.81(m,1H),7.27(d,1H),7.13(d,1H),6.84(s,2H),6.64(d,1H),4.87(q,2H),2.67(t,2H),2.56(t,2H),1.76(t,2H),1.53(t,3H)。13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ159.92,154.46,153.62,152.33,145.23,137.56,134.42,128.22,127.70,127.08,126.24,125.89,125.82,118.58,114.05,113.69,113.54,112.20,112.02,102.09,89.79,50.92,28.75,24.28,20.36,15.03。核磁氢谱和碳谱分别见图2和图3。仪器型号：Varian Mercury 300BB NMR System(300M)。EQR的高分辨质谱鉴定结果：m/z382.1804[C26H24NO2]+(calcd.382.1802)，结果见图4。上述结果表明，所得化合物确为目标化合物EQR。
EQR-TYR的核磁鉴定结果：1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.41(s,1H),9.04(d,1H),8.81(d,1H),8.45(d,1H),8.34(d,2H),7.87(t,1H),7.30(d,1H),7.15(d,1H),6.92–6.84(m,3H),6.77–6.71(m,3H),6.64(d,1H),4.88(q,2H),3.74(s,2H),2.70(t,2H),2.57(t,2H),1.78(t,2H),1.53(t,3H).13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ159.89,154.48,153.62,152.45,147.63,146.61,145.24,137.69,137.57,134.36,128.19,127.67,126.98,126.18,125.89,120.85,119.05,118.49,115.58,114.06,113.71,113.59,112.55,112.19,112.00,102.15,55.61,50.98,28.71,24.29,20.35,14.91。核磁氢谱和碳谱分别见图5和图6。仪器型号：Varian Mercury 300BB NMR System(300M)。EQR-TYR的高分辨质谱鉴定结果：MS:m/z488.2208[C33H30NO3]+(calcd.488.2220)。结果见图7。上述结果表明，所得化合物确为目标化合物EQR-TYR。
实施例2、EQR-TYR作为分析试剂对TYR进行荧光检测
1、EQR-TYR对TYR进行荧光检测的灵敏度
在5mL塑料EP管中，适量TYR溶于3mL的0.1M PBS缓冲溶液(pH 7.4)中，然后添加20μL试剂—EQR-TYR的二甲基亚砜(DMSO)溶液(浓度1.0mM)，添加适当体积的0.1M PBS缓冲溶液(pH 7.4)，使各测试体系中的TYR浓度分别为0、1.0、5.0、10、20、30、40和50U/mL，EQR-TYR的浓度为5μM。在37℃下保持1小时后转移体系至1cm石英池中，测定反应体系的荧光光谱。
图8(a)为EQR-TYR对TYR的荧光响应图。体系的激发波长和发射波长分别为610nm和740nm。从图8(a)中可以看出：EQR-TYR本身并无荧光，当体系中加入TYR后，体系的荧光强度明显升高，说明EQR-TYR对TYR具有较好的荧光响应。图8(b)和图8(c)分别为EQR-TYR与TYR(50U/mL)共存体系以及EQR-TYR单独存在的体系在不同pH下和不同温度下的荧光强度变化图。从图8(b)和图(c)可以看出：当pH处于4.0～10.0范围和温度处于20℃～45℃时，EQR-TYR几乎无荧光，且其荧光强度不随着pH和温度的变化而变化。当TYR存在条件下，体系的荧光强度在pH＝7.4和温度为37℃时有明显的升高，说明EQR-TYR适用于生理条件下对TYR的荧光识别。图8(d)为EQR-TYR与TYR共存体系的荧光动力学研究结果。不同TYR浓度下(5U/mL、20U/mL、30U/mL和50U/mL)，EQR-TYR与TYR共存体系的荧光强度在1小时之内随着时间的延长而增强，而1小时之后，体系的荧光强度达到最大值且几乎保持不变。上述事实说明，利用EQR-TYR对TYR的荧光检测的最佳反应时间为1小时。
图8(e)和图8(f)为EQR-TYR与不同浓度TYR的共存体系在740nm处荧光强度变化图和EQR-TYR与不同浓度TYR共存体系在740nm处的荧光强度与TYR浓度之间的线性关系图。如图8(e)所示，随着TYR浓度的提高，反应体系的荧光强度逐渐增加。图8(f)可以看出：在1.0～50U/mL的范围内，TYR浓度与体系的荧光强度呈线性关系，线性方程为ΔF＝33.35C(U/mL)+43.82，方法的检出限以3倍的空白信号的标准偏差除以标准曲线的斜率计算为0.035U/mL。以上结果表明，分析试剂—EQR-TYR具有优良的性能，能够实现对TYR的高灵敏度荧光检测。
2、EQR-TYR对TYR进行荧光检测的特异性
同时取若干个EP管，进行上面类似的操作，只是将加入TYR变成加入各种常见干扰离子或物质，1-19号对应的样品为：Blank、K+(100mM)、Ca2+(2.5mM)、Mg2+(2.5mM)、Cys(1.0mM)、GSH(1.0mM)、GLU(10mM)、Urea(10mM)、Ascorbic acid(1.0mM)、Creatinine(10mM)、Alkaline phosphatase(20U/L)、BSA(100mM)，H2O2、·OH、1O2、O2·-和ClO-(浓度皆为100μM)、ONOO-(10μM)和TYR(50U/mL)，测试结果见图9(a)。从图9(a)中可以看出：1-18号样品未产生明显的荧光响应，而50U/mL TYR(19号样品)的加入则产生强烈的荧光。上述现象说明：上述干扰离子不会影响EQR-TYR作为分析试剂对TYR进行荧光检测，且作为检测试剂，EQR-TYR对TYR的荧光检测具有高的选择性。
3、曲菌酸对EQR-TYR与TYR共存体系荧光强度的抑制效应
图9(b)和图9(c)分别给出了不同浓度曲菌酸对EQR-TYR(5μM)与TYR(50U/mL)共存体系荧光强度的影响和不同浓度曲菌酸对EQR-TYR和EQR荧光强度的抑制效应。图9(b)结果显示：EQR-TYR本身几乎没有荧光，EQR-TYR与TYR共存时，体系具有较强的荧光强度。当向EQR-TYR与TYR共存体系加入100μM的曲菌酸时，体系的荧光强度减弱大约80％；继续加大曲菌酸的浓度至150μM时，体系的荧光强度大约减弱95％。另外，图9(c)显示：曲菌酸在0～200μM的浓度范围内对EQR-TYR和EQR的荧光强度几乎没有任何影响。上述结果说明：曲菌酸可以有效抑制TYR的活性。
4、EQR-TYR与其他相关TYR化学传感器的性能对比
将EQR-TYR对TYR的荧光检测性能与文献中检测TYR的相关化学传感器的性能进行总结和对比，结果见表1。从表1中可以看出，EQR-TYR对TYR的荧光检测响应速度较快。重要的是，利用EQR-TYR对TYR进行检测时，具有较大的斯托克斯位移(130nm)，能够有效降低背景荧光的干扰，从而提高检测灵敏度，该方法的检出限达到0.035U/mL，优于已报道的化学传感器。
表1 EQR-TYR与文献中TYR化学传感器的性能对比
Figure BDA0003288750680000081
参考文献：
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实施例3、EQR-TYR作为试剂对细胞和小鼠样品中TYR的荧光成像研究
开展EQR-TYR的细胞毒性MTT实验。细胞以不同浓度的EQR-TYR(0～50μM)处理后培养24小时进行MTT实验，结果见图10(a)。从图10(a)中可以看出细胞的存活率大于80％，说明EQR-TYR的细胞毒性较低，可以应用于细胞成像研究。
以小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞和正常细胞Hela细胞为研究对象，验证EQR-TYR作为荧光成像试剂的可行性。B16F10细胞及Hela细胞培养及成像：37℃下，无菌培养皿中的B16F10细胞及Hela细胞在含有10％的胚胎血清的DMEM培养基中培养24h，期间维持5％的CO2培养氛围；B16F10细胞及Hela细胞转移至6孔培养板，过夜；以HEPES缓冲溶液(pH 7.4)清洗后，添加一定体积的EQR-TYR溶液，保证EQR-TYR最终浓度为5μM，培育1小时，再次以HEPES缓冲溶液(pH 7.4)冲洗，进行激光共聚焦显微成像；向B16F10细胞添加曲菌酸溶液，使体系中曲菌酸浓度为1.0mM并继续培养1小时后，以HEPES缓冲溶液(pH＝7.4)冲洗，进行激光共聚焦显微成像，结果见图10(b)。从图10(b)可以看出：当以EQR-TYR培育B16F10细胞1小时后，细胞中呈现出明显的红色，而当继续添加曲菌酸进行培育后，细胞中的荧光强度，相比仅仅用EQR-TYR培育时的荧光强度，有明显的减弱。Hela细胞作为对照组，经过EQR-TYR的培育后，细胞中并未产生明显的荧光。上述实验结果证明：EQR-TYR可以作为试剂实现对B16F10细胞的荧光成像。小鼠培养及成像：分别将正常的Hela细胞和黑色素瘤细胞B16F10细胞注射进实验小鼠的左侧和右侧。五天后，EQR-TYR溶液通过静脉注射到小鼠体内，一小时后，观察荧光成像效果。图10(c)给出了小鼠中TYR的荧光成像结果。从图10(c)中我们可以看出：当EQR-TYR注射如小鼠体内后，在小鼠身体的右侧注射了黑色素瘤细胞B16F10的地方，产生了明显的红色荧光，而在小鼠身体的左侧注射了正常的Hela细胞的地方的荧光强度非常弱。上述现象说明：EQR-TYR可以应用于生物体中TYR的荧光成像，在提高对生物体中TYR产生机理的研究水平以及促进TYR相关疾病的预诊断和精确治疗上具有较好的应用前景。

Claims (12)

1.式I所示的化合物：
Figure FDA0003584303900000011
2.权利要求1中所述式I所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
1)将环己酮和三溴化磷进行反应合成化合物1；
2)将化合物1与4-甲氧基水杨醛反应生成化合物2；
3)将4-甲基喹啉与碘乙烷反应生成化合物3；
4)将化合物2和化合物3在无水乙酸酐中进行反应，得到固体物质，再将所述固体物质在三溴化硼的作用下生成式II所示的EQR；
5)将EQR与3-羟基苄基溴进行反应，得到式I所示的EQR-TYR；
Figure FDA0003584303900000012
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤1)中，所述环己酮和三溴化磷进行反应为：将环己酮添加到三溴化磷、二甲基甲酰胺和二氯甲烷共存的混合溶液中，所述混合溶液温度为0℃，然后升温反应；所述反应中，环己酮和三溴化磷的摩尔比为1：1.1；所述二甲基甲酰胺和二氯甲烷的体积比0.224：1；所述反应的反应温度为20-25℃，反应时间为12小时；
所述步骤2)中，所述化合物1和4-甲氧基水杨醛在碳酸铯的存在下进行反应，具体为：将化合物1，溶于二甲基甲酰胺和4-甲氧基水杨醛，然后向体系中加入碳酸铯；所述反应中，化合物1、4-甲氧基水杨醛和碳酸铯的摩尔比为1.2：1：3；所述反应的反应温度为室温，反应时间为24小时；
所述步骤3)中，所述4-甲基喹啉和碘乙烷的反应在乙腈中进行；所述反应中，4-甲基喹啉和碘乙烷的摩尔比为1：1.5；所述反应的反应温度为80℃，反应时间为12小时；
所述步骤4)中，具体操作步骤为：首先将化合物2和化合物3溶于无水乙酸酐进行第一步反应得到中间产物，然后在剧烈搅拌条件下，将三溴化硼逐滴加入到中间产物的二氯甲烷溶液中，升温至室温进行第二步反应，从而得到EQR；所述第一步反应中，化合物2和化合物3的摩尔比为1：1.25，所述反应的反应温度为140℃，反应时间为12小时；所述第二步反应中，中间产物与三溴化硼的摩尔比为1：10，所述反应的反应温度为室温，反应时间为12小时；
所述步骤5)中，所述EQR和3-羟基苄基溴的反应在氮气保护下进行；所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为乙腈；所述反应具体操作如下：将3-羟基苄基溴的乙腈溶液逐滴缓慢加入到EQR和碳酸钾共存的乙腈溶液中进行反应；所述反应中，EQR、3-羟基苄基溴和碳酸钾的摩尔比为1：3：2；所述反应的温度为60℃，反应时间为24小时。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：所述方法还包括对得到的EQR-TYR进行纯化的步骤，具体如下：将含EQR-TYR的体系冷却至室温，加入二氯甲烷，并用饱和氯化钠水溶液萃取三次；收集有机相，用无水硫酸钠干燥后，旋蒸除去溶剂；利用柱层析法进行提纯，淋洗液为二氯甲烷和甲醇体积比为100:1的混合液，最后得到紫色固体产物EQR-TYR。
5.荧光探针，其特征在于：所述荧光探针为权利要求1所述的化合物。
6.化学传感器，其特征在于：所述化学传感器含有权利要求1所述的化合物。
7.根据权利要求5所述的荧光探针或根据权利要求6所述的化学传感器，其特征在于：所述荧光探针或所述化学传感器用于检测TYR或TYR的荧光成像。
8.权利要求1所述的化合物作为荧光探针的应用。
9.权利要求1所述的化合物作为检测TYR的荧光探针的应用。
10.权利要求1所述的化合物在制备化学传感器中的应用。
11.权利要求1所述的化合物在制备检测TYR的化学传感器中的应用。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的应用，其特征在于：所述荧光探针或化学传感器应用的对象为细胞或活的生物体。
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