CN111220608B - 基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶活性比色检测法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于模拟酶、分析化学技术领域，涉及一种基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶活性比色检测法，包括：分别于5 mL离心管中加入不同活度的碱性磷酸酶和1 mM HMPi，反应30～60 min；再向混合液中依次加入硫化改性的CoOx悬浮液、TMB、H2O2和醋酸盐缓冲液，混匀体系后反应1～30 min；过膜后用紫外‑可见吸收分光光度计记录波长为652 nm处的吸光度；将上述TMBox的吸光度测量值与对应的ALP活度绘制校准后的ALP活度‑吸光度标准工作曲线；将待测ALP样品重复上述步骤，与标准工作曲线比对，即可获得ALP活性。本发明检测过程条件温和，不需要其他试剂，实现了ALP活度的方便、快速检测，检测成本低廉，操作简单，可检测范围宽至0.8～320 U/L，实现对人体血清中碱性磷酸酶活度的检测。
Description
技术领域
本发明属于模拟酶、分析化学技术领域，涉及碱性磷酸酶的检测方法，尤其涉及一种基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶活性比色检测法。
背景技术
碱性磷酸酶(ALP)是一种生物酶，广泛存在于许多人体组织和器官中。它具有催化许多磷酸化物质(例如核酸，蛋白质和小分子)水解的能力。通常，成人血液中ALP的活性范围为40至190U/L。大量研究表明，ALP活性异常与多种疾病密切相关，包括骨损伤，肝功能障碍和前列腺癌。例如，ALP是早期成骨细胞分化过程中成骨细胞活性的重要指标，其活性通常随骨活性的增加而增加。当其活性超过上限时，表示在此过程中可能发生活性骨沉积。另外，其他骨病，例如软骨病，狼疮炎和骨癌，也会导致ALP活性增加。此外，肝胆疾病患者经常发现ALP指标偏高，而严重的慢性肾炎，甲状腺功能低下和贫血会导致ALP活性偏低。因此，它被普遍用作诊断和治疗这些疾病的临床生物标志物。此外，ALP经常用于各种酶联免疫吸附测定(ELISA)中。在这些需求下，开发有效，低成本且易于使用的ALP活性分析方法具有重要意义。
目前碱性磷酸酶活性的检测方法主要有荧光法、电化学法、比色法等。例如：
中国专利CN110501318A，公开了一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法,将对氨基苯磷酸作为底物,经碱性磷酸酶的催化水解生成对氨基苯酚,对氨基苯酚可以与后续加入的乙二胺发生反应,生成强荧光发射的聚合物碳点。体系中的碱性磷酸酶活性越高,生成的荧光聚合物碳点就越多,荧光就越强,根据检测溶液的荧光强度变化,进行碱性磷酸酶活性的定量检测。
中国专利CN110361440A，公开了一种碱性磷酸酶活性便携式电泳滴定检测方法及装置, 通过在碱性磷酸酶催化-电泳滴定系统中进行电泳滴定碱性磷酸酶标准品,获得不同活性碱性磷酸酶与对应的界面速度之间的标准曲线；然后在相同条件通过ALP-ET电泳滴定测定未知碱性磷酸酶活性的样品界面速度,通过对比ALP-ET标准曲线获得样品中ALP活性。
中国专利CN107422014A，公开了发明提供了一种定量检测碱性磷酸酶的方法,通过制备修饰电极,然后利用碱性磷酸酶催化其底物抗坏血酸磷酸酯脱去磷酸根生成具有强还原性的抗坏血酸,而抗坏血酸将反应液中的银离子还原为银单质并沉积电极表面上,最后利用修饰电极表面所沉积银的溶出伏安信号来实现对碱性磷酸酶的高灵敏检测。
中国专利CN106596532B，公开了一种简单的碱性磷酸酶活性的检测方法。利用样本溶液中的碱性磷酸酶分析物在催化焦磷酸水解反应后,Cu2+因未被焦磷酸络合而可高效率抑制糖化酶活性,使得水溶性较低的淀粉不被糖化酶水解。反应溶液中的淀粉被滴加到纸微流控分析装置中后使得相应纸体发生从亲水性转变为疏水性的润湿性改变,进而使检测试剂溶液可流过该区域的体积降低,最终导致其在纸装置中的流动长度较短。纸装置中检测试剂溶液的流动长度反比于样本中碱性磷酸酶的活性大小,即完成碱性磷酸酶活性的定量检测。
上述已公开的碱性磷酸酶检测方法虽然具有一定的检测效率，但仍具有以下缺点和不足：
1)这些检测方法操作相对复杂；
2)有些检测方法对环境要求苛刻，成本相对较高，试剂保存条件要求高。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题和不足，本发明的目的是提供一种基于硫化改性的CoOx 的碱性磷酸酶活性比色检测法。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶活性比色检测法，包括如下步骤：
1)分别于5mL离心管中加入不同活度的碱性磷酸酶和0.125mL 1mM HMPi，反应30～ 60min，优选50min；所述碱性磷酸酶在体系内的最终活度为0.8U/L、2U/L、4U/L、8U/L、16U/L、32U/L、40U/L、60U/L、120U/L、160U/L、200U/L、240U/L、320U/L；
2)再向混合液中依次加入0.05mL 1mg/mL的硫化改性的CoOx(Sulfuration-engineered CoOx)悬浮液、0.1mL 5mM的TMB、0.05mL 9.8M的H2O2和醋酸盐缓冲液，确定溶液最终总体积为3mL，混匀体系后反应1～30min，优选5min；
3)将混合体系过膜后用紫外-可见吸收分光光度计测定TMBox混合溶液紫外吸收光谱，记录波长为652nm处的吸光度；
4)将上述TMBox的吸光度测量值与对应的ALP活度绘制校准后的ALP活度-吸光度标准工作曲线；
5)将待测ALP样品重复步骤1)～4)，用紫外-可见吸收分光光度计分别测定以TMB为底物时的吸光度，通过计算再与标准工作曲线比对，即可获得ALP活度。
本发明较优公开例中，步骤2)中所述醋酸盐缓冲液pH为4，浓度0.2M。
本发明较优公开例中，步骤5)中所述待测ALP样品的可检测活度范围为0.8～320U/L，检测限低至0.38U/L。
本发明所述硫化改性的CoOx，其制备步骤如下：
1.将质量比为1:2～4的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与钴盐溶于乙醇，搅拌均匀成溶液A，所述钴盐与乙醇的摩尔比为1:220～260；
2.将与钴盐摩尔比为1：4～8的2-甲基咪唑(2-MI)溶于乙醇，搅拌均匀成溶液B，所述钴盐与乙醇的摩尔比为1:220～260；
3.将溶液B边搅拌边滴加到等体积的溶液A中，持续搅拌15～45min，静置12～36h；
4.以9000～11000r/min的转速离心分离产物，并用乙醇将产物洗涤干净，35～45℃真空干燥，得到棱长为200～250nm的菱形十二面体的紫色固体纳米颗粒；
5.将紫色固体纳米颗粒倒入瓷舟置于管式炉中，在氩气保护下以1～10℃/min的速率升至350～750℃，煅烧持续1～4h，冷却至室温，取出后得到黑色固体纳米颗粒；
6.将黑色固体纳米颗粒和与之质量比为1：4～8的硫代硫酸钠分别放入两个临近的瓷舟内，置于管式炉中，且装有硫代硫酸钠的瓷舟放在气流上游位置，在氩气气流中进行硫化，程序升温速率为1～10℃/min，400～600℃保持1～3h，冷却至室温，取出即得。
进一步的，步骤1所述质量比优选为1:3，钴盐与乙醇摩尔比优选1：250，搅拌时间优选为1h；所述钴盐是硝酸钴、氯化钴、硫酸钴，优选六水合硝酸钴。
进一步，步骤2所述钴盐与2-甲基咪唑(2-MI)的摩尔比优选为1:6，钴盐与乙醇摩尔比优选1：250。
进一步，步骤3搅拌时间优选为30min，静置时间优选为24h。
进一步，步骤4所述转速优选10000r/min，真空干燥优选40℃。
进一步，步骤5所述升温速率优选5℃/min，煅烧温度优选500℃，煅烧时间优选2h。
进一步，步骤6所述质量比优选为1：6升温速率优选5℃/min，煅烧温度优选500℃，保持时间优选2h。
根据本发明所公开的方法制得的硫化改性的CoOx纳米颗粒作为类过氧化物酶，含有菱形十二面体结构，所述硫化改性的CoOx纳米颗粒表面棱长为200nm左右。
本发明以硫化改性的CoOx(Sulfuration-engineered CoOx)为类过氧化物酶模拟物，在酸性条件下，催化过氧化氢产生羟基自由基与显色剂(TMB)之间的反应，产生显色物质 (TMBox)，整个体系呈蓝色。由于六偏磷酸钠带有较强的负电荷，上述体系加入六偏磷酸钠(HMPi)从而使带有正电显色物质(TMBox)发生团聚过滤后颜色变浅，因此影响显色物质的颜色变化。碱性磷酸酶(ALP)水解六偏磷酸钠转化为磷酸根，磷酸根对上述体系几乎无影响，通过水解体系中的六偏磷酸钠，蓝色逐渐恢复，通过一定时间内不同活度的碱性磷酸酶水解体系中六偏磷酸钠而引起的恢复蓝色差异评价碱性磷酸酶的活性，从而实现对碱性磷酸酶的检测。本发明中，ALP可以促进TMB的显色，因此本发明利用TMBox的吸光度与 ALP活度的线性关系进行运算处理，从而得到更稳定可靠的检测数据，据此可测定人体血清中ALP的活度。
在本说明书中，术语“类过氧化物酶”是指具有过氧化物酶催化活性的材料。具体地，本发明的类过氧化物酶以过氧化氢作为电子受体，通过催化过氧化氢产生羟基自由基氧化相应底物生成有色物质，用于比色检测。
在本说明书中，术语“HMPi”是化合物六偏磷酸钠的缩写名称，二者可互换使用。
在本说明书中，术语“TMB”是化合物“3,3’,5,5’-四甲基联苯胺”的缩写名称，二者可互换使用。
在本说明书中，术语“TMBox”是化合物“3,3’,5,5’-四甲基联苯胺”氧化产物的缩写名称，二者可互换使用。
在本说明书中，术语“ALP”是指碱性磷酸酶，二者可互换使用。
在本说明书中，术语“Sulfuration-engineered CoOx”即硫化改性的CoOx，是指金属有机框架煅烧硫化处理后的类过氧化物酶，二者可互换使用。
本发明所用反应物、试剂均为市售。
有益效果
本发明公开了TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2体系用于ALP的比色检测；利用 TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2体系比色检测ALP活度，检测过程条件温和，不需要其他试剂，实现了ALP活度的方便、快速检测，检测成本低廉，操作简单；通过 TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2体系检测碱性磷酸酶活度，检测限低至0.38U/L，可检测范围宽至0.8～320U/L；利用TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2体系检测碱性磷酸酶活度，对实际样品的测量结果准确，对碱性磷酸酶的响应灵敏，可实现对人体血清中碱性磷酸酶活度的检测。
附图说明
图1.TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2体系反应5min时的紫外-可见吸收光谱；
图2.Sulfuration-engineered CoOx类过氧化物酶的缓冲液pH优化图；
图3.ALP活度检测示意图；
图4.ALP影响TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2反应体系反应5min时的紫外-可见吸收光谱；
图5.用TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2体系检测ALP活度条件优化图(A:HMPi 浓度优化；B：ALP水解HMPi时间优化)；
图6.用TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2体系检测ALP活度的检测效果(A：反应5min时的紫外-可见吸收光谱；B：紫外光谱652nm处吸光度拟合直线)；
图7.用TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2体系检测ALP活度的选择性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1.将质量比为1:2的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与钴盐溶于乙醇，搅拌均匀成溶液A，所述钴盐与乙醇的摩尔比为1:220；
2.将与钴盐摩尔比为1：4的2-甲基咪唑(2-MI)溶于乙醇，搅拌均匀成溶液B，所述钴盐与乙醇的摩尔比为1:220；
3.将溶液B伴边搅拌边滴加到溶液A中，持续搅拌15min，之后静置12h；
4.以9000r/min的转速离心5分钟分离产物，并用乙醇将产物洗涤干净，35℃真空干燥，得到棱长为200～250nm的菱形十二面体的紫色固体纳米颗粒。
5.将步骤4中紫色固体纳米颗粒倒入瓷舟置于管式炉中，并且在氩气保护下以2℃/min 的速率升高温度直至400℃，在该温度下煅烧过程持续2h，反应后冷却至室温，取出后得到黑色固体纳米颗粒。
6.将步骤5中黑色固体纳米颗粒和300mg硫代硫酸钠分别放入两个临近的瓷舟内，所述瓷舟置于管式炉中，且装有硫代硫酸钠的瓷舟放在气流上游位置，在氩气气流中进行硫化，程序升温速率为2℃/min，在400℃下保持2h，反应后冷却至室温，取出即可得到硫化改性的CoOx。
Sulfuration-engineered CoOx作为类过氧化物酶催化过氧化氢氧化TMB反应的应用实验，步骤是：
1)分别取2.85mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的TMB和0.05mL 1mg/mL的Sulfuration-engineered CoOx分散溶液，然后将上述溶液混合均匀，将时间控制在0.5～1min之间，液体呈无色或淡蓝色；
2)将上述体系在室温下反应5min，液体颜色随时间由无色变化为蓝色；
3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外-可见吸收光谱。
图1记录了制备的Sulfuration-engineered CoOx在不同体系中催化过氧化氢氧化TMB反应的UV-Vis图。据图可以发现，当过氧化氢、TMB和Sulfuration-engineered CoOx中的任何一种缺失时，未有颜色反应发生；当过氧化氢、TMB和Sulfuration-engineeredCoOx均存在时，发生颜色反应。此反应是由TMB和过氧化氢在Sulfuration-engineeredCoOx的催化下发生氧化还原导致的，证明制备的Sulfuration-engineered CoOx具有良好的过氧化物酶活性。
实施例2
1.将质量比为1:3的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与钴盐溶于乙醇，搅拌均匀成溶液A，所述钴盐与乙醇的摩尔比为1:250；
2.将与钴盐摩尔比为1：4的2-甲基咪唑(2-MI)溶于乙醇，搅拌均匀成溶液B，所述钴盐与乙醇的摩尔比为1:250；
3.将溶液B伴边搅拌边滴加到溶液A中，持续搅拌30min，之后静置24h；
4.以11000r/min的转速离心5分钟分离产物，并用乙醇将产物洗涤干净，45℃真空干燥，得到棱长为200～250nm的菱形十二面体的紫色固体纳米颗粒。
5.将步骤4中紫色固体纳米颗粒倒入瓷舟置于管式炉中，并且在氩气保护下以5℃/min 的速率升高温度直至500℃，在该温度下煅烧过程持续2h，反应后冷却至室温，取出后得到黑色固体纳米颗粒。
6.将步骤5中黑色固体纳米颗粒和300mg硫代硫酸钠分别放入两个临近的瓷舟内，所述瓷舟置于管式炉中，且装有硫代硫酸钠的瓷舟放在气流上游位置，在氩气气流中进行硫化，程序升温速率为5℃/min，在500℃下保持2h，反应后冷却至室温，取出即可得到硫化改性的CoOx。
Sulfuration-engineered CoOx作为类过氧化物酶催化过氧化氢氧化TMB反应的应用实验，步骤是：
1)分别取2.85mL pH值分别为3、4、5、6、7、8、9的醋酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，依次向其中加入0.1mL 5mM的TMB和0.05mL 1mg/mL的Sulfuration-engineered CoOx分散溶液，然后将上述溶液混合均匀，将时间控制在0.5～1min之间，液体呈无色或淡蓝色；
2)将上述体系在室温下反应5min，液体颜色随时间由无色变化为蓝色；
3)用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液紫外-可见吸收光谱。
结果如图2所示，随着pH的增大，吸光度值呈先增大后减小的趋势，并在pH控制在4时吸光度值最高，达到峰值。可得，pH控制在4时，酶的催化活性最好。
实施例3
ALP影响TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2反应体系
1)分别取2.85mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)，依次向其中加入0.1mL 5mM的TMB和0.05mL 1mg/mL的Sulfuration-engineered CoOx分散溶液，然后将上述溶液混合均匀，将时间控制在0.5～1min之间，液体呈无色或淡蓝色，混匀体系后反应5min，用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在652nm处的吸光度；
2)取0.125mL 1mM HMPi，再依次加入2.675mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)、0.05mL 1mg/mL的Sulfuration-engineered CoOx悬浮液、0.1mL 5mM的TMB和0.05mL 9.8M的H2O2，混匀体系后反应5min，过滤后用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在652nm处的吸光度；
3)取0.125mL 1mM HMPi，其中加入0.125mL 400U/L的碱性磷酸酶，反应45min，再向混合液中依次加入2.6mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)、0.05mL 1mg/mL的Sulfuration-engineered CoOx悬浮液、0.1mL 5mM的TMB和0.05mL 9.8M的H2O2，混匀体系后反应5min，过滤后用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在652nm处的吸光度。
结果如图4所示，图4中单独的TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2反应体系在652 nm处有一个较大的吸收峰,当混合体系中加入HMPi后，颜色变紫过滤后几乎无色，在652nm 处几乎没有吸收峰，由于ALP水解HMPi，颜色变紫程度减小过滤后呈淡蓝色，从而在652nm 处产生一个较弱的吸收峰。
实施例4
用TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2体系检测ALP条件优化图
实施例4A HMPi浓度对利用TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2反应体系检测ALP 的影响
1)取不同体积1mM的HMPi溶液和其中加入0.125mL 400U/L的碱性磷酸酶，反应45min；
2)再向混合液中依次加入一定体积0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)、0.05mL 1mg/mL的Sulfuration-engineered CoOx悬浮液、0.1mL 5mM的TMB和0.05mL 9.8M的 H2O2，然后将上述溶液混合均匀，保证总溶液体积为3mL，混匀体系后反应5min；
3)过滤后用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在652nm处的吸光度。
结果如图5A所示，从图5A可以看出ALP活度对反应体系的影响受HMPi浓度的影响。在本实验中，体系中HMPi浓度为0.5mM时抑制TMB显色效果已经较为明显，故选用体系中HMPi浓度为0.5mM为最优条件。
实施例4B ALP水解HMPi时间对利用TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2反应体系检测ALP的影响
1)取0.125mL 1mM的HMPi溶液和其中加入0.125mL 400U/L的碱性磷酸酶，分别反应30min、40min、50min、60min、70min；
2)再向混合液中依次加入2.6mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)、0.05mL 1mg/mL的Sulfuration-engineered CoOx悬浮液、0.1mL 5mM的TMB和0.05mL 9.8M的H2O2，然后将上述溶液混合均匀，混匀体系后反应5min，过滤后用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在652nm处的吸光度；
结果如图5B所示，从图5B可以看出ALP活度对反应体系的影响受ALP水解HMPi时间的影响。在本实验中，水解时间为50min时促进TMB显色效果较明显再往后效率降低，故选用水解时间为50min为最优条件。
实施例5
利用TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2反应体系比色检测ALP活度
1)分别于5mL离心管中加入0.125mL不同活度的碱性磷酸酶和0.125mL 1mM HMPi，反应50min；所述碱性磷酸酶在体系内的最终活度为0.8U/L、2U/L、4U/L、8U/L、16U/L、 32U/L、40U/L、60U/L、120U/L、160U/L、200U/L、240U/L或320U/L；
2)再向混合液中依次加入2.6mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)、0.05mL 1mg/mL的Sulfuration-engineered CoOx悬浮液、0.1mL 5mM的TMB和0.05mL 9.8M的H2O2，确定溶液最终总体积为3mL，混匀体系后反应5min；
3)将上述混合液过膜后用紫外-可见吸收分光光度计测定混合溶液紫外吸收光谱，记录波长为652nm处的吸光度并绘制以TMB为显色剂的ALP活度-吸光度标准工作曲线。
利用本发明的比色方法对于ALP活度检测的结果如图6A所示。其中，图6A说明随着ALP活度的增加，溶液的吸光度逐渐增大；图6B是紫外光谱652nm处吸光度拟合直线，说明在该方法对于ALP活度的可检测范围为0.8～320U/L，有优良的检测效果。
实施例6
利用TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2反应体系检测ALP的抗干扰性和选择性
1)取0.125mL 1.5mM的HMPi溶液和其中加入0.125mL不同种类的氨基酸或者蛋白酶以及0.125mL 600U/L的碱性磷酸酶，反应50min，再向混合液中依次加入2.475mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)、0.05mL 1mg/mL的Sulfuration-engineered CoOx悬浮液、0.1mL5 mM的TMB和0.05mL 9.8M的H2O2，然后将上述溶液混合均匀，混匀体系后反应5min，过滤后用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在652nm处的吸光度；
2)取0.125mL 1mM的HMPi溶液和其中加入0.125mL不同种类的氨基酸或者蛋白酶，反应50min，再向混合液中依次加入2.6mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)、0.05mL 1mg/mL的Sulfuration-engineered CoOx悬浮液、0.1mL 5mM的TMB和0.05mL 9.8M的H2O2，然后将上述溶液混合均匀，混匀体系后反应5min，过滤后用紫外-可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在652nm处的吸光度。
结果如图7所示。图7是用TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2反应体系检测ALP 的抗干扰性和选择性的柱状图，柱状图从左到右依次为空白、色氨酸(Try)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、葡萄糖氧化酶(GOx)、还原型辅助酶(NADH)、谷胱甘肽(GSH)、半胱甘酸(Cys)、谷胱甘肽+N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)和半胱甘酸+N-乙基顺丁烯二酰亚胺。从图7B中可以看出只有ALP可以显著促进TMB的显色反应，而其他氨基酸或者蛋白酶共存时不会对ALP的水解效果产生影响，说明该传感器可以高选择性、稳定地完成ALP活度的比色定量检测。
实施例7
TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2反应体系检测血清中ALP活度
1)分别于5mL离心管中加入0.125mL不同活度的碱性磷酸酶和0.125mL处理过后的血清样品；
2)再向混合液中依次加入2.6mL 0.2M的醋酸盐缓冲液(pH为4)、0.05mL 1mg/mL的Sulfuration-engineered CoOx悬浮液、0.1mL 5mM的TMB和0.05mL 9.8M的H2O2，确定溶液最终总体积为3mL，混匀体系后反应5min；
3)将上述混合液过膜后用紫外-可见吸收分光光度计测定混合溶液紫外吸收光谱，记录波长为652nm处的吸光度并代入紫外光谱652nm处吸光度拟合直线换算为ALP活度。
其测定结果如下表1所示：
本发明及某医院测定值的结果对比
由上表可知，TMB+Sulfuration-engineered CoOx+H2O2体系对实际样品中ALP活度的变化响应灵敏，与医院实际测定值相比，结果相近。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式。当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，任何熟悉本技术领域的技术人员，当可根据本发明作出各种相应的等效改变和变形，都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (6)
1.一种基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶比色检测法，其特征在于，包括如下步骤：
1）分别于5 mL离心管中加入不同活度的碱性磷酸酶和0.125 mL 1 mM 六偏磷酸钠溶液，反应30～60 min；所述碱性磷酸酶在体系内的活度为0.8 U/L、2 U/L、4 U/L、8 U/L、16U/L、32 U/L、40 U/L、60 U/L、120 U/L、160 U/L、200 U/L、240 U/L、320 U/L；
2）再向混合液中依次加入0.05mL 1mg/mL的硫化改性的CoOx悬浮液、0.1 mL 5 mM的TMB、0.05mL 9.8M的H2O2和醋酸盐缓冲液，确定溶液最终总体积为3 mL，混匀体系后反应1～30 min，得到TMBox混合溶液；
3）将混合体系过膜后用紫外-可见吸收分光光度计测定TMBox混合溶液紫外吸收光谱，记录波长为652 nm处的吸光度；
4）将上述TMBox的吸光度测量值与对应的碱性磷酸酶活度绘制校准后的碱性磷酸酶活度-吸光度标准工作曲线；
5）将待测碱性磷酸酶样品于5 mL离心管中和0.125 mL 1 mM 六偏磷酸钠溶液，反应30～60 min；再向混合液中依次加入0.05mL 1mg/mL的硫化改性的CoOx悬浮液、0.1 mL 5 mM的TMB、0.05mL 9.8M的H2O2和醋酸盐缓冲液，确定溶液最终总体积为3 mL，混匀体系后反应1～30 min，得到TMBox混合溶液；过膜后用紫外-可见吸收分光光度计测定紫外吸收光谱，记录波长为652 nm处的吸光度，再与标准工作曲线比对，即可获得待测碱性磷酸酶活度。
2.根据权利要求1所述基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶比色检测法，其特征在于：步骤1）中所述分别于5 mL离心管中加入不同活度的碱性磷酸酶和0.125 mL 1 mM 六偏磷酸钠，反应50 min。
3.根据权利要求1所述基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶比色检测法，其特征在于：步骤2）中所述确定溶液最终总体积为3 mL，混匀体系后反应5 min。
4.根据权利要求1所述基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶比色检测法，其特征在于：步骤2）中所述醋酸盐缓冲液pH为4，浓度0.2 M。
5.根据权利要求1所述基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶比色检测法，其特征在于：步骤5）中所述待测碱性磷酸酶样品的可检测活度范围为0.8～320 U/L。
6.根据权利要求1所述基于硫化改性的CoOx的碱性磷酸酶比色检测法，其特征在于：步骤5）中所述待测碱性磷酸酶样品的检测限低至0.38 U/L。
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