CN115368415A - 一种用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于检测线粒体内ClO‑/H2O2的多色荧光探针及其制备方法和应用，该多色荧光探针的结构式如下，具有非常良好的性能，高选择性，良好的膜渗透性和灵敏度，并且具有线粒体靶向能力，可以定向监测线粒体内的ClO‑和H2O2，并在不同荧光通道成像。本发明提供的多色荧光探针，可以单独或同时检测ClO‑或H2O2；当ClO‑和H2O2同时存在时，该荧光探针能够通过荧光比率变化识别ClO‑和/或H2O2，荧光信号间隔较大，不会出现荧光信号相互干扰情况，实现首次使用单个荧光探针能够追踪活细胞线粒体中多通道识别RAW 264.7细胞内与斑马鱼线粒体内的ClO‑和/或H2O2。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针检测领域，具体涉及一种用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
线粒体作为活细胞的动力工厂，主要具有能量供应、信号传递、细胞分化、细胞调亡等功能，并维持对细胞周期和细胞生长的控制。此外，线粒体也是有氧呼吸的主要部位，是氧化磷酸化和电子转移的最活跃的细胞器。细胞中的大多数ROS来自线粒体，这主要是线粒体氧化磷酸化产生，其中H2O2和ClO-是活性氧的重要组成部分。作为ROS家族的两个重要成员，H2O2和ClO-在正常细胞中起着关键的调节作用。然而，异常的H2O2和ClO-会引起氧化应激和相关疾病。生物体内的H2O2含量失去平衡，会造成氧化应激，导致对细胞内的脂质，蛋白质以及核酸等造成氧化损伤，进而引起各种疾病。与此同时，ClO-是由H2O2和氯离子在髓过氧化物酶(MPO)的催化作用下产生的，ClO-在维持细胞内中的氧化还原平衡状态也起着非常重要的作用。线粒体中H2O2和ClO-的异常与癌症，神经退行性变化和炎症等疾病密切相关。例如，在免疫系统中，H2O2充当信号传感器，激活巨噬细胞释放可直接杀死微生物的ClO-。线粒体及其活性种类的可视化，特定的微环境和关键的生理过程的检测，不仅有助于了解线粒体中H2O2和ClO-参与生命活动的分子机制，而且对相关疾病的治疗具有重要的指导意义。因此，设计荧光探针以选择性监测线粒体中H2O2和ClO-的浓度并实现实时成像将是重要且有价值的。与传统比色分析和气相色谱法相比，荧光探针作为一种重要的检测工具，具有出色的选择性，高灵敏度，操作简便和可视化等优点。由于荧光分析的发展，用于检测H2O2和ClO-的荧光探针的数量逐渐增加。目前已经有多篇文献报道能单独检测线粒体中H2O2和ClO-的荧光探针，但是单独检测H2O2和ClO-中的一种，无法做到检测两种物质在生物体内的相互转换，相互作用，而多种疾病的致病机理如炎症，并非单一一种小分子导致，存在多种分子存在相互作用、相互转化的情况，因此同时检测细胞内两种小分子可以进一步研究其致病机理。
目前，已报道的能够做到同时检测细胞内的次氯酸根与过氧化氢的荧光探针并不多，例如，文献(Yuchao Du,Bowei Wang.Dual-site fluorescent probe for multi-response detection of ClO-and H2O2 and bio-imaging Sens.Anal.Chim.Acta.,2020,1103,174-182)报道一种荧光探针，但是其同时检测次氯酸根与过氧化氢时，产生的荧光信号之间存在FRET效应，导致次氯酸根荧光信号明显降低，检测信号之前存在串扰，且无细胞内线粒体靶向作用。
文献(Jinliang Han,Xingjiang Liu.Investigation of the RelationshipBetween H2O2 and HClO in Living Cells by a Bifunctional,Dual-ratiometricResponsive Fluorescent Probe.Anal. Chem.；2020,92(7):5134-5142)虽然荧光性能较好，但分子量较大，且均为亲脂性基团，水溶性较差，影响实际的生物应用，且无线粒体靶向作用，无法定位检测线粒体内过氧化氢与次氯酸，而细胞内过氧化氢与次氯酸主要是由线粒体氧化磷酸化产生，因此，在应用上存在一定限制。
因此，探索一种可以用于检测线粒体内的ClO-和H2O2且在检测的过程中并不产生相互干扰，选择性和灵敏度高的荧光探针具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针(Mito-PTZ-2CN)，该探针能够靶向细胞线粒体内，并通过颜色变化单独或同时检测ClO-和H2O2，检测限低，对H2O2的检测限为23nM，对ClO-的检测限为27nM，灵敏度高和选择性好的优点。
本发明的另一目的是提供一种上述用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针(Mito-PTZ-2CN)的制备方法。
本发明的又一发明目的是提供上述多色荧光探针(Mito-PTZ-2CN)在检测ClO-和/或H2O2的应用，特别是在RAW 264.7细胞与斑马鱼线粒体内作为检测ClO-和/或H2O2的应用，该荧光探针可以单独检测线粒体内ClO-或H2O2；当ClO-和H2O2同时存在时，该荧光探针可以同时检测线粒体内ClO-和H2O2，在检测的过程中并不产生相互干扰，具有较高的检测灵敏度和选择性。
本发明的技术方案如下：
本发明以吩噻嗪作为探针的母体，同时作为探针的给电子基团和ClO-识别基团，当吩噻嗪母核与ClO-反应后，吩噻嗪中硫原子被氧化成亚砜结构，给电子能力减弱，导致荧光蓝移，产生新的荧光信号；将芳基苯硼酸频哪醇酯引入到吩噻嗪母核上，作为H2O2的识别基团，同时改变其推拉电子体系，当芳基硼酸频那醇酯与H2O2反应离去后，整体的推拉电子能力将会改变，从而导致荧光的变化，对H2O2产生新的荧光信号；引入丙二腈结构作为强吸电子基团，与吩噻嗪结构形成一个推拉电子体系，发射波长可达到670 nm，在与ClO-与H2O2响应时，留有足够的空间给予响应后的发射信号，信号之间具有足够的间隔，不会产生相互干扰的情况。
一种用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针，其探针的结构式如下所示：
本发明在探针分子式中引入线粒体靶向基团三苯基膦做到线粒体靶向，定向检测线粒体中ClO-与H2O2，再以2-甲氧基吩噻嗪为原料合成探针Mito-PTZ-2CN，分别用于检测线粒体中的ClO-与H2O2。
借助共聚焦显微镜，该探针能够对RAW 264.7的炎症模型线粒体中的ClO-与H2O2进行成像，尤其是通过荧光颜色变化观察到内源性ClO-与H2O2的生成。探针 Mito-PTZ-2CN与ClO-和H2O2反应原理如下所示：探针Mito-PTZ-2CN与ClO-和/或H2O2反应机理，Mito-PTZ-2CN本身发出红色荧光，当单独与ClO-响应后，吩噻嗪中硫原子被氧化成亚砜结构，红色荧光消失，产生绿色荧光；当单独与H2O2响应后，芳基硼酸酯基团分解掉，产生黄色荧光；当同时与ClO-和H2O2响应后，两种反应同时发生，红色荧光消失，蓝色荧光出现。
本发明还提供了识别线粒体内ClO-和/或H2O2的多色荧光探针(Mito-PTZ-2CN)的制备方法，它包括以下步骤：
进一步地，识别线粒体内ClO-和/或H2O2的多色荧光探针(Mito-PTZ-2CN)的制备方法，它包括以下步骤：
(1)在氢化钠存在的条件下，2-甲氧基吩噻嗪和1,6-二溴己烷进行化学反应制备中间体PZT-1；
(2)中间体PZT-1与POCl3进行化学反应制备中间体PZT-2；
(3)中间体PZT-2与AlCl3进行化学反应制备中间体PZT-3；
(4)在碳酸钾存在的条件下，中间体PZT-3与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯进行化学反应制备中间体PZT-4；
(5)在醋酸铵存在的条件下，中间体PZT-4与丙二腈进行化学反应制备中间体PZT-5；
(6)中间体PZT-5与三苯基膦进行化学反应制备多色荧光探针Mito-PTZ-2CN。
其中，详细的合成路线如下：
在一种优选方案中，在步骤(1)中，2-甲氧基吩噻嗪和1,6-二溴己烷的摩尔比为1:2～5，可以但不仅限于1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5或1:6，为了获得更好的效果，2-甲氧基吩噻嗪和1,6-二溴己烷的摩尔比为1:3。
进一步地，2-甲氧基吩噻嗪和氢化钠的摩尔比为1:2～8，可以但不仅限于1:2、1:2.5、 1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5或1:8，为了获得更好的效果，2-甲氧基吩噻嗪和氢化钠的摩尔比为1:3～5。
在一种优选方案中，在步骤(2)中，反应温度为70～90℃，可以但不局限于70℃、75℃、80℃、85℃或90℃，为了获得更好的效果，反应温度为80℃。
进一步地，中间体PZT-1与POCl3的质量比为1:4～6，可以但不局限于1:4.2、1:4.5、 1:4.8、1:5、1:5.2、1:5.6、1:5.8或1:6，为了获得更好的效果，中间体PZT-1与POCl3的质量比为1:5.6。
在一种优选方案中，在步骤(3)中，中间体PZT-2与AlCl3的摩尔比为1:4～8，可以但不仅限于1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5或1:8，为了获得更好的效果，中间体PZT-2与AlCl3的摩尔比为1:6。
在一种优选方案中，在步骤(4)中，反应温度为50～70℃，可以但不局限于50℃、55℃、60℃、65℃或70℃，为了获得更好的效果，反应温度为60℃。
进一步地，中间体PZT-3与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:0.5～1.2，可以但不仅限于1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1或1:1.2，为了获得更好的效果，中间体PZT-3与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:0.6。
进一步地，中间体PZT-3与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:1～3，可以但不仅限于1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.2、1:2.5或1:3，为了获得更好的效果，中间体PZT-3与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:1.5。
在一种优选方案中，在步骤(5)中，中间体PZT-4与丙二腈的摩尔比为1:1～2，可以但不仅限于1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.8或1:2，为了获得更好的效果，中间体PZT-4与丙二腈的摩尔比为1:1.2。
进一步地，中间体PZT-4与醋酸铵的摩尔比为1:0.8～1.5，可以但不仅限于1:0.8、1:0.9、 1:1、1:1.2、1:1.3或1:1.5，为了获得更好的效果，中间体PZT-4与醋酸铵的摩尔比为1:1。
在一种优选方案中，在步骤(5)中，反应温度为70～90℃，可以但不局限于70℃、75℃、80℃、85℃或90℃，为了获得更好的效果，反应温度为80℃。
进一步地，中间体PZT-5与三苯基膦的摩尔比为1:8～12，可以但不仅限于1:8、1:9、 1:9.5、1:10、1:10.5、1:11或1:12，为了获得更好的效果，中间体PZT-5与三苯基膦的摩尔比为1:10。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供一种识别线粒体内ClO-和/或H2O2的多色荧光探针(Mito-PTZ-2CN)，具有线粒体靶向能力，可以定向监测线粒体内的ClO-和H2O2，并在不同荧光通道成像，可以单独或同时检测ClO-或H2O2；当ClO-和H2O2同时存在时，该荧光探针能够通过荧光比率变化识别ClO-和/或H2O2，荧光信号间隔较大，不会出现荧光信号相互干扰情况，实现首次使用单个荧光探针能够追踪活细胞线粒体中多通道识别RAW 264.7细胞内与斑马鱼线粒体内的ClO-和/或H2O2。
附图说明
图1是化合物PTZ-1的1H NMR；
图2是化合物PTZ-1的13C NMR；
图3是化合物PTZ-2的1H NMR；
图4是化合物PTZ-2的13C NMR；
图5是化合物PTZ-4的1H NMR；
图6是化合物PTZ-4的13C NMR；
图7是化合物PTZ-4的MS，m/z calcd for C32H37O4BBrNS[M+H]+,621.2,found622.9；
图8是探针Mito-PTZ-2CN的1H NMR；其中，下方的小图为上方1H NMR图谱在 7.0-8.0的局部放大图；
图9是探针Mito-PTZ-2CN的13C NMR；
图10是探针Mito-PTZ-2CN分别与次氯酸根和/或过氧化氢响应的紫外吸收光谱；
图11是探针Mito-PTZ-2CN与次氯酸根反应后生成物的MS，m/z calcd forC51H52BN3O4SP[M+Mg]+,869.4,found 869.2；
图12是探针Mito-PTZ-2CN与过氧化氢反应后生成物的MS，m/z calcd forC40H35N3OSP[M+H]+,637.2,found 637.2；
图13是探针Mito-PTZ-2CN与次氯酸根和过氧化氢反应后生成物的MS，m/z calcdfor C40H35N3O2SP[M+H]+,651.2,found 651.5；
图14为探针Mito-PTZ-2CN与ClO-和H2O2反应原理；
图15是探针Mito-PTZ-2CN与H2O2孵育120min与I580nm荧光强度变化的线性关系，其中，图15中A为探针Mito-PTZ-2CN(10μM)与H2O2(0、1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40μM)在37℃孵育120min的荧光光谱，其中H2O2的浓度在0-10μM呈良好的线性关系；图15中B为探针Mito-PTZ-2CN(10μM)与H2O2(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40μM)在37℃孵育120min，580nm荧光强度变化的趋势；图15中C为探针Mito-PTZ-2CN(10μM)与H2O2(0-10μM)在37℃孵育120min，580nm荧光强度变化的线性方程；
图16是探针Mito-PTZ-2CN与ClO-孵育30s与I520nm荧光强度变化的线性关系，其中，图16中A为探针Mito-PTZ-2CN(10μM)与ClO-(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、12、14、16、18、20、25、30、35、40μM)在37℃孵育30s的荧光光谱，其中ClO-的浓度在0-10μM呈良好的线性关系；图16中B为探针Mito-PTZ-2CN(10μM)与ClO-(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40μM)在 37℃孵育30s，520nm荧光强度变化的趋势；图16中C为探针Mito-PTZ-2CN(10μM)与ClO-(0-10μM)在37℃孵育120min，520nm荧光强度变化的线性方程；
图17是探针Mito-PTZ-2CN与ClO-孵育30s后，再与H2O2孵育120min的荧光光谱与I450nm荧光强度变化的线性关系，其中，图17中A为探针Mito-PTZ-2CN(10μM)与ClO-(40μM)孵育30s后，再与H2O2(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、 16、18、20、25、30、35、40μM)在37℃孵育120min的荧光光谱，其中H2O2的浓度 0-10μM呈良好的线性关系；图17中B为探针Mito-PTZ-2CN(10μM)与ClO-(40μM)孵育1min后，再与H2O2(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、 25、30、35、40μM)在37℃孵育120min，450nm荧光强度变化的趋势；图17中C为探针Mito-PTZ-2CN(10μM)与ClO-(40μM)孵育1min后，再与H2O2(0-10μM)在37℃孵育120min，450nm荧光强度变化的线性方程；
图18是探针Mito-PTZ-2CN与H2O2孵育120min后，再与ClO-孵育30s的荧光光谱与I450nm荧光强度变化的线性关系，其中，图18中A为探针Mito-PTZ-2CN(10μM)与 H2O2(40μM)孵育120min后，再与ClO-(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、 14、16、18、20、25、30、35、40μM)在37℃孵育30s的荧光光谱，其中ClO-的浓度0-10μM 呈良好的线性关系；图18中B为探针Mito-PTZ-2CN(10μM)与H2O2(40μM)孵育120min 后，再与ClO-(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、 35、40μM)在37℃孵育30s，450nm荧光强度变化的趋势；图18中C为探针Mito-PTZ-2CN (10μM)与H2O2(40μM)孵育120min后，再与ClO-(0-10μM)在37℃孵育30s，450nm 荧光强度变化的线性方程；
图19是在存在其他干扰物质的情况下，探针Mito-PTZ-2CN(10μM)在450nm，520nm，570nm和670nm的荧光发射强度，干扰物质其他活性氧活性氮，金属离子，氨基酸(50.0当量，孵育120分钟)；
图20是不同浓度探针Mito-PTZ-2CN与RAW 264.7细胞孵育24小时的细胞存活率；
图21是探针Mito-PTZ-2CN和Mito tracker Green RAW 264.7细胞中的共定位成像：图21中A为来自绿色通道(线粒体染色)，图21中B为来自红色通道(Mito-PTZ-2CN)，图21中C为绿色、红色和明场通道的合并，图21中D部分线性区域在RAW 264.7细胞上的强度分布和图20中E为绿色和红色通道的强度散点图；
图22是探针Mito-PTZ-2CN(5μM)在RAW 264.7细胞中与外源性ClO-/H2O2成像图；
图23是探针Mito-PTZ-2CN(5μM)在RAW 264.7细胞中与内源性ClO-/H2O2成像图；
图24是探针Mito-PTZ-2CN和Mito tracker Green斑马鱼的共定位成像；
图25是探针Mito-PTZ-2CN(5μM)在斑马鱼中与外源性ClO-/H2O2成像图。
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明的用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
一、实施方法
1、材料与仪器
MTT细胞增殖/毒性检测试剂盒(Biosharp公司)；Gibco DMEM高糖培养基(美国Life Technologies公司)；Gibco胎牛血清(美国Life Technologies公司)；薄层色谱使用GF254硅胶板(250μm)，柱层析使用300-400目的硅胶(青岛海洋化工)；其余试剂都是国产分析纯。
细胞：
RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞。
动物：
斑马鱼
仪器：
ECZ-400S核磁共振仪(日本JEOL公司)；YRT-3型熔点测定仪(天津市天大天发科技有限公司)；质谱仪(maXisTM 4G UHR-TOF德国Bruker公司)；细胞培养箱(美国ThermoFisher Scientific公司)；酶标仪(Clinibio公司Thermo Fisher Scientific,Finland)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；PB-21型pH计(德国Sartorius公司)；PharmaSpecUV-2401PC紫外分光光度计(日本Shimadzu公司)；SHB-IIIS循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；RTC basic磁力搅拌器(德国IKA公司)；F-4600荧光分光光度计(日本日立高新技术公司)； RE-2000B旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。
2.实验方法
(1)MTT实验
取对数生长期的细胞以3-5×104cells/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL细胞悬液，在37℃，5％CO2条件的恒温培养箱孵育24h。吸弃培养基，将化合物配制成7个浓度梯度(1μM、2μM、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM)，每孔加入100μL化合物溶液，孵育24h。孵育结束后，用1mL注射器吸取96孔板内的培养基，各孔避光加入100μL含MTT的基础培养基(MTT终浓度为0.5mg/ml)，培养箱避光孵育4h，孵育结束后，用1mL注射器吸取培养基，每孔加100μLDMSO溶液，置摇床上低速震摇10min 使甲瓒充分溶解。酶标仪测定550nm波长处的吸光度(OD)值，用空白孔(培养基+MTT)校准吸光度值，按以下公式计算各组细胞存活率：细胞相对存活率(％)＝(实验组OD 值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100％。实验重复3次以上，数据表示为mean±SD。
(2)造细胞炎症模型
小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7为贴壁生长细胞，常规培养于含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM高糖完全培养基中，置于37℃，5％CO2 培养箱中培养。当细胞处于对数生长期时，将脂多糖(LPS)和PMA加入至培养液中，使其终浓度都为2μg/ml，共同培养12h。当细胞成为多角形态以及伪足数量增加，即造模成功。
二、实施例
1.1中间体PTZ-1的合成
取50mL DMF倒入250mL茄形瓶中，将2-甲氧基吩噻嗪(3.43g,15mmol)加入其中，搅拌溶解，加入60％氢化钠(1.8g，45mmol)冰浴搅拌3h后，室温继续搅拌1 h，加入1,6-二溴己烷(10.845g，45mmol)，室温反应4h，TLC检测。
后处理：反应完全后，将反应液缓慢倒入100mL冷水中，搅拌除去多余氢化钠，加入乙酸乙酯(3*100mL)萃取，合并有机相，用饱和食盐水多次洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析分离(石油醚:乙酸乙酯＝20:1)，得无色油状物，产率80％。其中，PTZ-1 的1HNMR和13C NMR如图1和2所示。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.13(t,J＝8.4Hz, 2H),7.02(t,J＝8.8Hz,1H),6.88(d,J＝8.4Hz,2H),6.47(d,J＝8.8Hz,2H),3.78(s,5H), 3.36(t,J＝6.8Hz,2H),1.82(t,J＝6.4Hz,4H),1.44(m,4H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ 159.8,127.6,127.2,122.7,115.9,103.6,55.6,34.0,32.7,27.9,26.5,26.1.HRMS m/z calcd forC19H22OBrNS[M+H]+392.0678,found 392.0651.
1.2中间体PTZ-2的合成
制备V-H试剂：冰浴条件下，将8mL DMF与13mL POCl3(22g)加入250mL茄形瓶中，搅拌30min，溶液变为粉红色，V-H制备完成。
将中间体PTZ-1(3.91g，10mmol)溶于15mL 1,2-二氯乙烷中后，将其缓慢滴加入上述制备完成的V-H试剂中，加热至80℃，过夜反应，TLC检测。
后处理：将反应液降至室温，缓慢倒入300mL冷水中，使用1.5L乙酸乙酯多次萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，有机相采用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析纯化(石油醚:二氯甲烷＝20:1)得到黄色固体，产率80％。其中，PTZ-2的1H NMR 和13C NMR如图3和4所示。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.20(s,1H),7.54(s,1H),7.14 (q,J＝7.6Hz,2H),6.96(t,J＝7.6Hz,1H),6.87(d,J＝7.6Hz,1H),6.36(s,1H),3.90(s,5H), 3.49(t,J＝7.2Hz,2H),1.84(s,2H),1.74(t,J＝6.4Hz,2H),1.46(s,4H).13C NMR(100MHz, CDCl3):δ187.4,162.7,127.7,127.4,127.1,123.7,116.2,98.8,55.9,47.9,45.0,33.9,32.4, 27.7,26.5,26.1.HRMS m/z calcd for C20H22O2BrNS[M+Na]+442.0447,found 442.0446.
1.3中间体PTZ-3的合成
将中间体PTZ-2(426mg，1mmol)溶于15mL无水二氯甲烷中，冰浴下搅拌5min 后，加入6倍当量的无水氯化铝(798mg，6mmol)，氮气保护，室温反应48h，TLC 检测(取10μL反应液，加入20μL 3NHCl，0.5mL水，摇晃3min后，加入1mL乙酸乙酯，摇晃后使其自然分层)。
后处理：反应液中加入2mL 3N HCl，10mL水继续搅拌30min，溶液呈酸性后加入50mL乙酸乙酯，30mL水进行多次萃取，合并有机相，用无水硫酸钠进行干燥，减压浓缩，柱层析分离(乙酸乙酯:石油醚＝1:30)得到黄色油状物，产率20％。1H NMR(400MHz, CDCl3):δ11.37(s,1H),9.57(s,1H),7.25-7.09(m,3H),6.98-6.86(m,2H),6.36(t,J＝14.4 Hz,1H),3.82(t,J＝14.4Hz,2H),3.49(t,J＝6.8Hz,2H),1.82-1.70(m,2H),1.43(t,J＝3.6 Hz,2H),1.25(t,J＝4.8Hz,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ193.1,163.2,153.3,142.5, 131.1,130.3,127.6,123.9,116.3,114.7,103.0,48.1,45.0,32.5,26.5,26.1.合成方法来源于参考文献(Jinliang Han,Xingjiang Liu.Investigation of the Relationship BetweenH2O2 and HClO in Living Cells by a Bifunctional,Dual-ratiometric ResponsiveFluorescent Probe.Anal. Chem.；2020,92(7):5134-5142)。
1.4中间体PTZ-4的合成
将中间体PTZ-3(206mg，0.5mmol)、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(180mg，0.6mmol)溶于10mL无水乙腈中，加入碳酸钾(207mg，1.5mmol)，加热至60℃反应12h，TLC 检测(二氯甲烷:甲醇＝30:1)。反应完全后，将反应液冷却至室温，倒入50mL冷水中，用30mL乙酸乙酯分三次萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析分离(二氯甲烷:甲醇＝20:1)得到黄色固体，产率约为70％。其中，PTZ-2的1H NMR、13C NMR 和MS，如图5、6和7所示。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ10.30(s,1H),7.83(d,J＝8.0Hz, 2H),7.56(s,1H),7.41(d,J＝8.0Hz,2H),7.127-7.089(m,2H),6.94(t,J＝7.6Hz,1H),6.83 (d,J＝7.6Hz,1H),6.33(s,1H),5.21(s,2H),3.77(t,J＝7.2Hz,2H),3.49(t,J＝7.2Hz,2H), 1.73-1.60(m,4H),1.41-1.30(m,14H),0.86-0.84(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ 187.3,161.7,152.1,143.1,139.2,135.4,127.7,127.4,126.9,126.2,123.7,120.1,116.1,100.5, 84.0,70.7,47.9,45.0,32.4,26.6,26.4,26.1,25.0.MS m/z calcd for C32H37O4BBrNS[M+H]+ 622.4,found622.9。
1.5中间体PTZ-5的合成
将中间体PTZ-4(314mg，0.5mmol)搅拌溶于20mL无水乙醇中，加入醋酸铵(38.5mg，0.5mmol)，丙二腈(40mg，0.6mmol)，室温搅拌2h，由红色沉淀产生，过滤得红色固体，即得到中间体PTZ-5，产率90％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.01(s,1H),7.98(s, 1H),7.85(d,J＝8.0Hz,2H),7.35(d,J＝8.4Hz,2H),7.16-7.07(m,2H),6.98-6.94(m,1H), 6.83(d,J＝7.6Hz,1H),6.28(s,1H),5.19(s,2H),3.78-3.70(m,2H),3.49(t,7.2Hz,2H), 1.74-1.60(m,4H),1.37-1.30(m,16H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ159.4,152.7,150.8, 142.2,138.4,135.6,127.8,127.6,126.4,126.2,124.3,124.1,116.9,116.3,115.6,115.1,114.3,99.8,84.1,75.6,71.2,48.1,44.9,32.4,26.5,26.4,26.0,25.0.MS m/z calcd forC35H37O3BBrN3S[M+H]+670.4,found 670.0。
1.6 Mito-PTZ-2CN的合成
将中间体PTZ-5(350mg，0.5mmol)搅拌溶于20mL无水乙腈中，加入三苯基膦(1315mg，5mmol)，将反应液加热到80℃，反应两天，TLC检测(二氯甲烷:甲醇＝20:1)。
后处理：将反应液蒸干，加入200mg硅胶治沙，柱层析分离(二氯甲烷:甲醇＝20:1)，得到红色固体，产率约10％。其中，探针Mito-PTZ-2CN的1H NMR和13C NMR，如图8和9所示。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.01(s,1H),7.98(s,1H),7.84(d,J＝8.0Hz,2H), 7.74-7.68(m,9H),7.64-7.60(m,6H),7.35(d,J＝8.4Hz,2H),7.16-7.07(m,2H),6.98-6.94(m, 1H),6.83(d,J＝7.6Hz,1H),6.28(s,1H),5.19(s,2H),3.78-3.70(m,2H),3.49(t,J＝7.2Hz,2H),1.74-1.60(m,4H),1.37-1.30(m,16H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ159.4,152.7,150.8,142.2,138.4,135.6,134.7,132.6,127.8,127.6,126.4,126.2,124.3,124.1,116.9,116.3, 115.6,115.1,114.3,99.8,84.1,75.6,71.2,48.1,44.9,32.4,26.5,26.4,26.0,25.0.MS m/z calcd for C53H52O3BN3SP[M+H]+853.3,found 853.2。
三、效果验证
1、探针Mito-PTZ-2CN的光学性能检测
1.1探针Mito-PTZ-2CN对与H2O2和ClO-响应的吸收光谱研究
如图10所示，探针本身在450和300有很强的吸收峰。当探针与过氧化氢反应时，探针在450和300的吸收峰明显减弱，这是由于芳基苯硼酸酯基团被氧化脱去导致，产物的MS图见图12。当探针与次氯酸反应时，探针在450和300处的吸收峰减弱，由于形成亚砜结构，因此，在390nm处出现新的吸收峰，产物的MS图见图11。当探针同时与次氯酸和过氧化氢反应时，探针在450和300处的吸收峰减弱，探针在390nm处有吸收峰，由于芳基苯硼酸酯基团被氧化脱去同时形成亚砜结构导致，产物的MS图见图13，这一实验结果侧面验证了探针的反应机理，反应机理如图14所示。
1.2探针Mito-PTZ-2CN对与H2O2和ClO-响应的浓度线性关系
为了研究探针Mito-PTZ-2CN是否能用于ClO-与H2O2的定量检测，测定了探针Mito-PTZ-2CN(10μM)与不同浓度的ClO-(0-40μM)和H2O2(0-40μM)在37℃恒温水浴锅中孵育120min之后的荧光光谱变化，以此探讨荧光强度与ClO-与H2O2浓度之间的关系。如图15-18所示，随之ClO-与H2O2浓度的增加，探针Mito-PTZ-2CN的荧光强度不断增大，探针荧光强度与底物0-40μM具有较好的线性关系，可以做到定量检测ClO-与H2O2，通过ClO-与H2O2线性相关曲线(R2＝0.995，0.997)，计算ClO-与H2O2检测限分别为27nM与23nM(3σ/k)，证明Mito-PTZ-2CN用于追踪细胞内的ClO-与H2O2。其中，探针Mito-PTZ-2CN与次氯酸根反应后生成物、探针Mito-PTZ-2CN与过氧化氢反应后生成物的MS以及探针Mito-PTZ-2CN与次氯酸根和过氧化氢反应后生成物的MS，分别如图10、11和12所示。
1.3探针Mito-PTZ-2CN的抗干扰能力
在复杂的生物背景下，衡量探针Mito-PTZ-2CN能否成功的最重要的指标是探针对ClO-与H2O2的特异性识别能力。为了验证探针Mito-PTZ-2CN在复杂的生物背景干扰下，是否对ClO-与H2O2具有高选择性，通过检测探针与其他活性氧、活性氮、氨基酸、金属离子等干扰物质存在下的荧光光谱情况。如图19所示，探针Mito-PTZ-2CN在多种干扰物质存在下，只对ClO-与H2O2进行响应，而与其他物质不响应，且在高浓度干扰物质存在下，探针Mito-PTZ-2CN分别与ClO-和H2O2响应之后而荧光强度基本没有改变，说明探针具有较好的选择性，不受其它物质干扰，能够特异性识别ClO-与H2O2。
2、细胞荧光实验
2.1细胞毒性实验
在探针Mito-PTZ-2CN检测细胞内ClO-与H2O2的荧光成像实验之前，必须先对其进行细胞毒性试验，确定对细胞无损伤的合适探针浓度，以应用于活细胞成像试验。如图20所示，在不同浓度(1，2，5，10μM)探针Mito-PTZ-2CN孵育24h后，小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)的存活率与对照组相比并没有明显变化，即使Mito-PTZ-2CN浓度在100μM，细胞存活率在80％左右。说明探针Mito-PTZ-2CN在0-100μM范围内对RAW 264.7细胞基本没有毒性，生物兼容性较好。结合相关实验，确定探针Mito-PTZ-2CN的使用浓度为5μM。
2.2 Mito-PTZ-2CN与Mito tracker Green细胞共定位实验
三苯基膦作为线粒体的靶向基团，可以显着增加探针在线粒体中富集的可能性。验证探针Mito-PTZ-2CN是否具有线粒体靶向作用，将探针与市售线粒体靶向探针Mitotracker Green进行共定位实验。如图21所示，其中图21中A为市售线粒体靶向探针Mitotracker Green对RAW 264.7细胞的成像，图21中B为探针Mito-PTZ-2CN成像图，图21中C 为成叠图像，来自探针Mito-PTZ-2CN红色通道的荧光信号与Mito tracker Green的荧光重叠较好。图21中D部分线性区域在RAW 264.7细胞上的强度分布和图21中E为绿色和红色通道的强度散点图皮尔逊的共定位系数(描述了两个通道之间的强度分布的相关性)分别计算为0.92，证实了Mito-PTZ-2CN在活细胞线粒体中的定位。
2.3 Mito-PTZ-2CN与细胞外源性H2O2与ClO-成像实验
如图22所示，探针Mito-PTZ-2CN(5μM)预处理细胞20min后，激光共聚焦成像结果显示，细胞在蓝色、绿色与黄色通道基本无荧光，红色通道有明显荧光出现，此为探针本身荧光；探针Mito-PTZ-2CN(5μM)预处理细胞20min后，加入ClO-(500μM)继续孵育20min，激光共聚焦成像结果显示，细胞在蓝色、黄色与红色通道基本无荧光，绿色通道有明显荧光出现；探针Mito-PTZ-2CN(5μM)预处理细胞20min后，加入H2O2(500μM)继续孵育1h，激光共聚焦成像结果显示，细胞在其他通道基本无荧光，黄色通道有明显荧光出现；探针Mito-PTZ-2CN(5μM)预处理细胞20min后，加入ClO-(500 μM)继续孵育20min后，再加入H2O2(500μM)继续孵育1h，激光共聚焦成像结果显示，细胞在其他通道基本无荧光，蓝色通道有明显荧光出现；探针Mito-PTZ-2CN(5μM)预处理细胞20min后，加入H2O2(500μM)继续孵育1h后，再加入ClO-(500μM)继续孵育20min，激活共聚焦成像结果显示，细胞在其他通道基本无荧光，蓝色通道有明显荧光出现。
2.4 Mito-PTZ-2CN与细胞内源性H2O2与ClO-成像实验
如图23所示，在炎症模型RAW 264.7细胞中，蓝色通道有明显荧光出现，而加入氧化剂清除剂的细胞中，红色通道有荧光出现，结果说明探针可以识别炎症模型RAW 264.7细胞中的H2O2与ClO-。
2.5 Mito-PTZ-2CN与Mito tracker Green斑马鱼共定位实验
将探针与市售线粒体靶向探针Mito tracker Green在3-5天斑马鱼进行共定位实验。如图24所示，其中b为市售线粒体靶向探针Mito tracker Green对3-5天斑马鱼的成像图， a为探针Mito-PTZ-2CN成像图，c为斑马鱼明场成像图，d为成叠图像，e为d图中斑马鱼腹部放大图，来自探针Mito-PTZ-2CN红色通道的荧光信号与Mito tracker Green的荧光重叠较好。斑马鱼腹腔显示出强烈的荧光。该结果表明，探针Mito-PTZ-2CN可用于活生物体中的线粒体成像。
2.6 Mito-PTZ-2CN与斑马鱼外源性H2O2与ClO-成像实验
此外，我们还研究了Mito-PTZ-2CN在活体高等动物斑马鱼中对外源性的H2O2与ClO-成像。如图25所示，当单独将探针Mito-PTZ-2CN(5μM)与斑马鱼孵育20min时，在红色通道有明显荧光，为探针本身荧光；探针与斑马鱼孵育20min后，再加入次氯酸钠(500μM)孵育30min，在绿色通道有明显荧光；探针与斑马鱼孵育20min后，再加入 H2O2(500μM)孵育120min，在蓝色与黄色色通道有明显荧光；探针与斑马鱼孵育20min 后，不同循序再加入次氯酸钠(500μM)与H2O2孵育120min后，在蓝色通道有明显荧光。本实验表明探针Mito-PTZ-2CN可以在活体动物斑马鱼中对外源性的次氯酸与H2O2进行成像。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针，其探针的结构式如下所示：
2.权利要求1所述的用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)在氢化钠存在的条件下，2-甲氧基吩噻嗪和1,6-二溴己烷进行化学反应制备中间体PZT-1；
(2)中间体PZT-1与POCl3进行化学反应制备中间体PZT-2；
(3)中间体PZT-2与AlCl3进行化学反应制备中间体PZT-3；
(4)在碳酸钾存在的条件下，中间体PZT-3与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯进行化学反应制备中间体PZT-4；
(5)在醋酸铵存在的条件下，中间体PZT-4与丙二腈进行化学反应制备中间体PZT-5；
(6)中间体PZT-5与三苯基膦进行化学反应制备多色荧光探针Mito-PTZ-2CN。
4.根据权利要求2所述的用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述2-甲氧基吩噻嗪和1,6-二溴己烷的摩尔比为1:2～5，优选为1:3；所述2-甲氧基吩噻嗪和氢化钠的摩尔比为1:2～8，优选为1:3～5。
5.根据权利要求2所述的用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，反应温度为70～90℃，优选为80℃；所述中间体PZT-1与POCl3的质量比为1:4～6，优选为1:5.6；在步骤(3)中，所述中间体PZT-2与AlCl3的摩尔比为1:4～8，优选为1:6。
6.根据权利要求2所述的用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，反应温度为50～70℃，优选为60℃；所述中间体PZT-3与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:0.5～1.2，优选为1:0.6；所述中间体PZT-3与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的摩尔比为1:1～3，优选为1:1.5。
7.根据权利要求2所述的用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述中间体PZT-4与丙二腈的摩尔比为1:1～2，优选为1:1.2；所述中间体PZT-4与醋酸铵的摩尔比为1:0.8～1.5，优选为1:1。
8.根据权利要求2所述的用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，反应温度为70～90℃，优选为80℃；所述中间体PZT-5与三苯基膦的摩尔比为1:8～12，优选为1:10。
9.权利要求1所述的用于检测线粒体内ClO-/H2O2的多色荧光探针作为检测ClO-和/或H2O2的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的多色荧光探针在RAW 264.7细胞与斑马鱼线粒体内作为检测ClO-和/或H2O2的应用。
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| CN114195774A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-03-18 | 徐州医科大学 | 一种具有次氯酸激活荧光和线粒体靶向功能的光敏剂及其制备方法和应用 |
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2022
- 2022-08-18 CN CN202210991302.4A patent/CN115368415B/zh active Active
Patent Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN109942609A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-06-28 | 南京师范大学 | 一种过氧亚硝酸盐近红外荧光探针onp及其制备方法和应用 |
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