CN110437147B - 一种次氯酸双光子荧光探针hcp及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种次氯酸双光子荧光探针HCP及其制备方法和应用，该双光子荧光探针HCP，其结构如结构式I所示：

Description

一种次氯酸双光子荧光探针HCP及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，涉及一种次氯酸双光子荧光探针HCP及其制备方法和应用，尤其是针对次氯酸的双光子荧光探针HCP的设计合成及其在癫痫中的示踪成像。

背景技术

髓过氧化物酶(MPO)介导的氧化应激，已被认为在癫痫大脑的病理功能障碍中起重要作用。然而，目前还没有强大的脑成像工具来实时检测MPO产生的内源性HOCl，并且没有荧光探针能够快速高通量筛选抗癫痫药以控制MPO介导的氯化应激。MPO活动的动态变化及其介导的内源性HOCl通量在癫痫发作中的病理机制仍未完全了解。髓过氧化物酶(MPO)是一种过氧化物酶，含有两个铁分子，催化过氧化氢和氯离子的转化，释放更多的细胞毒性次氯酸(HOCl，pKa 7.6)和其他氯化物质，导致潜在的氧化应激。HOCl的强氧化和氯化能力在对病原体的免疫中起重要作用。然而，过量表达MPO及其介导的氧化应激会导致炎症，严重的组织损伤和神经系统疾病。越来越多的证据表明，异常升高的MPO与神经退行性疾病(如阿尔茨海默病(AD)，帕金森病(PD)，亨廷顿病(HD)，中风，抑郁症和癫痫)之间存在密切的相关性。此外，目前的一些研究表明，MPO水平的增加与癫痫发生有关，表明MPO可能是早期诊断癫痫的有希望的生物标志物，也可作为癫痫的潜在治疗靶点。因此，定义MPO活性的动态变化及其介导的氯化应激将有助于更好地理解癫痫发作的潜在分子机制。然而，癫痫发生过程中MPO动力学活动的详细变化和调控尚未完全阐明。因此，MPO介导的体内氧化应激的直接可视化和用于癫痫治疗的有效先导化合物的快速筛选仍然是非常期望的但是具有挑战性。

由于荧光成像的独特优势包括高灵敏度和选择性，简单性，优异的时空分辨率和无创可视化，基于活性的传感探针被认为是生物生物系统中活性氧物质成像的理想和不可或缺的工具。到目前为止，已经报道了一些荧光探针可以成功地用于体外测定HOCl并在活细胞中成像HOCl。然而，这些单光子荧光探针中的大多数受其短激发波长，差的组织渗透性和光漂白的限制。为了解决这些问题，一种有希望的方法是开发用于双光子荧光显微镜(TPM)的双光子荧光探针。通过使用NIR光的双光子激发，成像可以实现生物样品的三维可视化，具有更深的组织成像深度，更少的光漂白和背景荧光，以及更高的时空分辨率。迄今为止，很少有双光子荧光探针用于在活细胞中成像HOCl。使用这些探针，已经实现了受伤组织或炎症小鼠模型中HOCl的可视化。然而，目前还没有关于活体动物大脑中HOCl通量的直接实时可视化的报道，特别是在癫痫发作期间。此外，目前没有荧光探针可用于高通量筛选抗癫痫药以控制MPO介导的氧化应激。为了满足这些需求，脑成像剂的开发存在巨大挑战，包括有效的血脑屏障(BBB)穿透性，高特异性，良好的灵敏度和所需的光物理特性。因此，迫切需要开发一种双光子荧光探针，用于在具有癫痫样行为的脑中成像MPO介导的氧化应激，并且用于高通量筛选抗癫痫药。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种针对次氯酸双光子荧光探针HCP，该双光子荧光探针HCP能够在体外和体内有效且选择性地成像HOCl，可以有效地穿过血脑屏障(BBB)具有靶向脑部特征，可以有效地示踪KA诱导的癫痫疾病中的内源性HOCl信号，首次在体内和体外直接观察到在具有癫痫样行为的脑中成像MPO介导的氧化应激。另外，将高内涵分析与HCP相结合，可以为研究生物系统中的HOCl和筛选抗癫痫药物提供一种高通量筛选方法，简单有效筛选出抗癫痫药物的抑制剂。

本发明提供一种针对次氯酸双光子荧光探针HCP的制备方法和应用。即本发明的针对次氯酸双光子荧光探针HCP可以简单高效的示踪KA诱导的癫痫疾病中MPO上调介导的氧化应激，同时亦可以应用在高通量筛选抗癫痫抑制剂中，成为一种有效筛选抗癫痫抑制剂中的新型工具，探针反应荧光强度，可使荧光降低的药物即为抑制剂。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种针对次氯酸的双光子荧光探针HCP，其结构如结构式I所示：

其中，所述HCP由6-(二甲基氨基)喹啉-2-甲醛与2，3-二氨基马来腈合成获得。

本发明所述的针对次氯酸的双光子荧光探针HCP的制备方法，包括如下步骤：

将化合物1：N，N-二甲基对苯二胺溶解在盐酸后添加巴豆醛，室温下搅拌后，加入甲苯进一步回流反；冷却除去甲苯，采用饱和氢氧化钠溶液中和水层，二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压过滤浓缩得到粗品，粗品经硅胶柱层析纯化得到化合物2：6-(二甲基氨基)喹啉-2-甲基；

二氧化硒在二氧六环/水中高温加热搅拌，加入化合物2继续加热搅拌；冷却过滤，滤液减压浓缩，得到粗品，硅胶柱层析纯化，得到相应的化合物3：6-(二甲胺基)喹啉-2-甲醛；

将化合物3溶于乙醇和乙酸中，加入2，3-二氨基马来腈低温搅拌；反应混合物先溶解再混浊，有固体沉淀析出，用N，N-2-二甲基甲酰胺和甲醇重结晶得到HCP；

其反应式如下所示：

本发明所述的针对次氯酸盐的双光子荧光探针HCP在筛选针对过次氯酸的抑制剂中的应用。

其中，所述应用包括双光子荧光探针HCP在活细胞中可视化示踪次氯酸的动态变化。

本发明所述的针对次氯酸的双光子荧光探针HCP在筛选抗癫痫抑制剂中的应用。

其中，所述应用包括双光子荧光探针HCP可以对活体癫痫小鼠内源性次氯酸水平变化进行成像。

本发明所述的针对次氯酸的双光子荧光探针HCP在制备筛选抗癫痫抑制剂的成像剂中的应用。

本发明所述的针对次氯酸的双光子荧光探针HCP制备筛选出癫痫抑制剂芹菜素对于蛋白调控药物、试剂或者工具中的应用。

其中，所述应用包括双光子荧光探针HCP制备筛选出癫痫抑制剂芹菜素对于MPO、GPX4和SIRT1表达水平的影响药物、试剂或者工具。

荧光探针HCP的设计原理：为了实现动物模型活脑中MPO产生HOCl的实时检测，设计的基于活性的传感探针应具有非细胞毒性，BBB穿透性，并具有明亮的荧光。考虑到各种荧光团的性质，喹啉骨架因其类似药物的物理化学和光物理性质而引起了人们的极大兴趣。以前，喹啉衍生物已经表明，所需的BBB渗透性可用于脑成像或神经保护剂的开发。例如，基于喹啉醛的席夫碱可用作Aβ斑块中金属(Cu²⁺和Zn²⁺)成像的染色试剂，喹啉可以用作潜在的神经保护剂。此外，喹啉骨架具有出色的双光子激发特性，可以设计双光子荧光探针，用于生物体内的深部组织成像。受这些基于喹诺酮的神经保护药物和显像剂的启发，本发明寻求一种简单的缩合反应，根据分子间电荷转移(ICT)原理构建一种新的双光子荧光探针。因此，探针HCP由席夫碱官能化的6-(二甲基氨基)喹啉醛与二氨基马来腈合成设计和合成。在HCP中，共轭电子受体二氨基马来腈基减弱了喹啉醛荧光团的推挽电子效应，从而导致弱的黄色荧光。在HOCl存在下，HCP结构修饰形成HCP-Cl将通过预期的氯化反应，从而改变分子间电子效应以实现蓝移发射增强。本发明从市售原料制备探针HCP，该探针应在双光子激发下对MPO产生的HOCl产生明显的荧光响应，并且其结构通过1H和13C NMR光谱以及高分辨率质谱(HR-MS)充分表征。

本发明提供了一种有效的双光子荧光探针(HCP)，可以用于实时检测MPO在红藻酸(KA)诱导的癫痫发作时大脑中产生的内源性HOCl信号。通过这种探针，第一次直接观察了癫痫行为小鼠脑中由于MPO活性过表达所产生的内源性HOCl。同时利用HCP，还首次构建了高通量筛选方法，以快速筛选潜在的抗癫痫药物以控制MPO介导的氧化应激。另外进一步的分子机制研究表明，筛选出的黄酮类化合物芹菜素可以减轻MPO介导的氧化应激，抑制神经细胞的细胞凋亡。本发明提供了双光子荧光探针(HCP)作为一种多功能荧光工具，用于阐明MPO产生HOCl在癫痫发作病理中的作用，以及快速发现新的抗癫痫药物以预防和治疗癫痫。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明制备的一种针对次氯酸双光子荧光探针HCP，该双光子荧光探针HCP能够在体外和体内有效且选择性地成像HOCl，可以有效地穿过血脑屏障(BBB)具有靶向脑部特征，可以有效地示踪KA诱导的癫痫疾病中的内源性HOCl信号，首次在体内和体外直接观察到在具有癫痫样行为的脑中成像MPO介导的氧化应激。另外，将高内涵分析与HCP相结合，可以为研究生物系统中的HOCl和筛选抗癫痫药物提供一种高通量筛选方法，简单有效筛选出抗癫痫药物的抑制剂。

本发明针对过次氯酸双光子荧光探针HCP的制备合成方法，合成路线新颖，简单易行，成本较低，原料利用率高适合于工业化生产；本发明制备的针对次氯酸双光子荧光探针HCP可以有效地检测细胞内外源的HOCl的存在，示踪KA诱导的癫痫疾病中MPO介导的氯化应激导致的内源性HOCl信号变化，首次在体内和体外直接观察到在KA诱导的癫痫期间HOCl的上调。本发明的针对次氯酸双光子荧光探针HCP可以应用在在制备筛选抗癫痫抑制剂的成像剂或者工具中，另外，将高内涵分析与HCP相结合，可以为研究生物系统中的HOCl和筛选抗癫痫药物提供一种高通量筛选产品和方法，简单有效筛选出抗癫痫药物的抑制剂。

本发明针对过次氯酸双光子荧光探针HCP可以用于实时跟踪活细胞和体内的内源性HOCl，尤其是在活体的大脑中成像。这种新型探针具有高效的BBB穿透性，高度的光稳定性和出色的时间和空间分辨率。这是首次能够通过成像来灵敏检测MPO在活脑中产生HOCl的动态变化状态而不受其他生物物种干扰的探针。重要的是，在体内和体外KA诱导的癫痫小鼠治疗过程中，首次高通量的直接监测脑中内源性HOCl的动态变化，表明MPO介导的氯化应激与严重神经元损伤以及癫痫发生之间存在正相关关系。此外，通过与高通量分析相结合，构建一种简单的用于抗癫痫药的高通量筛选方法，并且筛选并确认芹菜素作为用于预防和治疗癫痫的有效先导化合物。此外，本发明发现MPO产生的HOCl对SIRT1的失活是癫痫发生的病理机制；而芹菜素可以缓解MPO介导的氧化应激抑制铁死亡，从而促进抗癫痫功能。所以本发明的探针HCP不仅为了解MPO产生与神经退行性疾病相关的HOCl通量的病理机制提供了强大的荧光工具，而且为加速发现用于抗癫痫预防和治疗的新型小分子药物提供了强有力的工具和方法。

附图说明

图1中A为本发明所列HCP与HOCl响应前后的紫外吸收光谱图；B为本发明所列HCP与HOCl响应前后的激发和发射光谱图；C为本发明所列HCP与HOCl响应不同时间的荧光光谱强度变化示意图；D为本发明所列HCP与HOCl及其他小分子化合物响应后的荧光光谱强度变化示意图；E为本发明所列HCP与不同浓度HOCl响应后的荧光光谱强度变化示意图；F为本发明所列HCP与不同HOCl浓度(0-100μM)之间的荧光发射强度的线性相关性示意图和为本发明所列HCP与不同浓度的HOCl孵育365nm下拍摄的照片；G为本发明所列HCP对SH-SY5Y的细胞毒性；H为本发明所列HCP的荧光强度稳定性定量数据图；

图2中A为本发明所列HCP在活SH-SY5Y人成神经细胞中与不同HOCl(0、5、10、15、20、30、40、50μM)浓度之间孵育30min后的荧光成像图；B为A的定量分析数据示意图；C为本发明所列HCP在活SH-SY5Y人成神经细胞中与内源刺激下HOCl含量变化的成像研究示意图；D为C的定量分析数据示意图；

图3中A为本发明所列HCP在活SH-SY5Y人成神经细胞中被用各种天然抗氧化剂预处理12h后成像；B为A的定量分析数据示意图；

图4中A为本发明所列HCP在活SH-SY5Y人成神经细胞中被谷氨酸，KA，4-ABAH，SHA处理后的荧光成像；B为A的定量分析数据示意图；C为本发明所列HCP在活SH-SY5Y人成神经细胞中不同浓度KA和芹菜素处理后的荧光成像；D为C的定量分析数据示意图；

图5中A为本发明所列HCP与细胞膜商用染料共染显示出的细胞膜状态荧光图定量数据；B为本发明所列HCP与染色罗丹明123共染显示出的线粒体膜电位状态荧光成像图；C为B的定量数据；D为本发明所列HCP与JC-1(线粒体膜电位染料)共染显示出的线粒体膜电位状态用流式细胞仪分析的荧光示意图；E为MPO和GPX4在被处理细胞中表达水平的蛋白质印迹图；F为SH-SY5Y细胞在KA和芹菜素处理后的透射电子显微图；G为SH-SY5Y细胞在KA和芹菜素处理后乳酸脱氢酶含量定量图；H为SH-SY5Y细胞在KA和芹菜素处理后丙酮酸激酶含量定量图；

图6中A为KA(6mg/kg)、芹菜素(60mg/kg)、HCP(0.5mg/mL)处理小鼠的流程图；B通过开放场试验比较各组小鼠行为的定量数据分析图；C为本发明所列HCP在5min、15min、30min、45min、60min的时间点监测5组小鼠的荧光图像；D为本发明所列HCP对KA诱导的小鼠离体脑部的HOCl的成像研究示意图；E为本发明所列HCP对KA诱导的小鼠离体脑部冰冻切片的HOCl的成像研究示意图；F为本发明所列HCP对KA诱导的小鼠离体脑部冰冻切片的HOCl的含量定量分析数据示意图；

图7中A为MPO、SIRTI、Ac-p53、GPX4的免疫荧光图；B为MPO、SIRTI、Ac-p53、GPX4的蛋白免疫印记图；

图8：A为本发明所列HCP的反应机制；B为本发明所列HCP与不同浓度HOCl响应后的HPLC分析示意图；C为本发明所列HCP和反应后HCPCL的高分辨率质谱图；D为本发明所列HCP和反应后HCPCL的氢谱图；

图9中A为本发明所列HCP对与不同浓度HOBr响应后的荧光光谱图；B为本发明所列HCP对HOCl和HOBr孵育的选择性和干扰性的荧光光谱图；

图10为本发明所列HCP与不同HOCl浓度(0-4μM)之间的荧光发射强度的线性相关性示意图；

图11为本发明所列HCP与不同浓度的HOCl孵育后可见光下拍摄的照片；

图12为本发明所列HCP与HOCl和HOBr^-在不同的PH下响应前后荧光光谱强度变化示意图；

图13为为本发明所列HCP的荧光强度稳定性荧光图；

图14中A为本发明所列HCP与不同浓度和不同时间芹菜素，4-ABAH，SHA刺激后的SH-SY5Y细胞孵育后的成像研究示意图；B为A的定量数据图；

图15中A为本发明所列HCP在活SH-SY5Y人成神经细胞中在内外源刺激下HOCl含量变化的成像研究示意图；B为A的定量数据图；

图16中A为本发明所列HCP与脂质过氧化染料和超氧化物阴离子探针在被芹菜素和咖啡酸苯乙酯处理后的活SH-SY5Y人成神经细胞中成像研究示意图；B为本发明所列HCP和CAPE的化学结构示意图；

图17为图5中D的定量数据图；

图18为图5中E的定量数据；

图19为图6中C的定量数据分析图；

图20为图6中D的定量数据分析图；

图21为本发明所列HCP对KA诱导的小鼠离体脑部冰冻切片的HOCl的3D和多层成像研究示意图；

图22中A为图6A的KA诱导的小鼠离体脑部海马最大横截面的石蜡切片尼氏染色的成像研究示意图；B为A显示的活细胞神经元数量的定量图；

图23为7B的定量数据分析图；

图24为MALDI TOF-MS分析确定重组SIRT1的偶联分子质量图；

图25为本发明实施例1制备的HCP的氢谱图；

图26为本发明实施例1制备的HCP的碳谱图；

图27为本发明实施例1制备的HCP和HOCl反应后的产物HCPCl的氢谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行说明。

实施例1

一种针对次氯酸的双光子荧光探针HCP的制备方法，其制备过程如下：

化合物1：N，N-二甲基对苯二胺(5g，36.7mmol，1.0当量.)溶解在盐酸后(6M,66mL)添加巴豆醛(6.0mL，73.5mmol，2当量)，室温下搅拌后，加入甲苯(35mL)进一步回流反应过夜。冷却除去甲苯，饱和氢氧化钠溶液中和水层。二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压过滤浓缩。粗品经硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝4:1v/v)纯化得到化合物2：6-(二甲基氨基)喹啉-2-甲基。

二氧化硒(2.8g,25.1mmol,1.3当量.)在二氧六环/水(v/v＝10/1)中高温加热搅拌，加入化合物2(3.5g,19.2mmol,1当量)继续80℃加热搅拌4小时。冷却过滤，滤液减压浓缩，得到粗品，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝6:1v/v)纯化，得到相应的化合物3：6-(二甲胺基)喹啉-2-甲醛。

将化合物3(1g,5mmol，1当量)溶于乙醇(20mL)和乙酸(3mL)中，加入2，3-二氨基马来腈(600mg,5.55mmol，1.11当量)低温11℃搅拌过夜。反应混合物先溶解再混浊，有固体沉淀析出。用N，N-2-二甲基甲酰胺和甲醇(v:v＝1:5)重结晶得到HCP。

其结构通过¹H(图25)和¹³C NMR(图26)光谱以及高分辨率质谱(HR-MS)(图8中C)充分表征。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ8.36(d,J＝8.7Hz,1H),8.25(s,1H),8.15(s,2H),8.12(d,J＝8.7Hz,1H),7.88(d,J＝9.3Hz,1H),7.48(dd,J＝9.5,2.8Hz,1H),6.95(d,J＝2.7Hz,1H),3.09(s,6H)；¹³C NMR(151MHz,DMSO-d₆)δ155.67,149.88,149.79,141.71,134.24,130.75,130.57,127.79,119.98,119.79,114.77,113.98,104.78,102.90,40.51.ESI-MScalculated for C₁₆H₁₅N₆ ⁺[M+H]⁺,291.1353；found,291.1360.

实施例2

HCP的合成及初步评价

HCP对HOCl的体外光谱响应。首先在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(10mM，pH 7.4，5％DMSO)中检测HCP的光谱性质，HCP(量子产率Φ，0.025)本身在451nm处显示最大吸收峰，在581nm处显示荧光峰。为了测试HCP对HOCl的响应，在生理条件下进行吸收和荧光光谱分析。加入50μM HOCl后，10μM HCP的吸收和荧光峰值明显减少，而特征蓝移吸收和荧光发射峰分别出现在396nm和495nm处。(图1中A和B)时间依赖性荧光研究表明荧光强度的增强在5秒内，反应速度十分迅速(图1中C)，与HOCl反应后荧光强度增强138倍。反应混合物的高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析进一步证实了氯化产物(HCP-Cl)的形成为主要产物，电荷和密度以及氢谱图分布也与探针设计和计算结果一致(图8中A，B，C，D，图27)。

实施例3

HCP选择性

通过分析加入各种分析物时的荧光响应来研究HCP的特异性。如图1中D所示，HCP对HOCl的选择性优于其他生物相关分子，如其他竞争的活性氧或氮物种(ROS/RNS)(·OH，·O₂-，¹O₂，H₂O₂，OBr^-，TBHP，HOCl，NO，NO₂ ^-，NO₃ ^-)，生物硫醇(H₂S，GSH，Cys)和金属离子(Cu²⁺，Fe³⁺和Zn²⁺)。只有HOCl才能促进10μM HCP在含有5％的DMSO的pH为7.4的PBS溶液中在495nm发射的显著增强；即使在较高浓度(10当量)下，在其他干扰物质存在下也未观察到HCP荧光光谱的显著变化。在增强495nm处的荧光强度时，HCP对HOCl的选择性比其他物种高>40倍和>80倍。应该注意的是，即使在生理条件下也可以通过嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)产生次溴酸(HBrO，pKa 8.8)，其中氯化物相对于溴化物超过1000倍([Cl^-]140mM，[Br^-]0-100μM)。因此，通过荧光分析在HOCl(100μM)和HBrO(100μM)存在下进一步研究了HCP对HBrO的抗干扰，证明了探针仅会和HOCl结合导致显著的荧光增强(图9中A和B)。虽然大量过量的HBrO(>200μM)可导致HCP的荧光微弱的增强，但HBrO引起的阳性反应不会在生理相关浓度([HBrO]<100μM)内发生，即使孵育时间更长(30分钟)，表明HBrO的干扰可以忽略不计。

实施例4

HCP敏感性

为了鉴定HCP对HOCl的敏感性，在测量范围(0-50μM)内增加HOCl浓度来研究495nm处荧光强度的增强(图1中E)。HCP(10μM)在PBS(10mM,pH7.4,5％DMSO)中与不同浓度的HOCl(0-50μM)共存，荧光强度逐渐增加，用3当量HOCl对10μM的HCP处理后荧光强度达到平稳，在495nm处约增强122倍。在495nm处的荧光强度和0-15μM范围内的低浓度HOCl(R²＝0.9814)之间观察到极好的线性关系(图10)，探针HCP对于HOCl的检测限(LOD)确定为332nM(3σ/斜率)。同时肉眼也可以观察到不同浓度HOCl和HCP共孵育在手持UV灯照射(365nm)下从棕色到灰蓝色和在可见光下的浅黄色到无色的显著的颜色变化(图1中F和图11)。

实施例5

HCP对pH从3到12的变化的稳定性。

如图12所示，通过HCP(10μM)和HOCl(50μM)或者HOBr(100μM)在含有5％DMSO的不同pH(3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,11.0,12.0)的PBS中共存发现，即使在酸性或碱性条件下，HCP在宽pH范围内仍保持稳定。重要的是，HCP在生理pH范围(6.0-8.5)内对HOCl显示出显著的荧光响应，说明了HCP可在生理环境中起作用。为了评估HCP对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的细胞毒性，在用含有不同浓度(0，10，20，25，50，75，100，150μM)的HCP的培养基中孵育48小时后进行细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定，结果表明即使在150μM时也HCP对细胞也几乎没有毒性(图1中G)。此外，还在活细胞中检测了HCP的光稳定性，在活细胞中长期可追溯性表明HCP具有优异的光稳定性和良好性能(图1中H和图13)。总之，这些观察证实了HCP对HOCl的优异选择性和灵敏度以及快速响应，从而表明HCP作为在复杂生物环境中实时跟踪HOCl的有效工具的潜力。

实施例6

HCP对活细胞中HOCl动态变化的荧光反应。

为了探索HCP在活细胞中检测HOCl的能力，用不同浓度的外源HOCl(0-50μM)预处理活SH-SY5Y细胞，通过高内涵分析观察HCP荧光对HOCl的响应，用10μM HCP孵育。在没有外源HOCl的情况下，负载HCP的细胞显示出弱绿色荧光信号；当暴露于浓度增加的外源HOCl时，细胞内荧光以浓度依赖性方式逐渐增加。与对照组相比，添加50μMHOCl导致荧光强度增强至少2倍，表明HCP可有效穿透细胞膜并检测HOCl水平的外源变化(图2中A和B)。

实施例7

HCP在活细胞中成像内源性HOCl的潜在能力

应用脂多糖(LPS)(一种炎症激活剂)来刺激细胞产生内源性HOCl。将细胞用LPS(1μg/mL)预处理12小时，然后与HCP(10μM)一起温育另外30分钟。相比较于只加探针HCP的对照组中，LPS处理组清楚地观察到强烈的荧光增强。为了确保荧光增强是MPO产生内源性HOCl的结果，将细胞与MPO/H₂O₂/Cl^-预孵育，然后与HCP一起孵育。在MPO处理组中观察到荧光强度的显著增加，而单独的H₂O₂/Cl^-没有促进荧光强度的明显变化。相比之下，药物处理的细胞与4-氨基苯甲酸酰肼(4-ABAH)或水杨基羟肟酸(SHA)(众所周知的MPO抑制剂)在绿色通道中显示出比未处理组更弱的荧光，清楚地表明抑制MPO活性诱导细胞内HOCl产生的减少(图2中C和D，图15中A和B)。总之，HCP适用于活细胞中MPO促进HOCl生成的实时检测和成像，并表明其有望成为探索高含量内源HOCl水平动态变化的简单工具。

实施例8

HCP对天然产物进行高通量筛选。

在HCP用于活细胞成像的优异性能的推动下，继续评估HCP是否可以作为筛选潜在抗氧化剂以形成HOCl的有效鉴定工具。首先使用HCP结合高含量分析(HCA)探索了一种简单有效的基于荧光的高通量筛选平台。接下来，将活的SH-SY5Y细胞用20μM不同的天然产物(芹菜素、木犀草素、刺芒柄花素、大豆苷元、原儿茶醛、原儿茶酸、柚皮素、姜黄素、大黄酸、10-羟基喜树碱、白杨黄素、紫苏醇、布洛芬、愈创木酚、磺胺甲谔唑、塞来昔布、萘普生、槲皮素、染料木素、双氢青蒿素、青蒿琥酯、维生素C、抗坏血酸钠)预处理，天然产物显示出潜在的抗氧化活性12小时，内源HOCl的图像和定量分析在10μMHCP孵育后进行HCA分析。该方法确保可快速且定量地检测内源性HOCl产生。发现大多数这些选定的天然产物可以诱导荧光信号的明显降低，从而表明HOCl下调。重要的是，观察到芹菜素，一种经典的黄酮类化合物，与不加天然产物处理的对照组相比，可以有效地钝化荧光信号，这表明这种类黄酮化合物可能是控制活细胞中MPO产生的HOCl积累的潜在药剂(图3中A和B)。总之，HCA筛查结果首次显示HCP可用作检测HCA平台中内源性HOCl变异的简单工具。

实施例9

在谷氨酸/红藻氨酸诱导的氧化应激下用HCP在活细胞中成像。

氧化应激，特别是由MPO产生的HOCl，被认为与神经系统疾病高度相关。为了确认HCP是否可以在受刺激的氧化应激下观察内源性HOCl的动态变化，使用HCP来分析活神经细胞中产生HOCl的情况。根据现有的研究，高浓度的谷氨酸供应可以诱导氧化应激，SH-SY5Y细胞预先和谷氨酸孵育12小时，然后与10μM HCP再培养30分钟。与只加探针的对照相比，1mM谷氨酸处理的细胞显示出比阴性对照更亮的荧光(图4中A和B)，表明HCP对高氧化应激的高敏感性。为了探究HCP捕获MPO产生的HOCl时荧光是否增强，在用谷氨酸刺激的细胞中进一步利用MPO抑制剂(500μM的4-ABAH或SHA),与谷氨酸阳性组相比，在用两种MPO抑制剂处理组中都观察到弱荧光，这与只加探针的阴性对照组相似。另外，使用了谷氨酸类似物以及广泛使用的癫痫诱导试剂--红藻氨酸(KA)刺激和细胞共孵育后再加入HCP，细胞显示出浓度依赖性的荧光增强。这些数据表明，在用谷氨酸及其类似物KA刺激后，人神经元中的内源性HOCl将过量产生(图4中C)。为了确定筛选的芹菜素是否能够在KA诱导的氧化应激下有效控制过表达的HOCl，在KA刺激的条件下用芹菜素预处理/后处理细胞。结果显示芹菜素在KA刺激的氧化应激期间明显抑制细胞内HOCl的形成，这与阳性MPO抑制剂(4-ABAH/SHA)相当(图4中B和D、图14中A和B)。总之，通过HCP荧光成像可视化，MPO产生的内源性HOCl可以在活细胞中可以很容易地被跟踪，并且芹菜素有望可以被用作在刺激下控制MPO介导的氧化应激的试剂。

实施例10

芹菜素缓解KA应激诱导的神经细胞死亡的机制。

研究了不同刺激条件下细胞膜的状态，细胞预先和KA(500μM,),CAPE(20μ)和芹菜素(20μM)共孵育12小时后，再和10μM超氧化物阴离子荧光探针,10μM HCP and 10μMBODIPY 581/591一起孵育30分钟后成像。图5中A显示与不外加KA,CAPE和芹菜素处理,只与10μM超氧化物阴离子荧光探针，10μM HCP and 10μM BODIPY 581/591共孵育的正常细胞相比，KA刺激引起细胞内超氧化物，HOCl和脂质过氧化物积累的显著增加。与芹菜素的共处理可以有效地减轻过表达的氧化应激并显示相对低的荧光(图16中A和B)。商品罗丹明123染料对线粒体膜电位的影响表明，KA处理组有效降低线粒体膜电位，导致线粒体膜损伤；与单独用KA处理的组相比，芹菜素共处理组的膜电位没有显著变化(图5中B和C)。流式细胞术分析也与这些荧光成像结果一致，进一步揭示了芹菜素对线粒体膜的有效保护(图5中D和图17)。由于脂质过氧化的异常升高作为铁蛋白沉积症的重要生物标志物之一，是一种涉及脂质氢过氧化物的非细胞凋亡形式的细胞死亡，因此KA诱导的神经细胞死亡可能是通过铁上皮细胞途径。进一步探究分子机制，进行了特异性抗体的蛋白质印迹研究，观察GPX4的表达。结果显示，在KA刺激下GPX4的表达显著降低，而在芹菜素处理组中GPX4的水平显著增加(图5中E和图18)。此外，观察到MPO表达水平的相应变化。KA处理促进了MPO表达的异常增加，而与芹菜素的共同处理可以有效抑制MPO的过表达。为了直观地观察KA诱导的应激下的结构变化，在不同的处理条件下进行TEM(透射电子显微镜)的线粒体成像(图5中F)。与正常细胞相比发现KA处理组线粒体数量明显减少，形状变小，内部脊结构消失。重要的是，与芹菜素的共处理可以有效地减轻线粒体损伤的这些现象，这与乳酸脱氢酶和丙酮酸激酶活性变化的相一致(图5中G和H)。总之，这些结果表明KA刺激引起MPO水平的异常表达，导致GPX4表达显著降低，脂质过氧化异常和线粒体损伤，最终引发铁细胞细胞死亡。但是通过使用HCP筛选出的芹菜素可以减轻KA诱导的铁蛋白沉积并在神经细胞中起到神经保护功能。重要的是，HCP探针可以直接观察到这些增强的芹菜素激活神经元抗氧化能力和HOCl的动态变化。

实施例11

HCP对于癫痫小鼠脑内HOCl的活体成像。

研究HCP是否可用于监测体内典型癫痫动物模型中内源性HOCl水平的动态变化。探针的log P值为3.83，表明其潜在的HCP的BBB(血脑屏障)渗透性。为了研究HCP对体内内源性HOCl成像的潜力，通过腹腔(ip)注射KA(6mg/kg)野生型(WT)小鼠建立小鼠癫痫模型，其广泛用于研究癫痫疾病。分别在癫痫小鼠的早期预防和晚期治疗阶段注射芹菜素(60mg/kg)(图6中A)。由于运动和探索是几乎所有小鼠都具有日常经验的行为，通过进行开放式野外测试来测试他们适应新环境的能力。为此，将小鼠置于室中并观察KA和芹菜素对小鼠运动状态的影响。如图6中B所示，结果显示，KA处理小鼠显示出进入总区域和中心区域的速度显著降低，并且还明显减少了进入中心区域的数量和在中心区域的停留时间。较少的探索行为和更多的情绪压力显示癫痫小鼠的特定行为特征。同时芹菜素的预防和治疗效果是显而易见的，这显著改善了KA诱导的癫痫症状。静脉注射(iv)HCP(0.5mg/kg)后，体内成像显示脑区癫痫组的荧光强度明显高于广泛型(WT)健康小鼠的不同时间(5，15，30，45和60分钟)。用芹菜素进行治疗前/治疗后，与仅用KA处理的小鼠相比，小鼠脑显示出减少的荧光信号(图6中C和图19)。这些结果证实芹菜素可以有效地控制KA诱导的癫痫大脑中HOCl的过表达，与生理学小鼠模型的行为结果一致。此外，通过来自这些小鼠的脑的离体荧光成像进一步验证了这些体内成像观察结果(图6中D和图20)。在静脉内注射HCP 60分钟后，在来自癫痫大脑的脑切片的Z-堆叠图像中同样观察到更高水平的聚集的HOCl(图6中E和F)；而芹菜素处理可以控制氯化应激的异常积累。这些体内和体外研究证实，HCP成像为活体癫痫动物用抗氧化药物治疗期间脑内监测内源性HOCl的动态变化提供了一种有效的方法，并且芹菜素可作为神经退行性疾病治疗中的潜在神经保护剂。鉴于SIRT1，一种NAD+依赖性脱乙酰酶，在保护各种神经退行性疾病模型中的神经元中起着至关重要作用，因此探究MPO产生的HOCl是否与SIRT1有某种关联。为此，通过对来自这些活体成像的小鼠的脑切片中海马最大表面进行免疫荧光研究，取出冷冻组织切片，恢复到室温。用新鲜的4％多聚甲醛在1X PBS中固定冷冻组织切片10分钟。冷冻组织切片用PBS冲洗3次，每次5分钟。用0.3％的TritonX-100在PBS中使组织渗透10-30分钟。用PBS冲洗切片3次，每次5分钟。用封闭液(含有的3％BSA的1X PBS)封闭组织切片30min。将一抗(MPO antibody、SIRT1 antibody、p53antibody、Ac-p53(Acetyl-TP53-K370 mAb)、GPX4 Rabbit PolyAb按1:100的比例混合在封液中再在4℃下孵育冰冻切片过夜。用含有0.1％吐温20的PBS冲洗组织切片3次，每次10分钟。将Alexa Fluor 594结合的山羊抗兔/小鼠lgG(H+L)按1:20 00的比例混合在封闭液中再在4℃下孵育冰冻切片过夜。用含有0.1％吐温20的PBS冲洗组织切片3次，每次10分钟。组织切片再用DAPI孵育5分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。在用盖板玻璃覆盖之前，将抗荧光猝灭密封剂滴在切片上。采用共聚焦荧光显微镜(Leica TCS sp8mp)进行成像。研究了这些蛋白在不同处理小鼠脑中的表达(图7中A和图21)。来自KA刺激的小鼠脑切片的Z-堆叠图像显示强MPO荧光信号和相对弱得多的SIRT1免疫荧光，从而导致Ac-p53水平的上调。与KA诱导的癫痫的药理学模型一致，观察到严重的神经细胞死亡，包括所有海马亚区域中的无序排列和神经细胞的丧失(图22中A和B)。相反，来自芹菜素处理的小鼠的脑切片的荧光显示出相对较弱的MPO但更强的SIRT1免疫荧光，表明在芹菜素处理组中MPO水平的下调和SIRT1表达的显著增加。重要的是，我们发现芹菜素给药可以有效地保护整个海马区域的神经细胞，这与上述减少的HOCl产生的观察一致。这些研究结果表明，SIRT1的活性降低伴随着MPO表达的过量，这促进了HOCl的过度生成和氯化应激的积累。引人注目的是，SIRT1可以在通过芹菜素给药阻断MPO和清除过表达HOCl后被激活。用芹菜素处理的脑内Ac-p53水平下调，表明p53介导的椎体下垂途径被阻断。与这些相关性一致，同时观察到芹菜素处理组中GPX4(一种关键的寄生虫病调节蛋白)的明显上调，表明芹菜素在抑制神经细胞的细胞凋亡中的重要作用(图21)。另外，提取来自小鼠脑的海马区域和海马周围的皮质区域的组织蛋白用于蛋白质印迹分析。结果进一步证实了芹菜素给药组中上调的SIRT1和GPX4表达，其伴随着MPO表达的动态下调(图7中B和图23)。最后进行蛋白质组学分析以鉴定SIRT1和HOCl的反应。此外，MAIDL-TOF MS分析显示，SIRT1的8个Tyr位点中的6个酪氨酸残基(Tyr)可以通过氯化共价修饰，表明在氯化胁迫下SIRT1具有氧化还原敏感性(图24)。结果表明，过量的外源HOCl或MPO产生的内源性HOCl可导致对SIRT1结构的氯化损伤，从而降低酶活性导致蛋白质降解并进一步引起癫痫行为。总之，这些结果证明了KA应激诱导的MPO及其产生的HOCl的上调可以降低SIRT1和GPX4的活性，而芹菜素可以作为SIRT1和GPX4的有效激活剂。此外，MPO/SIRT1/p53途径可能是在癫痫发病过程中通过铁死亡促进神经细胞死亡的可能途径。本实施例HCP对于癫痫小鼠脑内HOCl的活体成像，可以证明HCP作为成像剂可有效应用在制备筛选抗癫痫抑制剂中。

Claims (10)

1.一种针对次氯酸的双光子荧光探针HCP，其特征在于，其结构如结构式I所示：

2.根据权利要求1所述的针对次氯酸的双光子荧光探针HCP，其特征在于，所述荧光探针HCP由6-(二甲基氨基)喹啉-2-甲醛与2，3-二氨基马来腈合成获得。

3.一种权利要求1所述的针对次氯酸的双光子荧光探针HCP的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将化合物1：N，N-二甲基对苯二胺溶解在盐酸后添加巴豆醛，室温下搅拌后，加入甲苯进一步回流反应；冷却除去甲苯，采用饱和氢氧化钠溶液中和水层，二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，减压过滤浓缩得到粗品，粗品经硅胶柱层析纯化得到化合物2：6-(二甲基氨基)喹啉-2-甲基；

二氧化硒在二氧六环/水中高温加热搅拌，加入化合物2继续加热搅拌；冷却过滤，滤液减压浓缩，得到粗品，硅胶柱层析纯化，得到相应的化合物3：6-(二甲胺基)喹啉-2-甲醛；

将化合物3溶于乙醇和乙酸中，加入2，3-二氨基马来腈低温搅拌；反应混合物先溶解再混浊，有固体沉淀析出，用N，N-2-二甲基甲酰胺和甲醇重结晶得到HCP；

其反应式如下所示：

4.一种权利要求1所述的针对次氯酸盐的双光子荧光探针HCP在筛选针对过次氯酸的抑制剂中的应用。

5.根据权利要求4所示的应用，其特征在于，所述应用包括双光子荧光探针HCP在活细胞中可视化示踪次氯酸的动态变化。

6.一种权利要求1所述的针对次氯酸的双光子荧光探针HCP在筛选抗癫痫药物中的应用。

7.根据权利要求6所示的应用，其特征在于，所述应用包括双光子荧光探针HCP对活体癫痫小鼠内源性次氯酸水平变化进行成像。

8.一种权利要求1所述的针对次氯酸的双光子荧光探针HCP在制备筛选抗癫痫药物的成像剂中的应用。

9.一种权利要求1所述的针对次氯酸的双光子荧光探针HCP制备筛选出癫痫抑制剂芹菜素对于蛋白调控药物、试剂或者工具中的应用。

10.根据权利要求8所示的应用，其特征在于，所述应用包括双光子荧光探针HCP制备筛选出癫痫抑制剂芹菜素对于MPO、GPX4和SIRT1表达水平的影响药物、试剂或者工具。

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