CN109942609A

CN109942609A - 一种过氧亚硝酸盐近红外荧光探针onp及其制备方法和应用

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Publication number: CN109942609A
Application number: CN201910213199.9A
Authority: CN
Inventors: 钱勇; 邵晨雯; 胡炯圣; 刘红科
Original assignee: Nanjing Normal University
Current assignee: Nanjing Normal University
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2019-06-28
Anticipated expiration: 2039-03-20
Also published as: CN109942609B

Abstract

本发明公开了一种过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP及其制备方法和应用，该近红外荧光探针ONP，由硼酸酯结合亚甲蓝骨架获得，其结构如结构式I所示：本发明的近红外荧光探针ONP，可以有效地示踪KA诱导的癫痫疾病中的内源性ONOO^‑信号，该探针ONP能够在体外和体内有效且选择性地成像ONOO^‑，可以有效地穿过血脑屏障(BBB)具有靶向脑部特征，利用该探针的特性，首次在体内和体外直接观察到在KA诱导的癫痫期间ONOO^‑的上调。此外，本发明首次公开了通过将高内涵分析与ONP相结合，可以筛选抗癫痫抑制剂，这将为研究生物系统中的ONOO^‑和筛选抗癫痫药物提供一种简单有效的产品和方法。

Description

一种过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，涉及一种过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP及其制备方法和应用，尤其是针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP的设计合成及其在癫痫中的示踪成像。

背景技术

癫痫是一种慢性神经退行性疾病，其特征是反复发作和不可预测的惊厥，影响全世界约0.7％的人。尽管过去二十年来抗癫痫药物越来越多，但超过30％的患者在医学上难以治疗或对其没有有效反应。现有的开发用于抗癫痫的这些药物仅提供基本的对症治疗，尚未成功解决药物抗性问题和预防癫痫以及治疗癫痫发生后的持续状态。越来越多的证据表明，癫痫与氧化应激密切相关，并且氧化应激介导的神经疾病中的许多神经病理过程可以在癫痫疾病的大脑中清楚地观察到氧/氮物种(ROS/RNS)水平的显着增加。从这个意义上讲，氧化应激因素，如反应性ROS/RNS，应该被考虑到进一步的抗癫痫治疗策略的研究中。因此，更好地理解生物体内癫痫的动态神经化学过程将有利于早期诊断和预防以及寻找新的治疗方法。

癫痫发作引起的脑损伤是一个复杂的动态过程，与兴奋性毒性引起的线粒体功能障碍，细胞因子水平改变和氧化应激有关。在癫痫的发生和发展过程中，由于ROS的增加和抗氧化防御能力下降，不断产生大量的ROS，特别是在病理条件下，过量的ROS进一步与一氧化氮(NO)反应生成活性氮物质(RNS)，如过氧亚硝酸盐(ONOO^-)。随后，这些产生的ROS/RNS可以通过与许多生物大分子(包括蛋白质，核酸和脂质)反应诱导氧化应激的积累，这可以进一步导致神经元细胞死亡。作为活性氮物种的代表，过氧亚硝酸盐(ONOO^-)被认为是一种重要的神经毒性因子，在癫痫和其他神经退行性疾病的发病机制中发挥重要作用。实际上，在包括癫痫，阿尔茨海默氏症，帕金森病在内的多种临床疾病的进展中发现了过表达的反应性ONOO^-。过度表达的ONOO^-一直确定是这些疾病的标志性特征，可以作为早期预测癫痫的潜在生物标志物。然而，ONOO^-在癫痫发生和发生过度的机制中的潜在生物学作用还尚未完全清晰。因此，为了探索体内ONOO^-的病理生理机制并研究其在癫痫中的作用，开发用于监测脑中ONOO^-的有效成像工具是至关重要的。

在研究生物体系中的生物物种时，荧光成像与基于反应的传感探针相结合，因其高灵敏度，高选择性，实时性和非侵入性而备受关注。虽然已经报道了许多荧光探针用于细胞或组织的ONOO^-成像，但仍然缺乏用于脑中ONOO^-测定的体内成像方法，包括癫痫疾病状态下的脑成像。此外，可用于构建筛选平台以快速筛选抗癫痫药的成像探针也不足。为了实现这些目的，存在若干挑战：(1)开发探针的主要挑战是探针是否能够有效地穿过血脑屏障(BBB)以实现脑区域的成像；(2)具有近红外激发和发射的探针优利于获得更深的组织穿透，更少的光损伤和更少的背景荧光干扰；(3)在真实生理环境中有效监测ONOO^-需要高选择性和灵敏度的探针。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种针对过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP，该近红外荧光探针ONP能够在体外和体内有效且选择性地成像ONOO^-，可以有效地穿过血脑屏障(BBB)具有靶向脑部特征，可以有效地示踪KA诱导的癫痫疾病中的内源性ONOO^-信号，首次在体内和体外直接观察到在KA诱导的癫痫期间ONOO^-的上调。另外，将高内涵分析与ONP相结合，可以为研究生物系统中的ONOO^-和筛选抗癫痫药物提供一种高通量筛选方法，简单有效筛选出抗癫痫药物的抑制剂。

本发明提供一种针对过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP的制备方法和应用。即本发明的针对过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP可以简单高效的示踪KA诱导的癫痫疾病中的内源性ONOO-信号，同时亦可以应用在高通量筛选抗癫痫抑制剂中。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP，由硼酸酯结合亚甲蓝骨架获得，其结构如结构式I所示：

结构式I的中文名为4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基3,7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪-10-羧酸酯。

本发明所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP的制备方法，包括如下步骤：

在惰性气体保护下，在容器中加入亚甲基蓝、DCM和水，搅拌均匀，将Na₂S₂O₄和NaHCO₃缓慢加入到上述混合液中，然后将混合物搅拌；萃取水层，分离有机层；合并有机相，干燥；在惰性气体保护下，将干燥的有机相快速倒入含有三乙胺的容器中，将含有三光气的DCM缓慢加入到反应混合物中搅拌，加入4-羟基甲基苯基硼酸和三乙胺搅拌后，蒸发除去溶剂得到粗产物，纯化重结晶后得到产物，为黄色固体即近红外荧光探针ONP；

其反应式如下所示：

其中，所述将Na₂S₂O₄和NaHCO₃缓慢加入到上述混合液中，然后将混合物搅拌直至水相变为黄色。

其中，所述加入4-羟基甲基苯基硼酸和三乙胺搅拌过夜后蒸发除去溶剂得到粗产物。

其中，所述纯化重结晶后得到产物为粗产物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤，通过快速柱色谱纯化粗产物，并从乙腈中重结晶，得到产物，为黄色固体。

本发明所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP在筛选针对过氧亚硝酸盐的诱导物和抑制剂中的应用。

其中，所述应用包括近红外荧光探针ONP在活细胞中可视化示踪过氧亚硝酸盐的动态变化。

本发明所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP在筛选抗癫痫抑制剂中的应用。

其中，所述应用包括近红外荧光探针ONP可以对活体癫痫小鼠内源性过氧亚硝酸盐水平变化进行成像。

本发明所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP在制备筛选抗癫痫抑制剂的成像剂中的应用。

荧光探针ONP的设计原理：为了监测体内ONOO^-活性，选择合适的荧光团是成功设计理想荧光探针的关键组成部分，以用于复杂的生物学背景。亚甲基蓝(MB)具有优异的药代动力学和光物理特性被我们所关注。它已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于临床治疗，包括抗抑郁药，解毒剂，抗疟药和高铁血红蛋白血症治疗等。此外，MB已被用作体内成像研究的理想成像剂，因为它具有在NIR区域(>640nm)的吸收和发射，可显着降低自发荧光的干扰。特别是，将MB还原为无色亚甲蓝(LMB)会破坏MB荧光团骨架中的π-共轭，从而完全消除吸收和荧光。因此本发明设计基于破坏MB支架可构建用于感测特定分析物ONOO^-的红色荧光的探针，硼酸酯(用作ONOO^-的选择性响应部分)被结合在还原的MB支架中得到了最终的荧光探针ONP。由于荧光团的π-共轭体系的阻断，这种游离探针将表现出非常弱的吸收和发射。当ONP被ONOO^-攻击时，硼酸酯部分将很容易被去除，并且新形成相应的LMB，其将被进一步氧化成MB，导致在NIR成像窗口(>690nm)中恢复强荧光，这对于体内深部组织成像至关重要(图1A)。探针结合ONOO^-前后显著变化可用于细胞内ONOO^-微弱变化的监测，并可为全脑的NIR荧光成像提供动态信息。

本发明开发了一种新的近红外(NIR)荧光探针，可以有效地示踪KA(红藻氨酸)诱导的癫痫疾病中的内源性ONOO^-信号，该探针ONP基于亚甲蓝的近红外荧光团设计，能够在体外和体内有效且选择性地成像ONOO^-。特别是，它可以有效地穿过血脑屏障(BBB)具有靶向脑部特征。利用该探针的特性，首次在体内和体外直接观察到在KA诱导的癫痫期间ONOO^-的上调，ONP可以成为一种为成像剂，特异性的识别ONOO^-后，ONP结构中的硼酸酯被释放，最终氧化成亚甲蓝，恢复荧光，通过成像(荧光的强弱)来筛选抑制剂。此外，本发明首次公开了通过将高内涵分析与ONP相结合，构建了抗癫痫抑制剂的高通量筛选方法，这将为研究生物系统中的ONOO^-和筛选抗癫痫药物提供一种简单有效的方法。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明制备的针对过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP对ONOO^-具有特别专一的选择性，检测限达到94nM，灵敏度高，荧光强度和ONOO^-浓度线性关系极佳，反应迅速，在15分钟反应完全，有助于快速监测ONOO^-的存在及浓度，生理pH下稳定性非常好，另外ONP探针本身只有非常弱的吸收和发射，识别到ONOO^-时生成MB，在近红外成像窗口(>690nm)中恢复强荧光，可显着降低生物体本身自发荧光的干扰，光损伤较少，并且对于体内深部组织成像至关重要，最后探针可以通过血脑屏障(BBB)具有靶向脑部特征。

本发明针对过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP的制备合成方法，合成路线新颖，简单易行，成本较低，原料利用率高适合于工业化生产；本发明制备的针对过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP可以有效地检测细胞内外源的ONOO^-的存在，示踪KA诱导的癫痫疾病中的内源性ONOO^-信号，首次在体内和体外直接观察到在KA诱导的癫痫期间ONOO^-的上调。本发明的针对过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP可以应用在在制备筛选抗癫痫抑制剂的成像剂中，另外，将高内涵分析与ONP相结合，可以为研究生物系统中的ONOO^-和筛选抗癫痫药物提供一种高通量筛选产品和方法，简单有效筛选出抗癫痫药物的抑制剂。

附图说明

图1A为本发明所列ONP对ONOO^-响应机制，ONP与ONOO^-结合促进了MB的形成示意图；

图1B为本发明所列ONP与ONOO^-响应前后的紫外吸收光谱图；

图1C为本发明所列ONP与ONOO^-响应前后的激发和发射光谱图，MB为标准参照；

图1D为本发明所列ONP与ONOO^-相应不同时间的HPLC分析示意图；

图1E为本发明所列ONP与不同浓度ONOO^-响应后的HPLC分析示意图；

图2为本发明所列ONP与ONOO^-在不同的PH下响应前后荧光光谱强度变化示意图；

图3A为本发明所列ONP与ONOO^-响应不同时间的荧光光谱强度变化示意图；

图3B为本发明所列ONP与不同浓度ONOO^-响应后的荧光光谱强度变化示意图；

图3C为本发明所列ONP与ONOO^-及其他小分子化合物响应后的荧光光谱强度变化示意图；

图4为本发明所列ONP与不同ONOO^-浓度(0-4μM)之间的荧光发射强度的线性相关性示意图；

图5为本发明所列ONP与ONOO^-响应不同时间的紫外吸收光谱图；

图6A为本发明所列ONP与不同浓度的ONOO^-孵育15分钟可见光下拍摄的照片；

图6B为本发明所列ONP与各种ROS下孵育15分钟可见光下拍摄的照片；

图6C为本发明所列含有ONP的测试条与各种ROS处理15分钟可见光下拍摄的照片；

图7A为本发明所列ONP在活SH-SY5Y人成神经细胞中与内外源刺激下ONOO^-含量动态变化的成像研究示意图；

图7B为图7A的定量分析数据示意图；

图7C为本发明所列ONP在活SH-SY5Y人成神经细胞中与内源刺激下ONOO^-含量变化的成像研究示意图；

图7D为图7C的定量分析数据示意图；

图8为本发明所列ONP与商用染料共定位的研究示意图；

图9A为本发明所列ONP与不同天然产物处理活细胞后利用高通量快速筛选出促进ONOO^-形成的潜在诱导剂的成像研究示意图；

图9B为图9A的定量分析数据示意图；

图9C为本发明所列ONP与不同多酚类天然产物处理活细胞后利用高通量快速筛选出减少ONOO^-形成的潜在抑制剂的成像研究示意图；

图9D为图9C的定量分析数据示意图；

图10A为本发明所列ONP对活小鼠的脑中ONOO^-的动态变化成像研究示意图；

图10B为本发明所列ONP对离体小鼠的脑部ONOO^-的成像研究示意图；

图10C为图10B的定量分析数据示意图；

图11A为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠癫痫期间ONOO^-的含量变化的成像研究示意图；

图11B为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠癫痫期间ONOO^-的含量变化的定量分析数据折线图；

图11C为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠离体脑部的ONOO^-的成像研究示意图；

图11D为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠离体脑部冰冻切片的ONOO^-的成像研究示意图；

图11E为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠离体脑部的ONOO^-的含量定量分析数据示意图；

图11F为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠离体脑部冰冻切片的ONOO^-的含量定量分析数据示意图；

图12A为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠离体脑部海马最大横截面的石蜡切片的ONOO^-的成像研究示意图；

图12B为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠离体脑部海马最大横截面的石蜡切片的ONOO^-的含量荧光强度的定量分析数据示意图；

图12C为本KA诱导的小鼠离体脑部海马最大横截面的石蜡切片HE染色的活细胞含量的定量分析数据示意图；

图12D为KA诱导的小鼠离体脑部海马最大横截面的石蜡切片HE染色的成像研究示意图；

图13为本发明实施例1制备的ONP的氢谱图；

图14为本发明实施例1制备的ONP的碳谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行说明。

实施例1

一种针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP的制备方法，其制备过程如下：

在氩气保护下，在50mL圆底烧瓶中加入亚甲基蓝(374mg，1mmol)，10mLDCM和10mL水，搅拌均匀。将Na₂S₂O₄(525mg，1.5mmol)和NaHCO₃(168mg，2mmol)缓慢加入到上述混合液中。然后将混合物搅拌20分钟直至水相变为黄色。水层用二氯甲烷(2×5mL)萃取水相，分离有机层。合并有机相，用无水硫酸钠干燥。在氩气保护下，将干燥的有机相快速倒入含有三乙胺(TEA，170μL，1.2mmol)的圆底烧瓶中。将含有三光气(TPG，120mg，0.32mmol)的1mL DCM缓慢加入到反应混合物中。滴加完成后，将反应物在室温下再搅拌0.5小时。向溶液中加入4-羟基甲基苯基硼酸(234mg，1.0mmol)和三乙胺(140μL，1.0mmol)，搅拌过夜后，蒸发溶剂，粗产物用乙酸乙酯(3×20mL)萃取并用水洗涤。通过快速柱色谱(硅胶/氯仿-乙酸乙酯)纯化粗产物，并从乙腈中重结晶，得到产物，为黄色固体(53.8mg，10％)。

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.91(d,J＝9.3Hz,2H),7.68(d,J＝7.8Hz,2H),7.56–7.42(m,4H),7.38(d,J＝7.8Hz,2H),5.16(s,2H),3.36(s,12H),1.29(s,12H).(图13)；13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ154.28,139.29,138.26,135.41,135.04,133.96,127.68,119.49,107.25,84.20,69.08,41.54,25.13.ESI-MScalculated for C₃₀H₃₇BN₃O₄S⁺[M⁺H]⁺,546.5；found,546.3(图14).

实施例2

ONP的合成及初步评价

实施例1制备的近红外荧光探针ONP的最终结构通过¹H和¹³C NMR光谱和质谱完全确认。然后，在PBS缓冲液(pH7.4，5％MeCN)中进行了初步的体外试验。单独的ONP表现出非常弱的紫外吸收和荧光，因为MB(亚甲基蓝)的荧光被锁定在被打断的LMB形式中(图1B和C)，然而，它提供了显着的NIR激发(640nm)和发射(650-850nm，最大值为692nm)。相对应的，将ONP(10μM，PBS缓冲液(pH7.4，5％MeCN))与ONOO^-(100μM，水溶液)在37℃温育30分钟后，观察到分别在665nm和692nm处有显著的吸收和荧光强度的增加。为了研究ONP对不同pH条件的稳定性和可靠性，测量了在不同pH值范围(3-11)的PBS缓冲液中的荧光变化。发现ONP在生理条件下相当稳定，并且表现出相对较宽的pH应用范围。这对于最小化外部干扰和提高测定的保真度很重要(次)。为了进一步阐述其反应机制，将ONP(10μM)与ONOO^-在PBS缓冲液中孵育，并通过HPLC分析监测反应产物，如图1D中所示，在ONP(10μM)与ONOO^-(10μM)温育后，在与对照MB相同的保留时间处，随着孵育时间的增加，可以清楚地观察到产物峰的增加，伴随着逐渐减少消耗的ONP峰。在逐渐增加ONOO^-浓度处理后，观察到类似的趋势，并且最终反应混合物的Ex/Em光谱与MB的一致，进一步证实反应产物是MB，并且通过与ONOO^-反应确实促进了它的形成(图1E)。此外，在辛醇/水体系中，ONP的logP为2.19，以MB为参照，量子产率(ф)为0.007。这些结果表明ONP可作为ONOO^-检测的理想候选探针。

实施例3

ONP光谱性质和选择性

为了更详细地研究ONP对ONOO^-的响应，通过记录692nm处荧光强度的变化来评估其在ONOO^-存在下的时间依赖性荧光响应。发现ONP和ONOO^-之间的反应很快，将10μM的ONP与100μM的ONOO^-在含5％CH₃CN的PBS体系中共同孵育1分钟后在692nm处可清楚地利用荧光分光光度计检测到到荧光强度的明显增强，并且反应在15分钟内完成，ONOO^-活化后ONP被有效转化为MB(图3A)。此外，当10μM ONP与浓度增加的ONOO^-(0-100μM)一起孵育时，观察到浓度依赖性荧光增强(图3B)，表明ONP不仅对ONOO^-快速响应，对低浓度的ONOO^-也高度敏感，并且692nm处的荧光强度与0至4μM范围内的ONOO^-浓度之间存在优异的线性关系(R²＝0.9979)(图4)。另外ONP的检测限(LOD)可达到94nM(S/N＝3)。

与荧光“开启”响应一致，用100μM ONOO^-处理10μM ONP也可以引起其UV-vis吸收曲线的显着变化。在没有ONOO^-的情况下，仅观察到以650nm为中心的非常弱的吸收带，而用ONOO^-处理665nm处的吸光度显着增强，且具有时间依赖性模式(图5)。这些发现表明ONP对ONOO^-活化具有高度响应性。此外，为了确定ONP是否能够特异性地监测ONOO^-，通过记录692nm处的荧光强度来检查各种活性氧(ROS)，金属离子，生物硫醇和生物系统中常见的其他比较物种的选择性响应。将ONP(10μM)与这些活性物质一起孵育，例如叔丁基氢过氧化物(^tBuOOH)，过氧化氢(H₂O₂)，次氯酸盐(ClO^-)，超氧化物(O₂ ^-)，羟基自由基(·OH)，超氧阴离子自由基(O₂·^-)，通过跟踪MB形成来监测相应的荧光响应。在这些分析物中，ONP显示对ONOO^-的最强响应，其他测试的分析物仅诱导最小的荧光变化，表明ONP对ONOO^-的高度特异性(图3C)。由于硼酸酯取代的苯环可能在生理条件下被酪氨酸激酶催化反应激活，还通过将ONP与人酪氨酸激酶(150U/mL)一起温育来检测其在酪氨酸激酶存在下的稳定性，孵育后未观察到荧光变化。总之，这些结果表明ONP对ONOO^-活化具有高度选择性，并且其他常见细胞物种不会触发其活化。另外，将10μMONP与不同浓度的ONOO^-(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100μM)在含5％CH₃CN的PBS中37℃下孵育15分钟能够肉眼直接观察到颜色的改变，且具有浓度依赖性(图6A)，与100μM各种活性氧物种在含5％CH₃CN的PBS中37℃下孵育15分钟，将含有200μM ONP的试纸条与1mM的各种活性氧物种在37℃下孵育15分钟,可见光下拍摄照片,两者均可以肉眼观察到ONP能够特异性地监测ONOO^-(图6B和6C)。

实施例4

通过活细胞中的ONP可视化示踪ONOO^-的动态变化

在确认ONOO^-触发荧光开启响应的效率之后，接下来继续研究其动态示踪细胞内ONOO^-生成的可行性。使用ONP和共聚焦荧光显微镜跟踪活SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中的ONOO^-。如图7A所示，将活细胞与或不与SIN-1(100μM，ONOO^-供体)一起预孵育1小时，然后在成像前用ONP(10μM)再处理30分钟。在不存在SIN-1的情况下，在负载ONP的细胞中观察到弱荧光信号，然而，在SIN-1处理的细胞中可以检测到显著的荧光增强。相应的，通过用ONOO^-的分解催化剂FeTMPyP(50μM)处理可以有效地抑制增加的荧光。此外，与对照组相比，在用NO供体NOC-18(1mM，1小时)预处理的细胞中未观察到荧光信号的可检测变化(图7B)。另外，通过与ONP和不同的商业细胞器靶向剂(包括MitoTracker，LysoTracker和ERTracker)共染色来研究细胞内ONOO^-的亚细胞分布(图8)，结果表明ONOO^-可以在整个细胞的不同部位广泛且无特别地分布，这也与其跨膜分散特征一致。这些实验表明ONP适用于外源供体产生的ONOO^-的活细胞成像。为了进一步研究ONP监测内源性ONOO^-的能力，将活细胞与H₂O₂(0.5mM，1小时)或细菌内毒素脂多糖(LPS，1μg/mL，12小时)预孵育以刺激产生内源ONOO^-(图7C)，发现在与ONP孵育之前用LPS/H₂O₂预刺激的细胞中具有显着的荧光增强，用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC，1mM)(半胱氨酸的前药)预处理的活细胞表现出降低的荧光信号。类似地，加入一氧化氮合酶(NOS)抑制剂，氨基胍(0.5mM，0.5小时)可减少细胞内ONOO^-，因为氨基胍对细胞ONOO^-的生物合成具有抑制作用(图7D)，可以观察到下降的荧光信号。这些结果证明了ONP的选择性可视化生物系统中内源ONOO^-的动态变化的可行性。

实施例5

利用ONP筛选针对ONOO^-形成的诱导物和抑制剂

为了评估ONP是否是用于筛选针对ONOO^-形成的诱导物和抑制剂的有效鉴定工具，通过将ONP与高通量分析(HCA)组合来构建快速验证生物活性分子的基于荧光的筛选方法。首先建立了一个化学库，其中含有不同种类的天然产物，顺铂、青蒿琥酯、双氢青蒿素、鬼臼毒素、盐酸多柔比星、姜黄素、10-羟基喜树碱、白杨素、紫苏醇和大黄酸，均有潜在的抗癌活性。用20μM天然产物预处理活SH-SY5Y细胞12小时，将细胞与ONP(10μM)在新鲜培养基中再孵育30分钟，通过高含量筛选分析进行图像和定量分析。如图9A和图9B所示，将天然产物的不同处理中的ONP的荧光信号与阴性对照组的荧光信号进行比较，以筛选促进ONOO形成的潜在诱导物。发现这些报道的抗癌剂可以潜在地诱导内源性ONOO^-的过量产生，这表明在这些化合物处理的细胞中抑制ONOO^-过度积累可能是抗癌机制之一。进一步为了研究该方法的筛选能力以鉴定抗ONOO^-形成的潜在抑制剂，进一步建立了含有不同抗氧化剂的化合物库，例如多酚和不饱和化合物，姜黄素、白杨素，芹菜素，木犀草素，染料木素，刺芒柄花素，大豆苷元，原儿茶醛，原儿茶酸和柚皮素(图9C和图9D)。然后通过使用HCA分析比较ONP的荧光强度来筛选这些化合物对ONOO^-形成的抑制效率，表明这些化合物除原儿茶酸和柚皮素外的大多数可用于抑制ONOO^-的产生。重要的是，观察到姜黄素，一种先前报道的抗癫痫药，可有效控制内源性ONOO^-形成。总之，可以通过使用与ONP组合的高通量分析在这些试剂的存在下表现出的NIR荧光信号的变化来简单地筛选和鉴定针对ONOO^-形成的诱导物和抑制剂。

实施例6

ONP用于在活鼠中检测ONOO^-

为了研究ONP是否可以用于监测体内ONOO^-浓度的动态变化，使用一组5周龄BALB/c裸鼠，通过腹膜内(i.p.)注射不同药剂(SIN-1，3,4-二羟基苯甲醛，姜黄素，Rhein)来诱导内源性ONOO^-变化；然后通过尾静脉内(i.v.)注射ONP(浓度50μM，200μL生理盐水)后在不同时间点捕获图像(图10)。发现ONP可以有效地穿透血脑屏障(BBB)，发现只注射ONP的健康的对照组小鼠脑也有一定浓度的ONOO^-。用3,4-二羟基苯甲醛(60mg/Kg，200μL生理盐水)和姜黄素(60mg/Kg，200μL生理盐水)腹腔注射预处理，脑内NIR荧光信号在静脉注射ONP后5，15，30，45和60分钟显著低于对照组(对照组均为只注射ONP的健康小鼠)，表明抗氧化剂3,4-二羟基苯甲醛和姜黄素可用于有效清除脑中内源性ONOO^-水平。SIN-1(500μM，200μL生理盐水)腹腔注射处理的小鼠中明显的NIR荧光信号主要位于腹部并且高于健康对照组，是因为i.p.注入SIN-1后ONOO^-可以迅速释放，SIN-1本身可能不能有效地穿过BBB。相应的，可以观察到Rhein(60mg/Kg，200μL生理盐水)腹腔注射处理的小鼠和对照小鼠在早期时间点之间的差异，这伴随着用大黄酸处理的小鼠脑中稍高的NIR荧光信号。这些发现表明，ONP是一种特异性探针，可进行体内成像监测外源性刺激过程中ONOO^-含量的动态变化，表明ONP可以作为一种成像剂，重要的是，ONP可用于成像脑中内源性ONOO^-水平的变化。

实施例7

ONP用于对活体癫痫小鼠内源性ONOO水平变化进行成像

在癫痫的发展过程中发现过表达的ONOO^-。为了研究ONP是否可用于成像癫痫脑中内源性ONOO^-水平的变化，使用了红藻氨酸(KA)诱导的BALB/c小鼠模型，这是一种广泛使用的癫痫小鼠模型。在静脉注射ONP(浓度50μM,200μL生理盐水)后的不同时间点比较癫痫大脑和健康对照组大脑中ONOO^-的相对水平，发现在静脉注射ONP后5,15,30,45和60分钟，KA诱导的癫痫脑中的NIR荧光信号显着高于对照组(对照组均为只注射ONP的健康小鼠)。在i.p.注射KA(浓度6mg/Kg,200μL生理盐水)后，12小时内脑中ONOO^-的浓度与24小时组相比显着增加。在ONP注射后60分钟内，癫痫大脑和WT脑之间的相对差异[R(癫痫)/R(WT)＝F(癫痫)/F(WT)]从1.4倍降低至1.2倍(图11A和B)。重要的是，用抗氧化剂姜黄素(60mg/Kg，3天)预处理小鼠可以成功地防止由KA诱导的ONOO^-的过量产生。同时，还发现与非治疗组相比，姜黄素的后处理可以有效地清除KA诱导的小鼠中过量积累的ONOO^-，表明姜黄素可能是减少ONOO^-的优良抗癫痫药，用于预防癫痫的损害和预防性干预。此外，离体NIR荧光图像显示KA诱导的脑的NIR荧光强度远高于对照组，并且用姜黄素治疗前/后可以减少癫痫脑中的荧光信号，表明ONOO^-水平下降，通过姜黄素治疗可以有效清除癫痫大脑中过量的ONOO^-(图11C和E)。为了进一步研究ONOO^-在组织中的亚细胞分布，分离出脑组织并切成切片以在不同深度进行荧光成像分析(图11D和F)。与对照组相比，KA给药组以时间依赖性方式显示出明显的NIR荧光，姜黄素处理组表现出较低的荧光。组织中荧光强度的这些显着变化与癫痫大脑中的荧光强度高度一致，进一步证实了KA诱导的癫痫期间内源性ONOO^-上调。总之，这些结果表明ONP可用于体内成像癫痫脑中的内源性ONOO^-通量，并且提供了潜在的方法用于监测活体小鼠中抗氧化药物治疗期间内源性ONOO^-形成的动态变化，说明针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP可以筛选抗癫痫抑制剂。

实施例8

监测海马区域ONOO^-水平的变化

癫痫通常与海马的严重组织学损伤有关。为确定ONOO^-在KA诱导的癫痫发作中的潜在作用，通过将实施例7中的小鼠的离体脑部进行多聚甲醛固定，石蜡切片脱蜡至水后进行ONP荧光扫描，然后采用苏木素染色，伊红染色对切片进行HE染色，脱水封片后进行明场扫描，对KA暴露后CA1，CA3和齿状回(DG)亚区的荧光强度和海马神经元死亡进行了细致的研究(图12)。在正常对照组即只腹腔注射ONP的正常小鼠脑切片中，在所有海马区域仅观察到弱荧光信号，伴随着明显的分层结构，整齐排列的神经细胞，完整的细胞膜，均匀的细胞质染色和明显的核仁。相反，清楚地观察到癫痫脑切片中的显著的荧光增强，特别是在CA1和CA3区域，这可归因于癫痫大脑中较高的ONOO^-水平。值得注意的是，由刺激应激产生的过量ONOO^-可导致严重的神经元死亡，包括神经元丢失和海马区域的排列紊乱，这也与先前报道癫痫中的保护性超氧化物歧化酶2(SOD2)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的显着减少一致。重要的是，发现姜黄素治疗前后的ONOO^-水平发生了显着变化。姜黄素给药可以抑制或消除所有海马亚区中过度增加的ONOO^-，进一步有效地保护或减少癫痫病症中的神经元损伤，这些观察结果表明，高浓度的ONOO^-可能导致严重的神经元损伤和癫痫发生，有效抑制过度表达的ONOO^-是癫痫的潜在治疗方法。

Claims

1.一种针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP，其特征在于，由硼酸酯结合亚甲蓝骨架获得，其结构如结构式I所示：

2.一种权利要求1所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

其反应式如下所示：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述将Na₂S₂O₄和NaHCO₃缓慢加入到上述混合液中，然后将混合物搅拌直至水相变为黄色。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述加入4-羟基甲基苯基硼酸和三乙胺搅拌过夜后蒸发除去溶剂得到粗产物。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述纯化重结晶后得到产物为粗产物优选用乙酸乙酯萃取并用水洗涤，通过快速柱色谱纯化粗产物，并从乙腈中重结晶，得到产物，为黄色固体。

6.一种权利要求1所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP在筛选针对过氧亚硝酸盐的诱导物和抑制剂中的应用。

7.根据权利要求6所示的应用，其特征在于，所述应用包括近红外荧光探针ONP在活细胞中可视化示踪过氧亚硝酸盐的动态变化。

8.一种权利要求1所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP在筛选抗癫痫抑制剂中的应用。

9.根据权利要求8所示的应用，其特征在于，所述应用包括近红外荧光探针ONP可以对活体癫痫小鼠内源性过氧亚硝酸盐水平变化进行成像。

10.一种权利要求1所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP在制备筛选抗癫痫抑制剂的成像剂中的应用。