CN110927132B - 一种用于定量检测血清中alp的比率型荧光探针的制备方法 - Google Patents

一种用于定量检测血清中alp的比率型荧光探针的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于定量检测血清中ALP的比率型荧光探针的制备方法，（1）合成发射红色荧光的CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs；（2）ALP催化磷酸酪氨酸生成酪氨酸，酪氨酸酶催化反应生成的酪氨酸为左旋多巴，左旋多巴与间苯二酚反应生成发射蓝色荧光的物质CAZMON；（3）CAZMON与CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs发生内滤效应，使CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs的荧光被猝灭，根据CAZMON和CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs两者荧光强度的比值对ALP的浓度绘制标准曲线，测定的样品根据标准曲线法对ALP的浓度进行定量检测，该方法灵敏度高、选择性好、检测简便。

Description

一种用于定量检测血清中ALP的比率型荧光探针的制备方法
技术领域
本发明属纳米材料、荧光传感技术和生物分析检测领域，具体涉及基于量子点的比率荧光传感平台定量测定血清中碱性磷酸酶(ALP)的方法。
背景技术
碱性磷酸酶(ALP)是生物系统中的一种非特异性的水解酶。ALP能够催化水解不同底物的磷酸基团，如：核酸、蛋白质、小分子物质等等，并且在细胞增殖、凋亡和信号转导方面发挥着重要作用。血清中异常的ALP水平与多种疾病密切相关。具体来说，血清中低表达ALP与一些代谢紊乱疾病相关，而血清中高表达ALP则与肝功能不全、骨疾病(成骨细胞瘤、软骨病)、前列腺癌和糖尿病密切相关。因此，发展一种灵敏的、选择性高的方法定量检测血清中ALP水平是极其重要的。
近年来，已有许多检测ALP的方法被报道，包括化学发光法、电化学法、表面增强拉曼散射法、比色法和荧光法。其中，电化学法和表面增强拉曼散射建立完好但步骤复杂。比色法简单高效，但是大部分方法依赖于紫外方法(TMB或AuNPs)，存在着灵敏度低的特点。目前，对于建立检测ALP荧光方法的探索已经取得了较大的进步。荧光方法灵敏度高，价格低廉，简单且信号易读。其中，单发射荧光探针易受不同种类环境因素的影响如检测条件、荧光探针的浓度。但是，比率荧光探针能够通过提供内参来降低分析物非依赖干扰信号。另外，比率荧光探针能够展现荧光颜色的变化，这有利于现场检测与诊断。据我们所知，目前还没有发展一种比率荧光探针用于可视化检测ALP的活性。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种用于定量检测血清中ALP的比率型荧光探针的制备方法，基于量子点的比率荧光传感平台，具有灵敏度高、选择性好、检测简便的优点，大大减少了来自探针浓度，光源，仪器效率和测量条件的干扰，可以直接应用于血清中ALP的检测。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于定量检测血清中ALP的比率型荧光探针的制备方法，步骤如下：
(1)、由于所合成的CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs需要与反应生成的CAZMON发生内滤效应，那么就必须要求我们合成的量子点的激发光谱与CAZMON的紫外吸收光谱有重叠，同时量子点在加入CAZMON前后荧光寿命需要保持一致。因此，我们选择了根据以下参考文献来合成量子点(F.D.Wei,G.H.Xu,Y.Z.Wu,X.Wang,J.Yang,L.P.Liu,P.Zhou,Q.Hu,Molecularly imprinted polymers on dual-color quantum dots for simultaneousdetection of norepinephrine and epinephrine,Sens.Actuators B:Chem.229(2016)38-46)合成发射红色荧光的CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs：将NaHTe溶液与Cd2+，MPA混合反应制备CdTe QDs。然后加入CdAc2·2.5H2O,ZnSO4·7H2O和MPA反应30min，接着加入Na2S反应，最后加入TEOS反应，生成发射红色荧光的CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs。
(2)、生成发射蓝色荧光的CAZMON：将ALP与底物磷酸酪氨酸以及酪氨酸酶共同孵育生成左旋多巴，加入间苯二酚使其与左旋多巴反应生成发射蓝色荧光的物质CAZMON，其发射波长范围在450-490nm。
ALP与磷酸酪氨酸和酪氨酸酶的共孵育时间为0.5-3.0h，所用磷酸酪氨酸的浓度为200-800μM，所用酪氨酸酶的浓度为1-5U/mL，所用间苯二酚的浓度为0.3-0.9mM。
(3)、制备比率型荧光探针：将步骤(1)所得的发红色荧光的CdTe/CdS/ZnS/SiO2QDs与步骤(2)所得的发蓝色荧光的CAZMON混合，CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs的红色荧光被CAZMON猝灭，得到随着ALP浓度增加，蓝色荧光逐渐增强红色荧光逐渐减弱的比率型荧光探针；
所用CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs浓度为0.5-1.0mg/mL。
(4)、根据荧光产物CAZMON和CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs在470nm及620nm处的荧光强度的比值对ALP的浓度绘制标准曲线；
(5)、检测ALP：在PBS缓冲溶液稀释的血清中加入磷酸酪氨酸以及酪氨酸酶共孵育，再加入间苯二酚，孵育后加入步骤(1)中的CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs，测定探针的蓝色荧光与红色荧光的比值，根据标准曲线，得到血清中ALP的含量。
本发明定量检测血清中的ALP活性的原理是：
首先，ALP催化水解磷酸酪氨酸为酪氨酸，酪氨酸酶催化反应生成的酪氨酸为左旋多巴，左旋多巴与间苯二酚可在碱性条件下反应生成发射蓝色荧光的物质CAZMON，加入发射红色荧光的CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs后，由于内滤效应的作用，CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs的红色荧光被CAZMON猝灭，因此可以得到随着ALP的浓度增加，蓝色荧光逐渐增强红色荧光逐渐减弱的比率荧光探针，其蓝色荧光和红色荧光的比值与ALP浓度有关。
有益效果：本发明利用ALP和酪氨酸酶的酶级联反应生成的左旋多巴与间苯二酚产生发蓝色荧光的CAZMON，猝灭红色量子点的荧光，构成比率荧光探针，其蓝色荧光与红色荧光的强度比与ALP浓度有关，因此可用于检测ALP的活性。与传统的单信号检测方法相比，具有灵敏度高、选择性好、检测简便的优点，并且可以减少来自探针浓度，光源，仪器效率和测量条件的干扰，可以直接应用于血清中ALP的检测。整个检测过程环保、安全、方便。
附图说明
图1A是实施例1制备得到的CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs的透射电子显微镜图；如图所示，QDs粒径约在4nm(图中标尺为10nm)。
图1B是实施例1制备得到的QDs在不同激发波长下的荧光发射图；如图所示，QDs荧光发射波长在600-640nm，且发射波长不随激发波长的改变而变化。
图2是实施例2中的CAZMON在不同激发波长下的荧光发射图；如图所示，CAZMON荧光发射波长在450-490nm，且发射波长不随激发波长的改变而变化。
图3是实施例2中磷酸酪氨酸的浓度优化图；如图所示，随着磷酸酪氨酸浓度的增大，荧光强度逐渐增大然后趋于稳定。
图4是实施例2中酪氨酸酶的浓度优化图。如图所示，随着酪氨酸酶浓度的增大，荧光强度逐渐增大然后再减小。
图5是实施例2中间苯二酚的浓度优化图。如图所示，随着间苯二酚浓度的增大，荧光强度逐渐增大然后再减小。
图6是实施例2中反应时间的浓度优化图。如图所示，随着反应时间的延长，荧光强度逐渐增大然后趋于稳定。
图7是实施例3中QDs的浓度优化图。如图所示，随着ALP的浓度逐渐增加，荧光颜色呈现由红至蓝的变化，且从A图到D图，QDs浓度逐渐增加，红色荧光逐渐增强。
图8A是实施例4中ALP浓度与比率荧光探针的荧光变化荧光图；如图所示，随着ALP浓度的增大，比率荧光探针的蓝色荧光逐渐增强，红色荧光逐渐减弱。
图8B是实施例4中ALP浓度与比率荧光探针的蓝色荧光与红色荧光比值的相关图；如图所示，随着ALP浓度的增大比率荧光探针的蓝色荧光与红色荧光比值逐渐增大，在0.08-500U/L范围内，ALP的浓度与比率荧光探针的蓝色荧光与红色荧光比值呈线性相关，线性回归方程为F＝0.0752CALP+0.4369，相关系数r2＝0.9970。
具体实施方式
氯化铬、3-巯基丙酸、碲粉、NaBH4(硼氢化钠)、磷酸酪氨酸、左旋多巴、间苯二酚(阿拉丁试剂有限公司)；ALP(碱性磷酸酶)、酪氨酸酶(西格玛奥德里奇贸易有限公司)。
实施例1发射红色荧光的CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs的合成，步骤如下：
将新鲜制备的除去氧气的NaHTe溶液引入至N2饱和的Cd2+溶液中，再加入MPA。混合物90℃回流8h来制备CdTe QDs。然后，将CdTe QDs引入至N2饱和的三颈瓶中，接着加入包含CdAc2·2.5H2O,ZnSO4·7H2O和MPA的混合溶液，在剧烈搅拌下反应30min。然后缓慢滴加Na2S溶液，混合溶液在90℃下反应。最后，加入TEOS在90℃下反应来获得CdTe/CdS/ZnS/SiO2QDs。其透射电镜图如图1A所示，其不同激发波长下的荧光发射光谱如图1B所示。
实施例2反应生成的CAZMON的荧光性能的考察，步骤如下：
将ALP与磷酸酪氨酸以及酪氨酸酶共孵育生成左旋多巴，左旋多巴与间苯二酚反应生成发射蓝色荧光的物质CAZMON，其不同激发下的荧光发射光谱如图2所示。
实施例3考察底物磷酸酪氨酸的浓度对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将ALP与酪氨酸酶分散在Tris-HCl缓冲溶液中，加入不同浓度的底物磷酸酪氨酸(0-750μM)共孵育，然后加入间苯二酚，测定探针的蓝色荧光强度，考察底物磷酸酪氨酸浓度对目标物响应的影响，结果如图3所示。
实施例4考察酪氨酸酶的浓度对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将ALP和酪氨酸酶(0-23U/mL且大于0)分散在Tris-HCl缓冲溶液中，加入底物磷酸酪氨酸共孵育，然后加入间苯二酚，测定探针的蓝色荧光强度，考察酪氨酸酶浓度对目标物响应的影响，结果如图4所示。
实施例5考察间苯二酚的浓度对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将ALP和酪氨酸酶分散在Tris-HCl缓冲溶液中，加入底物磷酸酪氨酸共孵育，然后加入间苯二酚(0.05-1.5mM)，测定探针的蓝色荧光强度，考察间苯二酚浓度对目标物响应的影响，结果如图5所示。
实施例6考察反应时间对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将ALP和酪氨酸酶分散在Tris-HCl缓冲溶液中，加入底物磷酸酪氨酸共孵育(10-120min)，然后加入间苯二酚，测定探针的蓝色荧光强度，考察反应时间对目标物响应的影响，结果如图6所示。
实施例7考察CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs的浓度对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将ALP和酪氨酸酶分散在Tris-HCl缓冲溶液中，加入底物磷酸酪氨酸孵育，然后加入间苯二酚，最后加入CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs(0.4-1.6mg/mL)，观察紫外灯下颜色变化，考察CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs浓度对目标物响应的影响，结果如图7所示。
实施例8对ALP的定量检测，步骤如下:
将不同浓度的ALP(0.08-1000U/mL)和酪氨酸酶分散在Tris-HCl缓冲溶液中，加入底物磷酸酪氨酸孵育，然后加入间苯二酚，最后加入CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs，测定探针的蓝色荧光与红色荧光的强度的比值，所得荧光图如图8A所示，荧光强度的比值与ALP活性的相关性如图8B所示。
实施例9实际血清样品中ALP的检测，步骤如下：
将用PBS缓冲溶液((pH＝8.0))稀释的血清与酪氨酸酶混合，加入底物磷酸酪氨酸共孵育，然后加入间苯二酚，最后加入CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs，测定探针的蓝色荧光与红色荧光的强度的比值，根据标准曲线计算得到血清中ALP的含量。实施例中五个样本的血清检测到的ALP活性如表1所示，其中标准值为目前临床上普遍使用的IFCC连续监测法所得。五个血清样本检测到的ALP浓度与临床检测值基本一致。
表1
Figure BDA0002312432240000101

Claims (6)

1.一种非疾病诊断目的的用于定量检测血清中ALP的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）、合成发射红色荧光的CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs；
（2）、生成发射蓝色荧光的CAZMON：将ALP与底物磷酸酪氨酸以及酪氨酸酶共同孵育生成左旋多巴，加入间苯二酚使其与左旋多巴反应生成发射蓝色荧光的物质CAZMON；
（3）、制备比率型荧光探针：将步骤（1）所得的发红色荧光的CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs与步骤（2）所得的发蓝色荧光的CAZMON混合，CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs的红色荧光被CAZMON猝灭，得到随着ALP浓度增加，蓝色荧光逐渐增强红色荧光逐渐减弱的比率型荧光探针；
（4）、根据荧光产物CAZMON在470 nm和CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs在620 nm处的荧光强度的比值对ALP的浓度绘制标准曲线；
（5）、检测ALP：在用PBS缓冲溶液稀释的血清中加入磷酸酪氨酸以及酪氨酸酶共孵育，再加入间苯二酚，孵育完成后加入步骤（1）中的CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs，测定探针的蓝色荧光与红色荧光的比值，根据标准曲线，得到血清中ALP的含量。
2.权利要求1所述的非疾病诊断目的的用于定量检测血清中ALP的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，ALP与磷酸酪氨酸和酪氨酸酶的共孵育时间为0.5-3.0h。
3.权利要求1所述的非疾病诊断目的的用于定量检测血清中ALP的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，底物磷酸酪氨酸浓度为200-800 μM。
4.权利要求1所述的非疾病诊断目的的用于定量检测血清中ALP的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，酪氨酸酶浓度为1-5 U/mL。
5.权利要求1所述的非疾病诊断目的的用于定量检测血清中ALP的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，间苯二酚浓度为0.3-0.9 mM。
6.权利要求1所述的非疾病诊断目的的用于定量检测血清中ALP的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，CdTe/CdS/ZnS/SiO2 QDs浓度为0.5-1.5 mg/mL。
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