TWI554760B - 游離輻射改質之奈米碳載體應用於檢測技術 - Google Patents
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Description
本發明係有關於一種奈米輻射載體改質方法,尤指涉及一種針對疾病使用具有高專一性之具磁性碳微粒子,特別係指可提高檢測之靈敏度與準確度,並達到大幅降低成本且具方便性之方法,可供應用於樣品純化或進行臨床大量例行活體外定量量測癌症診斷與治療之評估者。
按,傳統之酵素連結免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)如第9圖所示,其只能在容器8底部塗覆上一層抗原9,因此該抗原9之表面積使用有限,並無法有效提高檢測時之靈敏度。故,一般習用者係無法符合使用者於實際使用時之所需。
本發明之主要目的係在於,克服習知技藝所遭遇之上述問題並提供一種使用針對疾病具有高專一性之具磁性碳微粒子,可利用其接枝官能性分子增加接枝抗原/抗體之表面積,使被結合於其奈米微粒表面之抗原可明顯增加許多倍,因而可提高檢測之靈敏度與準確度並有效達到大幅降低成本且具方便性之方法,進
行臨床大量例行活體外定量量測癌症診斷與治療之評估者與樣品純化。
為達以上之目的,本發明係一種奈米碳輻射載體改質方法,係於一溶液中提供複數個碳磁性粒子(Magnetic Beads),並將一抗原(Antigen)/抗體(Antibody)添加至其中,使該抗原/抗體吸附或結合於該磁性粒子上;利用一磁場將該些磁性粒子聚集吸附住,並將剩餘沒反應之抗原/抗體及其溶液以一吸取器(Needle)吸走,形成純粹帶有抗原/抗體之磁性粒子;添加一待測試樣至帶有該抗原之磁性粒子之溶液中,使該待測試樣中之抗體(Antibody)/抗原(Antigen)與該抗原/抗體進行特異性反應而吸附或結合至該磁性粒子上,之後再施以一磁場將其聚集吸附住,俾以分離出未被吸附或結合之待測試樣中之其他物質;在接上該抗體之磁性粒子之溶液中,再添加一二級抗體,俾使吸附或結合有該二級抗體之磁性粒子能藉此標識作為指標進行後續放射免疫分析法(Radioimmunoassay,RIA)、冷光免疫分析法(Chemiluminescence Immunoassa,CLIA)、呈色免疫分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)或進行免疫-聚合酶連鎖反應法(Immuno PCR)之測定,其中在吸附或結合該二級抗體後,同樣再施以一磁場將其聚集吸附住,俾以分離出未被吸附或結合之二級抗體;當進行放射免疫分析法時,係用以在該二級抗體上耦合一碘-125放射性同位素,透過該碘-125放射出之伽瑪射線(Gamma Ray,γ-ray),俾以偵測該伽瑪射線之強度判定該待測試樣中抗體之含量;
當進行冷光/呈色免疫分析法時,係用以在該二級抗體上耦合一冷光/呈色酵素,透過該冷光/呈色酵素作用於冷光基質(Chemiluminescence Substrate)/呈色基質,俾以偵測該光子之發光強度/呈色吸光值判定該待測試樣中抗體之含量;以及當進行免疫-聚合酶連鎖反應法時,係用以在該二級抗體接上一生物素(Biotin),並在一核酸分子也接上一生物素,透過一鏈抗生物素蛋白(Streptavidin)將該核酸分子與該二級抗體連接,再利用Tag酵素進行PCR反應將訊號放大,俾以透過一分離程序將核酸分子加以分離以判定該待測試樣中抗體之含量。
(本發明部分)
11‧‧‧步驟(A)碳磁性粒子接枝抗原
12‧‧‧步驟(B)磁性吸附清洗
13‧‧‧步驟(C)碳磁性粒子接枝抗體
14‧‧‧步驟(D)碳磁性粒子接枝二級抗體
15‧‧‧步驟(E)放射免疫分析
16‧‧‧步驟(F)冷光/呈色免疫分析
17‧‧‧步驟(G)免疫-聚合酶連鎖反應
2‧‧‧容器
20‧‧‧溶液
21‧‧‧磁鐵
3‧‧‧碳磁性粒子
31‧‧‧奈米微粒
32‧‧‧接枝官能性分子
33‧‧‧磁性物質
4‧‧‧待測試樣
40‧‧‧抗原/抗體
41‧‧‧抗體/抗原
42‧‧‧二級抗體
5‧‧‧吸取器
6‧‧‧訊號分子
6a‧‧‧放射性同位素
6b‧‧‧冷光/呈色酵素
6c‧‧‧核酸分子
61c‧‧‧生物素
62c‧‧‧鏈抗生物素蛋白
7a‧‧‧伽瑪射線探測器
7b‧‧‧光電倍增管偵測器
7c‧‧‧凝膠電泳
(習用部分)
8‧‧‧容器
9‧‧‧抗原
第1圖,係本發明之奈米碳輻射載體之改質流程示意圖。
第2圖,係本發明之改質流程一示意圖。
第3圖,係本發明之改質流程二示意圖。
第4圖,係本發明之改質流程三示意圖。
第5圖,係本發明之改質流程四示意圖。
第6圖,係本發明之改質流程五示意圖。
第7圖,係本發明之改質流程六示意圖。
第8圖,係本發明之改質流程七示意圖。
第9圖,係習用之酵素連結免疫吸附分析法示意圖。
請參閱『第1圖~第8圖』所示,係分別為本發明之奈米碳輻射載體之改質流程示意圖、本發明之改質流程一示意圖、本發明之改質流程二示意圖、本發明之改質流程三示意圖、本發明之改質流程四示意圖、本發明之改質流程五示意圖、本發明之改質流程
六示意圖及本發明之改質流程七示意圖。如圖所示:本發明係一種奈米碳輻射載體改質方法,係至少包含下列步驟:(A)磁性粒子接枝抗原步驟11:如第2圖所示,於一容置有溶液20之容器2中提供複數個碳磁性粒子(Magnetic Beads)3,並將一抗原(Antigen)/抗體(Antibody)40添加至其中,使該抗原40吸附或結合於該磁性粒子3上,其中該磁性粒子3係為奈米碳輻射載體結構,包括一奈米微粒(Nanoparticle)31、一分佈於該奈米微粒31上之接枝官能性分子32、以及一分佈於該奈米微粒31上之磁性物質33;(B)磁性吸附清洗步驟12:如第3圖所示,於該容器2下方放置一磁鐵(Magnet)21,利用一磁場將該些磁性粒子3聚集吸附住,並將剩餘沒反應之抗原/抗體40及其溶液20以一吸取器(Needle)5吸走,形成純粹帶有抗原/抗體40之磁性粒子3;(C)磁性粒子接枝抗體步驟13:如第4圖所示,添加一待測試樣4至帶有該抗原/抗體40之磁性粒子3之溶液20中,使該待測試樣4中之抗體(Antibody)/抗原(Antigen)41與該抗原40進行特異性反應而吸附或結合至該磁性粒子3上,之後再如步驟(B)施以一磁場將其聚集吸附住,俾以分離出未被吸附或結合之待測試樣4中之其他物質;(D)磁性粒子接枝二級抗體步驟14:如第5圖所示,在接上該抗體41之磁性粒子3之溶液20中,再添加一二級抗體42,俾使吸附或結合有該二級抗體42之磁性粒子3能藉此
標識作為指標進行後續步驟(E)、步驟(F)或步驟(G)之測定,其中該二級抗體42係可分別接上三種不同之訊號分子6,包括放射性同位素(Isotope)、酵素或核酸分子(DNA);(E)放射免疫分析步驟15:如第6圖所示,進行放射免疫分析法(Radioimmunoassay,RIA),用以在該二級抗體42上耦合一碘-125放射性同位素6a,透過該碘-125放射出之伽瑪射線(Gamma Ray,γ-ray),俾以偵測該伽瑪射線之強度判定該待測試樣4中抗體41之含量;(F)冷光/呈色免疫分析步驟16:如第7圖所示,進行冷光免疫分析法(Chemiluminescence Immunoassa,CLIA)/呈色免疫分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA),用以在該二級抗體42上耦合一冷光/呈色酵素6b,透過該冷光/呈色酵素6b作用於冷光基質(Chemiluminescence Substrate)/呈色基質,俾以偵測該光子之發光強度/呈色吸光值判定該待測試樣4中抗體41之含量;以及(G)免疫-聚合酶連鎖反應步驟17:如第8圖所示,進行免疫-聚合酶連鎖反應法(Immuno PCR),用以在該二級抗體42接上一生物素(Biotin)61c,並在一核酸分子6c也接上一生物素61c,透過一鏈抗生物素蛋白(Streptavidin)62c將該核酸分子6c與該二級抗體42連接,再利用Tag酵素進行PCR反應將訊號放大,俾以透過一分離程序將核酸分子6c加以分離以判定該待測試樣4中抗體41之含量。
上述奈米微粒31係為一奈米碳珠,且該接枝官能性分子32係
含有一官能基,並可為羧基(-COOH)、胺基(-NH2)、硫醇基(-SH)、羥基(-OH)、醛基(-COH)或酯基(-COO-),係經酸鹼處理與游離輻射照射所形成者,而該磁性物質33係為鐵、鈷、鎳及三氧化四鐵(Fe4O3)之磁粉。
當本發明於運用時,於一較佳實施例中,係以上述磁性粒子3作為載體之結構,利用其接枝官能性分子32將一抗原40結合於該奈米微粒31表面;繼之,藉由在一容器2底部放置之磁鐵21,使該磁性粒子3中之磁性物質33對磁場起反應而往該磁鐵21方向移動聚集,並利用該吸取器5將剩餘溶液吸走,藉此即可輕易地將剩下沒反應之抗原40清洗去除,形成純粹帶有抗原40之磁性粒子3;接著,加入一待測試樣4於其中,在本實施例中係使用鼻咽癌患者之血清。利用對疾病具專一性吸附之磁性粒子3,能僅將該血清中之Anti-EBV IgA抗體41接枝於該磁性粒子3上,於其中,同樣施以一磁場將該磁性粒子3聚集吸附住,未被吸附住之血清中之其他物質即被分離去除;最後,將此接上EBV IgA之磁性粒子3再接枝上Anti-Human IgA二級抗體42,並再施以一磁場將其聚集吸附住,未被吸附住之二級抗體42即被分離去除,隨後即可利用該二級抗體42可分別接上三種不同之訊號分子6選擇進行放射免疫分析法、冷光免疫分析法、呈色免疫分析法或免疫-聚合酶連鎖反應法之測定。
當進行放射免疫分析法時,係在該二級抗體42上耦合一碘-125放射性同位素6a,該碘-125會放射出伽瑪射線,藉以一伽瑪射線探測器(Gamma-ray Detector)7a偵測該伽瑪射線之強度即可判定該待測試樣4中Anti-EBV IgA抗體41之含量,係具
準確性高且成本低之檢測方法。
當進行冷光/呈色免疫分析法時,係在該二級抗體42上耦合山葵過氧化酶(Horse Radish Peroxidase,HRP)或鹼性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AP)等之冷光/呈色酵素6b,透過此兩種冷光/呈色酵素會作用於冷光/呈色基質,藉以一光電倍增管(Photomultiplier Tube,PMT)偵測器7b偵測該光子之發光強度/呈色吸光值判定該待測試樣4中抗體41之含量。該法所得之訊號相比該放射免疫分析法係可放大許多,不僅具準確度佳,並且亦可配合現行自動化血清免疫分析儀進行,更具方便性。
當進行免疫-聚合酶連鎖反應法時,係在該二級抗體42接上一生物素61c,同時亦在該核酸分子6c接上另一個生物素61c,利用該一鏈抗生物素蛋白62c對生物素係具有很強之吸附力,並且每一個鏈抗生物素蛋白係可接上4個生物素,藉此可把該核酸分子6c與該二級抗體42連接起來,然後再利用Tag酵素進行PCR反應,再透過一凝膠電泳(Gel Electrophoresis)7c將核酸分子6c加以分離以判定該待測試樣4中抗體41之含量。於其中,如果反應30個循環(Cycle),則所得之訊號將可被放大10億倍,故該法係最為敏感之檢測方法,可測到約580個分子之濃度。
由上述可知,本發明使用之磁性粒子針對疾病係具有高專一性,可利用其接枝官能性分子增加接枝抗原之表面積,使被結合於該奈米微粒表面之抗原相比習知-酵素連結免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)明顯可增加許多
倍,因而可提高檢測之靈敏度與準確度,為可取代一般傳統方法而能有效達到大幅降低成本並具方便性之方法,可供應用於疾病之純化醫療上,進行臨床大量例行活體外定量量測癌症診斷與治療之評估。
綜上所述,本發明係一種奈米碳輻射載體改質方法,可有效改善習用之種種缺點,係針對疾病具有高專一性,可利用其接枝官能性分子增加接枝抗原之表面積,使被結合於該奈米微粒表面之抗原可明顯增加許多倍,因而可提高檢測之靈敏度與準確度並有效達到大幅降低成本且具方便性之方法,可供應用於樣品純化或進行臨床大量例行活體外定量量測癌症診斷與治療之評估,進而使本發明之產生能更進步、更實用、更符合使用者之所須,確已符合發明專利申請之要件,爰依法提出專利申請。
惟以上所述者,僅為本發明之較佳實施例而已,當不能以此限定本發明實施之範圍;故,凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾,皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
11‧‧‧步驟(A)碳磁性粒子接枝抗原
12‧‧‧步驟(B)磁性吸附清洗
13‧‧‧步驟(C)碳磁性粒子接枝抗體
14‧‧‧步驟(D)碳磁性粒子接枝二級抗體
15‧‧‧步驟(E)放射免疫分析
16‧‧‧步驟(F)冷光/呈色免疫分析
17‧‧‧步驟(G)免疫-聚合酶連鎖反應
Claims (11)
- 一種奈米碳輻射載體改質方法,係可應用於臨床大量例行活體外定量量測癌症診斷與治療之評估,其至少包含下列步驟:(A)於一溶液中提供複數個碳磁性粒子(Magnetic Beads),並將一抗原(Antigen)/抗體(Antibody)添加至其中,使該抗原吸附或結合於該磁性粒子上,其中該碳磁性粒子係為奈米碳輻射載體結構,包括一碳奈米微粒(Nanoparticle),其為一奈米碳珠、一分佈於該碳奈米微粒上之接枝官能性分子、以及一分佈於該碳奈米微粒上之磁性物質,而該磁性物質係為鐵、鈷、鎳及三氧化四鐵(Fe4O3)之磁粉(Magnet);(B)利用一磁場將該些磁性粒子聚集吸附住,並將剩餘沒反應之抗原及其溶液以一吸取器(Needle)吸走,形成純粹帶有抗原之磁性粒子,而該磁性物質係為鐵、鈷、鎳及三氧化四鐵(Fe4O3)之磁粉(Magnet);(C)添加一待測試樣至帶有該抗原之磁性粒子之溶液中,使該待測試樣中之抗體(Antibody)/抗原(Antigen)與該抗原/抗體進行特異性反應而吸附或結合至該磁性粒子上,之後再施以一磁場將其聚集吸附住,俾以分離出未被吸附或結合之待測試樣中之其他物質;(D)在接上該抗體之磁性粒子之溶液中,再添加一二級抗體,俾使吸附或結合有該二級抗體之磁性粒子能藉此標識作為指標進行後續步驟(E)、步驟(F)或步驟(G)之測定,其中該二 級抗體係可分別接上三種不同之訊號分子,包括放射性同位素(Isotope)、酵素或核酸分子(DNA),且該二級抗體係為Anti-Human IgA;(E)進行放射免疫分析法(Radioimmunoassay,RIA),用以在該二次抗體上耦合一碘-125放射性同位素,透過該碘-125放射出之伽瑪射線(Gamma Ray,γ-ray),俾以偵測該伽瑪射線之強度判定該待測試樣中抗體之含量;(F)進行冷光免疫分析法(Chemiluminescence Immunoassa,CLIA)或呈色免疫分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA),用以在該二級抗體上耦合一冷光/呈色酵素,透過該冷光/呈色酵素作用於冷光基質(Chemiluminescence Substrate)/呈色基質,俾以偵測該光子之發光強度/呈色吸光值判定該待測試樣中抗體之含量;以及(G)進行免疫-聚合酶連鎖反應法(Immuno PCR),用以在該二級抗體接上一生物素(Biotin),並在一核酸分子也接上一生物素,透過一鏈抗生物素蛋白(Streptavidin)將該核酸分子與該二級抗體連接,再利用Tag酵素進行PCR反應將訊號放大,俾以透過一分離程序將核酸分子加以分離以判定該待測試樣中抗體之含量。
- 依據申請專利範圍第1項所述之奈米碳輻射載體改質方法,其中,該待測試樣係為癌症病患之血清。
- 依據申請專利範圍第2項所述之奈米碳輻射載體改質方法,其中,該癌症係為鼻咽癌。
- 依據申請專利範圍第1項所述之奈米碳輻射載體改質方法,其中,該抗體係為Anti-EBV IgA。
- 依據申請專利範圍第1項所述之奈米碳輻射載體改質方法,其中,該步驟(D)在吸附或結合該二級抗體後,係施以一磁場將其聚集吸附住,俾以分離出未被吸附或結合之二級抗體。
- 依據申請專利範圍第1項所述之奈米碳輻射載體改質方法,其中,該步驟(F)之冷光/呈色酵素係為山葵過氧化酶(Horse Radish Peroxidase,HRP)或鹼性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AP)。
- 依據申請專利範圍第1項所述之奈米碳輻射載體改質方法,其中,該步驟(F)係以自動化血清免疫分析儀進行冷光/呈色免疫分析法。
- 依據申請專利範圍第1項所述之奈米碳輻射載體改質方法,其中,該步驟(F)係以光電倍增管(Photomultiplier Tube,PMT)偵測器偵測光子之發光強度/呈色吸光值。
- 依據申請專利範圍第1項所述之奈米碳輻射載體改質方法,其中,該步驟(G)之分離程序係為凝膠電泳(Gel Electrophoresis)。
- 依據申請專利範圍第1項所述之奈米碳輻射載體改質方法,其中,該接枝官能性分子係含有一官能基,係經酸鹼處理與游離輻射照射所形成者。
- 依據申請專利範圍第10項所述之奈米碳輻射載體改質方法,其中,該官能基係可為羧基(-COOH)、胺基(-NH2)、硫醇基(-SH)、羥基(-OH)、醛基(-COH)或酯基(-COO-)。
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