CN108414482A - 利用二硫化钼量子点内滤效应荧光检测碱性磷酸酶活性的方法 - Google Patents
利用二硫化钼量子点内滤效应荧光检测碱性磷酸酶活性的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于纳米材料领域，具体为一种利用二硫化钼量子点内滤效应荧光检测碱性磷酸酶活性的方法。本发明首先制备荧光二硫化钼量子点：以二硫化钼粉末为原料，乙醇/水为溶剂，无机碱为剥离助剂，采用超声法合成二硫化钼量子点；然后，将碱性磷酸酶溶液加入到4–硝基苯磷酸二钠盐（PNPP）以及硫酸镁的碱性缓冲液中，进行共孵育；将其加入到二硫化钼量子点溶液中，进一步共孵育；建立检测碱性磷酸酶的标准工作曲线；根据标准曲线方程得到待测溶液中碱性磷酸酶的活性。本发明中提供的荧光二硫化钼量子点具有性能稳定，合成条件简单，价格便宜等特点，将其用于检测碱性磷酸酶时，检测过程简单，选择性高，灵敏性高。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种利用二硫化钼量子点内滤效应荧光检测碱性磷酸酶活性的方法。
技术背景
碱性磷酸酶（ALP）是一种哺乳动物组织中常见的水解酶，已被广泛用作临床诊断的重要生物指标。ALP多存在于肝胆、肾脏、骨骼和胎盘中，用于催化蛋白质、核酸、糖类和生物碱等的脱磷酸化的过程。正常人血清中ALP的含量在 20–140U/L之间，血清中ALP的水平反常与乳腺癌，前列腺癌，骨骼疾病，肝功能紊乱和糖尿病等密切相关。因此，建立一种灵敏的定量检测ALP的方法是十分必要的。现今ALP活性的测定主要包括同位素标记法、色谱法、比色法、化学发光法、电化学法以及表面增强共振拉曼散射。在这些方法中，荧光探针作为以发光强度为检测信号的可视化技术，具有操作简单、分辨率高、造价低廉和可连续性实时监测等优势而被广泛应用。
二硫化钼(MoS2)具有类石墨烯材料的层状结构，由于其层间相对较弱的范德华力而较容易被剥离，其独特的机械性能、电学性能、化学性能以及光学性质使得它被广泛应用于超级电容器、电池、催化剂等方面。然而，与其电学和催化性质相比，对MoS2材料的光学性质尤其是光致发光性质的研究较少。小尺寸的二硫化钼量子点 （MoS2QDs） 由于量子效应而具有新颖的光学性质，有望用于开发新颖的光学传感器。因此，开发一种简便的MoS2QDs的合成方法并将其应用于传感研究是过渡金属二硫化物研究中具有挑战性的课题之一。
发明内容
针对现有技术所存在的问题和不足，本发明旨在提供一种简单易行的制备二硫化钼量子点并利用二硫化钼量子点的内滤效应荧光检测碱性磷酸酶活性的方法。
本发明的测定原理是：利用酶促反应和MoS2 QDs的光学特性。具体描述如下：
碱性磷酸酶（ALP）催化底物4–硝基苯磷酸二钠盐（PNPP）生成对硝基苯酚（PNP），导致体系的最大吸收波长从310 nm位移到405 nm。而PNP在405 nm的吸收波长和MoS2 QDs荧光团在400 nm处的荧光激发波长相重叠。因此，随着碱性磷酸酶活性的增强，体系在405 nm的吸收强度逐渐增强，MoS2 QDs在Ex = 400 nm, Em = 500 nm处的荧光发射强度逐渐降低，利用荧光分光光度计，以荧光淬灭的程度作为输出信号，可以定量检测碱性磷酸酶的活性，同时可以作为生物探针，将其用于血清中碱性磷酸酶活性的测定并用于碱性磷酸酶抑制剂的研究中。
本发明首先提供二硫化钼量子点的制备方法，具体步骤如下：
制备荧光二硫化钼量子点：以二硫化钼粉末为原料，将其溶于乙醇/水混合溶液中，加入一定量无机碱（氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等）后置于超声清洗器中，在500 W的功率下超声5–20 h，然后加入无机酸（硫酸、盐酸等）调节pH到中性，将得到的混合溶液离心，保留上层清液，用去离子水透析( ≥ 24 h)后冷冻干燥，重新分散到水溶液中即得到荧光二硫化钼量子点溶液。得到的二硫化钼量子点的直径在5 nm以下，其荧光激发波长为360 nm~ 500 nm，最佳激发波长在400nm处，荧光发射波长为480 nm ~ 556 nm。
其中，所述乙醇、水混合溶液中，按体积计，乙醇/水为15% – 85%，二硫化钼粉末在溶液中浓度为4.5 mg/mL – 18 mg/mL，无机碱加入量与二硫化钼粉末的重量比例为0.06:1– 8:1。
本发明提供的利用二硫化钼量子点内滤效应荧光检测碱性磷酸酶活性的方法，具体步骤为：
（1）采用上述方法制备最佳激发波长在400 nm处的二硫化钼量子点溶液，配置二硫化钼量子点溶液浓度为100 µg/mL – 400 µg/mL；
（2） 将不同活性的碱性磷酸酶溶液加入到含有过量的4–硝基苯磷酸二钠盐（PNPP）以及硫酸镁的碱性缓冲液中，进行共孵育，生成对硝基苯酚（PNP）；
（3）将上述步骤（2）得到的溶液加入二硫化钼量子点溶液中，进一步进行共孵育；
（4）根据含有不同浓度的碱性磷酸酶溶液在500 nm处的荧光强度的不同，建立线性关系，得到检测碱性磷酸酶的标准工作曲线；
（5）将含有碱性磷酸酶的待测样品加入到与标准工作溶液含量相同的荧光二硫化钼量子点溶液中，检测反应体系在500 nm处的荧光强度的变化，根据标准曲线方程得到待测溶液中碱性磷酸酶的活性。
步骤（1）中，二硫化钼量子点的直径在5 nm以下，其最佳荧光激发波长为400 nm。
步骤（2）中，共孵育温度为20 ~ 50℃，共孵育时间为30 ~ 60 min。
步骤（3）中，共孵育温度为20 ~ 50℃，共孵育时间为5 ~ 10 min。
步骤（4）中，检测碱性磷酸酶的标准工作曲线的具体过程如下：配制相同体积的一系列不同活性的碱性磷酸酶溶液加入到含有PNPP和硫酸镁的碱性缓冲液中，孵育一段时间后加入到二硫化钼量子点溶液中（缓冲液，PNPP和硫酸镁的最终浓度分别为10 mM，1 mM以及0.1 μM）；用荧光光度计记录400 nm激发波长下，反应体系在500 nm发射峰处的荧光强度，并以磷酸酶标准溶液的活度为横坐标，500 nm处反应体系的荧光强度的变化值F0 – F为纵坐标，拟合得到碱性磷酸酶标准曲线，实现对碱性磷酸酶活性的荧光检测。
步骤（5）中，利用二硫化钼量子点内滤效应荧光检测碱性磷酸酶活性的范围是0.1~ 5 U/L，最低检测浓度是0.1 U/L。
本发明也包括使用所述的检测碱性磷酸酶活性的方法构建的探针和所述探针在碱性磷酸酶抑制剂中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
（1）本发明在较为环保的绿色溶剂乙醇/水中通过无机碱辅助超声剥离即得到了二硫化钼量子点，避免了使用N–甲基吡咯烷酮（NMP）, 碱金属（Li, Na, K）以及正丁基锂等对环境污染较大的有机溶剂和较为危险的剥离剂，同时避免了使用价格高昂的水热反应釜以及管式炉等高温设备，大大降低了制备成本；
（2）本发明利用二硫化钼量子点的激发波长和ALP催化底物PNP的吸收波长重叠的现象，采用内滤效应将吸收信号转化为荧光信号，成功实现了对目标物的高效检测。
附图说明
图1 ：二硫化钼量子点在不同激发波长下的荧光发射光谱图。
图2：二硫化钼量子点的最佳荧光激发光谱图（左）和荧光发射光谱图（右）。
图3：二硫化钼量子点的紫外吸收光谱图。
图4：二硫化钼量子点的透射电子显微镜图。
图5：二硫化钼量子点对碱性磷酸酶响应的荧光–时间依赖图。
图6：二硫化钼量子点对不同活性碱性磷酸酶响应的荧光光谱图。
图7：ALP活性与荧光猝灭程度的关系图。
图8：ALP活性和荧光淬灭程度的线性拟合图。
图9：二硫化钼量子点检测碱性磷酸酶活性的选择性。其中，从a到v分别是空白，0.1 mM 的20种常见的氨基酸（苯丙氨酸，赖氨酸，谷氨酸，苏氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，甘氨酸，异亮氨酸，丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，天冬氨酸，亮氨酸，色氨酸，蛋氨酸，组氨酸，半胱氨酸，缬氨酸，酪氨酸，精氨酸）和10 U/L 的ALP。
图 10：二硫化钼量子点检测碱性磷酸酶活性的选择性。其中，从a到u分别是空白，0.01mM的金属离子（Cu2+, Fe3+, K+, Mg2+, Ca2+, Na+, Zn2+），生物小分子（谷胱甘肽，抗坏血酸，葡萄糖，三磷酸腺苷，透明质酸均为0.1mM，牛血清白蛋白和人血清白蛋白为150 mg/mL）以及100 U/L的蛋白酶（半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，凝血酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶）和10U/L的ALP。
图 11：二硫化钼量子点对不同浓度原钒酸钠响应的荧光光谱图。
图 12：原钒酸钠活性和荧光淬灭程度的线性拟合图。
具体实施方式
实施例对本发明作进一步说明，本发明的保护内容不限于以下实例。在不背离发明构思的范围内，本领域研究人员能够想到的变化都包括在本发明中，并以权利要求书为保护范围。
实施例1，制备二硫化钼量子点
将100 mg二硫化钼粉末和0.6 g氢氧化钠溶于11 mL 85%的乙醇/水中，在580W的功率下超声 20 h，室温静置12 h，收集上清液，加入浓盐酸调节溶液pH 到中性后过滤除去不溶物，1000 KDa的透析袋透析24 h，再用 0.22 µm的微孔滤膜过滤后真空冷冻干燥，将获得的固体粉末重新分散到水中即得到二硫化钼量子点溶液。如图1和图2所示，合成的二硫化钼量子点具有发光可调谐的性质，在360 nm到500 nm 光激发下均可发荧光，其最大激发和发射波长分别为400 nm和500nm。图3是合成的二硫化钼量子点的紫外光谱图，图4是二硫化钼量子点的透射电子显微镜图。从图中可以看到二硫化钼量子点的紫外吸收峰在230nm左右，平均粒径在5 nm以下。
实施例2，制备二硫化钼量子点
将200 mg二硫化钼粉末和0.8 g氢氧化钠溶于11 mL 85%的乙醇/水中，在580W的功率下超声12 h，室温静置12 h，收集上清液，加入浓硫酸调节溶液pH 到中性后过滤除去不溶物，1000 KDa的透析袋透析24 h，再用 0.22 µm的微孔滤膜过滤后真空冷冻干燥，将获得的固体粉末重新分散到水中即得到二硫化钼量子点溶液。
实施例3，碱性磷酸酶的检测
为了进一步研究内滤效应检测碱性磷酸酶的可行性，我们用荧光分光光度计进行了验证。首先，我们探讨了检测ALP的最佳孵育时间。将活性为5 U/L的ALP溶液加入到含有1 mM的PNPP和0.1 µM的MgSO4的二硫化钼量子点碱性缓冲液（Tris–HCl，10 mM，pH = 8.0）中，37℃孵育，每隔3 min用荧光分光光度计记录400 nm波长激发下溶液的荧光强度。由图5可以看到，60 min 后反应达到平稳，因此选择60 min作为最佳孵育时间。其次，我们对检测ALP的线性范围进行了探讨。将不同活性的ALP溶液（0 – 40 U/L）加入到含有1 mM的PNPP和0.1µM的MgSO4的二硫化钼量子点碱性缓冲液（Tris–HCl，10 mM，pH = 8.0）中，37 ℃孵育60min后，用荧光分光光度计记录400 nm波长激发下的荧光强度。从图6和图7可以看到，随着ALP活性的增强，溶液的荧光强度逐渐降低，当ALP活性达到20 U/L以后，溶液的荧光强度基本保持不变。以ALP标准品溶液的活度为横坐标，500 nm处反应体系的荧光强度的变化值F0–F为纵坐标，拟合可以得到检测ALP 的线性范围。如图8所示，ALP活性在0 – 5 U/L范围内呈良好的线性关系（Y = 5.370 × 103 X + 378.8, R2 = 0.9919, X单位为U/L），最低检测浓度为0.1 U/L。
实施例4 ，选择性实验
选择性是评价生物传感器性能的重要指标。因此，我们选用了20种氨基酸，一些常见的金属离子以及生物分子和生物酶来评价该方法的选择性。在实验操作过程中，用上述物质代替碱性磷酸酶，其余测试条件同实施例3，测定了体系在400 nm光激发下500 nm处的荧光强度。如图9和图10所示，和碱性磷酸酶相比，上述物质对体系的荧光强度的影响基本可以忽略不计，因此可以说明该发明对碱性磷酸酶具有良好的选择性。
实施例5 ，抑制剂实验
利用上述碱性磷酸酶荧光探针，可以对碱性磷酸酶抑制剂进行检测。我们通过对典型的抑制剂原钒酸钠（Na3VO4）进行检测，测试了该探针检测碱性磷酸酶抑制剂的能力。将碱性磷酸酶和不同浓度的原钒酸钠在pH = 8.0的磷酸缓冲溶液中37℃孵育1 h后，加入到含有0.1 mM的 PNPP和0.1 µM的MgSO4的二硫化钼量子点碱性缓冲液（Tris–HCl，10 mM，pH =8.0）中37 ℃继续孵育1 h后，用荧光分光光度计记录溶液在400 nm波长激发下在500 nm处的荧光强度。如图11所示，随着Na3VO4浓度（0 – 1.5 mM）的增加，碱性磷酸酶活性被抑制的程度逐渐增强，1.5 mM后逐渐趋于平衡。以Na3VO4标准品溶液的浓度为横坐标，500 nm处反应体系的荧光强度的变化值F0–F为纵坐标，拟合可以得到检测Na3VO4的线性范围。如图12所示，Na3VO4浓度在0.6 – 1.5 mM范围内呈良好的线性关系（Y = 3.595 × 104 X – 1.283× 104, R2 = 0.9779, X单位为mM）。
Claims (10)
1. 一种二硫化钼量子点的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：以二硫化钼粉末为原料，将其溶于乙醇/水混合溶液中，加入无机碱后置于超声清洗器中超声5-20 h，调节pH到中性；将得到的混合溶液离心，保留上层清液，用去离子水透析24 h后冷冻干燥，重新分散到水溶液中，即得到荧光二硫化钼量子点溶液；该二硫化钼量子点的直径在5 nm以下，其荧光激发波长为360 nm~500nm，最佳激发波长在400nm处，荧光发射波长为480 nm~556 nm。
2.根据权利要求1所述的二硫化钼量子点的制备方法，其特征在于，所述无机碱为氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾。
3.根据权利要求1所述的二硫化钼量子点的制备方法，其特征在于，所述乙醇/水混合溶液中，按体积计，乙醇/水为15%–85%，二硫化钼粉末在溶液中浓度为4.5 mg/mL–18 mg/mL，无机碱加入量与二硫化钼粉末的重量比例为0.06:1–8:1。
4.一种利用二硫化钼量子点内滤效应荧光检测碱性磷酸酶活性的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）采用权利要求1-3之一所述方法制备最佳激发波长在400nm处的二硫化钼量子点溶液，配置二硫化钼量子点溶液浓度为100 ug/mL–400 ug/mL；
（2） 将不同活性的碱性磷酸酶溶液加入到含有过量的4–硝基苯磷酸二钠盐以及硫酸镁的碱性缓冲液中，进行共孵育，生成对硝基苯酚；
（3）将上述步骤（2）得到的溶液加入二硫化钼量子点溶液中，进一步进行共孵育；
（4）根据含有不同浓度的碱性磷酸酶溶液在500nm处的荧光强度的不同，建立线性关系，得到检测碱性磷酸酶的标准工作曲线；
（5）将含有碱性磷酸酶的待测样品加入到与标准工作溶液含量相同的荧光二硫化钼量子点溶液中，检测反应体系在500 nm处的荧光强度的变化，根据标准曲线方程得到待测溶液中碱性磷酸酶的活性。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述共孵育温度为20~50℃，共孵育时间为30~60 min。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述共孵育温度为20~50℃，共孵育时间为5~10 min。
7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，检测碱性磷酸酶的标准工作曲线的具体过程如下：配制相同体积的一系列不同活性的碱性磷酸酶溶液加入到含有PNPP和硫酸镁的碱性缓冲液中，孵育一段时间后加入到二硫化钼量子点溶液中；用荧光光度计记录400 nm激发波长下，反应体系在500 nm发射峰处的荧光强度，并以磷酸酶标准溶液的活度为横坐标，500 nm处反应体系的荧光强度的变化值F0–F为纵坐标，拟合得到碱性磷酸酶标准曲线。
8. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，利用二硫化钼量子点内滤效应荧光检测碱性磷酸酶活性的范围是0.1~5 U/L，最低检测浓度是0.1 U/L。
9.一种由权利要求4-8之一所述的检测碱性磷酸酶活性的方法构建的探针。
10.如权利要求9所述的探针在碱性磷酸酶抑制剂中的应用。
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