CN113045596B - 一种过氧亚硝基阴离子和粘度双响应型荧光探针及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开一种过氧亚硝基阴离子和粘度双响应型荧光探针及其制备和应用，双响应型荧光探针结构式如式I所示：
本申请提供的双响应型荧光探针的制备方法简单，只需要简短的反应路线即可得到。本申请的探针自身的荧光微弱可在不同激发/发射通道下分别检测溶液和细胞环境中的ONOO‑和粘度，可用于制备ONOO‑浓度和粘度检测试剂。该探针检测效果良好，抗干扰能力强，为研究ONOO‑和粘度的生物关联性提供了一种新型的潜在有力分析工具。
Description
技术领域
本申请涉及荧光探针检测技术领域，具体涉及一种过氧亚硝基阴离子和粘度双响应型荧光探针及其制备和应用。
背景技术
新型高效的荧光探针检测技术有助于人们更加深入了解诸多生理和病理的发生机制，已被广泛应用于生命健康领域。然而，目前已开发的荧光探针大多是单响应型荧光探针，即只能在单一荧光通道下实现特异性识别单一分析物，无法满足研究多种分析物在生物体内的生物关联性的需求。因此，常规的单响应型荧光探针具有一定的局限性。双响应型荧光探针，不同于单响应型荧光探针，可在不同荧光通道下可分别检测两个不同的分析物，是研究多分析物在生物体内的生物关联性的有力工具之一。
发明内容
本申请提供一种荧光探针，可在不同荧光通道下分别检测ONOO-和粘度，解决单响应型荧光探针的缺陷。
过氧亚硝基阴离子ONOO-由于其高化学反应能力，是活性氧簇中的最有害的小分子。众多研究表明，ONOO-可以破坏各类生物大分子，如蛋白质、脂类和核酸等。细胞内环境粘度是细胞正常活动的重要指标，对细胞内生物分子间的扩散、化学信号的传递起着至关重要的作用。为了进一步了解ONOO-和粘度的生物学作用，大量能够特异性检测ONOO-或粘度的单响应型荧光探针被报道，然而，能够分别检测ONOO-和粘度的双响应型荧光探针仍十分稀缺。
本申请提供的双响应型荧光探针的制备方法简单，只需要简短的反应路线即可得到。本申请的探针自身的荧光微弱可在不同激发/发射通道下分别检测缓冲液和细胞环境中的ONOO-和粘度，属于荧光探针检测技术领域。从实验数据可知，该探针在发射波长为570nm处对粘度具有响应能力，在发射波长为640nm处对ONOO-具有响应能力。该探针检测效果良好，抗干扰能力强，可为研究ONOO-和粘度的生物关联性提供了一种新型的潜在有力分析工具。
一种双响应型荧光探针，具有如式(I)所示的结构式：
本申请还提供一种所述荧光探针的制备方法，包括：
惰性气体保护下，将化合物2、化合物3和甲醇钠加入到溶剂中反应，反应液通过分离纯化后得所述荧光探针；
可选的，所述化合物2、化合物3和甲醇钠的物质的量之比为1:1.2～2:0.2～0.5；进一步为1:1.5:0.3。
化合物2为公开的化合物，其制备方法可参考文献(Wu Y Y,Yu W T,Hou T C,etal.A selective and sensitive fluorescent albumin probe for the determinationof urinary albumin[J].Chemical Communications,2014,50(78):11507-11480.)，化合物3为市购获得。
可选的，所述溶剂为乙腈。
可选的，反应条件为：40℃～50℃搅拌反应10h～14h。
可选的，所述分离纯化方法如下：将所得的反应液通过减压浓缩除去溶剂，粗产物以乙酸乙酯/石油醚(v/v，1:5)混合液为展开剂，利用柱层析法进行纯化，得到目标双响应型荧光探针。
本申请还提供一种如所述的双响应型荧光探针在制备检测ONOO-和/或粘度试剂中的应用。
可选的，所述ONOO-为细胞中ONOO-或溶液中ONOO-；所述粘度为细胞中粘度或溶液中粘度。
可选的，所述细胞为人宫颈癌细胞Hela细胞。
应用于溶液ONOO-检测时，可对溶液中ONOO-浓度进行定量检测，检测方法包括：
将所述荧光探针加入待测溶液中，反应一段时间后，在激发波长为490nm、发射波长为640nm处采集缓冲液的荧光强度，根据标准曲线计算得到待测溶液的ONOO-浓度。
可选的，荧光探针在待测溶液中的加入量以荧光探针的摩尔量与溶液中ONOO-浓度比计为：0.005mM荧光探针：0～0.1mM ONOO-。
可选的，标准曲线的制备如下：
将0.005mM荧光探针分别与ONOO-浓度为0～0.1mM的缓冲液中反应，激发波长为490nm、发射波长为640nm处采集缓冲液的荧光强度，以荧光强度为纵坐标、ONOO-浓度为横坐标，绘制即得线性标准曲线。
可选的，检测溶液ONOO-时，溶液的pH值为7.4。
本申请的荧光探针，还具有粘度响应特性，可用于制备粘度检测试剂中，应用于检测溶液粘度值时，可定量检测溶液的粘度值，方法包括：
将所述荧光探针加入待测溶液中，经混匀、超声、静置后，在激发波长为410nm，发射波长为570nm处采集溶液的荧光强度，根据标准曲线计算得到待测溶液的粘度值。
可选的，双响应型荧光探针在待测溶液中的加入量以荧光探针的摩尔量与溶液中粘度比计为：0.005mM荧光探针：粘度100～950CP。
可选的，标准曲线的制备如下：
将0.005mM荧光探针分别与粘度在100～950CP内的溶液反应，激发波长为410nm、发射波长为570nm下采集反应液的荧光强度，以ln(荧光强度)为纵坐标、log(溶液粘度)为横坐标，绘制即得线性标准曲线。
可选的，检测粘度时，溶液的pH值为7.4。
本申请的荧光探针还可用于非诊断目的的细胞中ONOO-浓度变化及粘度变化检测。在激发波长为488nm、发射接收波长范围为620～720nm可检测ONOO-浓度变化；在激发波长为405nm、发射接收波长范围为520～620nm可检测粘度值变化。
本申请的荧光探针的双响应荧光检测机理如下：
ONOO-可与硼酯发生特异性反应，释放出羟基裸露的近红外荧光团；溶液粘度的增加限制结构碳碳单键的旋转，减少探针的非辐射能量，释放出发射波长为荧光。
与现有技术相比，本申请至少具有如下有益效果之一：
(1)本申请提供的双响应型荧光探针的结构新颖，合成简单，并适合大量生产。
(2)本申请提供的双响应型荧光探针能在不同荧光通道下分别检测溶液中ONOO-浓度和粘度，两个荧光通道的波长相差较远，不会产生互相干扰，为进一步研究生物体内ONOO-和粘度的生理关联性。
(3)本申请提供的双响应型荧光探针可实现ONOO-和粘度的定量检测。
附图说明
图1为实施例1制备的探针(I)的核磁氢谱。
图2为实施例1制备的探针(I)的核磁碳谱。
图3为实施例1制备的探针(I)对不同ONOO-浓度的溶液的荧光发射光谱图(a)及640nm处荧光强度的拟合曲线(b)。
图4为实施例1制备的探针(I)对不同粘度值的溶液的荧光发射光谱图(a)及570nm处荧光强度的拟合曲线(b)。
图5为实施例1制备的探针(I)用于Hela细胞中ONOO-浓度检测的荧光成像图。
图6为实施例1制备的探针(I)用于Hela细胞中粘度值检测的荧光成像图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
实施例1：探针(I)的制备
在氮气环境中，将化合物2、化合物3和甲醇钠加入到乙腈溶剂中，化合物2、化合物3和甲醇钠物质的量之比为1:1.5:0.3，其中化合物2为1mmol，乙腈的用量10mL，在45℃搅拌反应12h，将反应物减压浓缩，通过使用乙酸乙酯/石油醚(v/v，1:5)的二氧化硅柱层析进行纯化，即得探针(I)(收率27％)，其核磁氢谱参见图1，核磁碳谱参见图2。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.39(d,J＝5.0Hz,1H),7.24–7.20(m,2H),7.08(dd,J＝5.0,3.7Hz,1H),6.82(d,J＝2.6Hz,1H),2.61(s,2H),2.44(s,2H),1.27(s,12H),1.09(s,6H).
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ168.99,153.48,141.53,129.81,128.50,128.30,128.07,123.16,113.57,112.81,42.95,39.12,32.02,29.71,28.01.
实施例2：探针(I)对不同ONOO-浓度的溶液的荧光发射性能测试。
准确称取一定量的探针(I)(实施例1制备)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，用移液枪吸取2.5μL加入到0.5mL PBS缓冲液(10mM,pH 7.4),分别加入5μL不同浓度ONOO-水溶液，在37℃下反应10分钟后，在激发波长为490nm处，测定探针的荧光值，统计数据，并考察荧光值与ONOO-浓度两者的线性关系。
不同发射波长下的荧光图谱见图3中(a)。数据表明，在激发波长为490nm处，随着缓冲液中ONOO-浓度的升高，探针(I)的荧光强度逐渐增加。同时，将发射波长为640nm处的荧光值为纵坐标，ONOO-浓度为横坐标做线性关系图可以发现(图3中(b))，两者具有很好的线性关系(R2＝0.99)，证明了探针在缓冲液中ONOO-浓度为0～100μM之间具有定量检测的效果。
实施例3：探针(I)对不同粘度值的溶液的荧光发射性能测试。
准确称取一定量的探针(I)(实施例1制备)，用二甲基亚砜配制成浓度为1mM的探针母液，移液枪吸取20μL加入到4mL不同粘度值的PBS-甘油混合液(pH 7.4)，经过混匀、超声、静置后，加入到荧光比色皿中，在激发波长为410nm处，测定探针的荧光值，统计数据，并考察荧光值与粘度值两者的换算关系。
不同发射波长下的荧光图谱见图4中(a)。数据表明，随着缓冲液粘度的增加，在激发波长为410nm处，随着混合液浓度的升高，探针(I)的荧光强度逐渐增加。同时，在发射波长为570nm处，将log(荧光值)为纵坐标，log(粘度)为横坐标做线性关系图(图4中(0b))可以发现，两者具有很好的线性关系(R2＝0.99)，证明了探针在缓冲液中粘度为100～950CP之间具有良好的定量检测效果。
实施例4:本申请中的探针(I)在细胞中pH检测的应用。
准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mM的母液，利用移液枪取2μL探针母液加入到1.998mL DMEM培养基中，取1.5mL加入到Hela细胞中，37℃下孵化0.5h，用新鲜培养基洗涤两次，并替换成含有不同ONOO-浓度(0、50μM)培养基孵化0.5h，用1mL PBS缓冲液洗涤两次，最终用奥林巴斯Fluoview FV 1200共聚焦显微镜进行荧光成像。图5为细胞共聚焦荧光成像效果图：激发波长为488nm，发射接收波长范围为620～720nm。
细胞共聚焦荧光成像效果见图5。实验结果表明，在ONOO-浓度提高的情况下，细胞内的荧光强度也增大，说明探针(I)可以检测细胞内ONOO-浓度的变化。
实施例5:本申请中的探针(I)在细胞中粘度检测的应用。
准确称取一定量的探针(I)，用二甲基亚砜配制成浓度为10mM的母液，移液枪吸取2μL加入到1.998mL DMEM培养基中。空白组：取1mL含有探针(I)的培养液加入到Hela细胞中，37℃下孵化0.5h，用PBS洗涤两次，实验组：用商品化的制霉菌素(Nystatin)，37℃下孵化20min，PBS洗涤两次，然后取1mL含有探针(I)的培养液加入到Hela细胞中，用PBS洗涤两次，最终用奥林巴斯Fluoview FV 1200共聚焦显微镜进行细胞成像。共聚焦显微镜的激发波长为405nm，发射接收波长范围为520～620nm。
细胞共聚焦荧光成像效果见图6。实验结果表明，在加入制霉菌素改变细胞内粘度之后，细胞内的荧光强度增大，表明探针(I)可以检测Hela细胞内粘度的变化。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种双响应型荧光探针，其特征在于，具有如式(I)所示的结构式：
2.如权利要求1所述的双响应型荧光探针的制备方法，其特征在于，包括：
惰性气体保护下，将化合物2、化合物3和甲醇钠加入到溶剂中反应，反应液通过分离纯化后得所述双响应型荧光探针；
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物2、化合物3和甲醇钠的物质的量之比为1:1.2～2:0.2～0.5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为乙腈。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，反应条件为：40℃～50℃搅拌反应10h～14h。
6.如权利要求1所述的双响应型荧光探针在制备检测ONOO-和粘度试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述ONOO-为细胞中ONOO-或溶液中ONOO-；所述粘度为细胞中粘度或溶液中粘度。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述细胞为人宫颈癌细胞Hela细胞。
9.一种非诊断目的的ONOO-浓度和粘度定量检测方法，其特征在于，包括：
将如权利要求1所述双响应型荧光探针加入待测溶液中，反应一段时间后，在激发波长为490nm、发射波长为640nm处采集缓冲液的荧光强度，根据标准曲线计算得到待测溶液的ONOO-浓度；
和
在激发波长为410nm、发射波长为570nm处采集溶液的荧光强度，根据标准曲线计算得到待测溶液的粘度值；
检测ONOO-浓度时：荧光探针在待测溶液中的加入量以荧光探针的摩尔量与溶液中ONOO-浓度比计为：0.005mM荧光探针：0～0.1mM ONOO-；检测粘度时，所述荧光探针在待测溶液中的加入量以荧光探针的摩尔量与溶液中粘度比计为：0.005mM荧光探针：100～950CP。
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