TW201439539A - 游離輻射改質之奈米碳載體應用於檢測技術 - Google Patents

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Abstract

一種奈米碳輻射載體改質方法，係使用針對疾病具有高專一性之具磁性碳微粒子，可利用其接枝官能性分子增加接枝抗原之表面積，使被結合於其奈米微粒表面之抗原／抗體可明顯增加許多倍，因而可提高檢測之靈敏度與準確度並有效達到大幅降低成本且具方便性之方法，可供應用於樣品純化或進行臨床大量例行活體外定量量測癌症診斷與治療之評估者。

Description

游離輻射改質之奈米碳載體應用於檢測技術
本發明係有關於一種奈米輻射載體改質方法，尤指涉及一種針對疾病使用具有高專一性之 具磁性碳微粒子，特別係指 可提高檢測之靈敏度與準確度 ，並達到大幅降低成本且具方便性之方法， 可供應用於樣品純化或進行臨床大量例行活體外定量量測癌症診斷與治療之評估者。
按，傳統之酵素連結免疫吸附分析法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）如第９圖所示，其只能在容器８底部塗覆上一層抗原９，因此該抗原９之表面積使用有限，並無法有效提高檢測時之靈敏度。故，ㄧ般習用者係無法符合使用者於實際使用時之所需。
本發明之主要目的係在於，克服習知技藝所遭遇之上述問題並提供一種使用針對疾病具有高專一性之 具磁性碳微粒子，可利用其接枝官能性分子增加接枝抗原／抗體之表面積，使被結合於其奈米微粒表面之抗原 可明顯增加許多倍，因而可提高檢測之靈敏度與準確度 並有效達到大幅降低成本且具方便性之方法，進行臨床大量例行活體外定量量測癌症診斷與治療之評估者 與樣品純化。
為達以上之目的，本發明係一種奈米碳輻射載體改質方法，係於一溶液中提供複數個 碳磁性粒子（Magnetic Beads），並將一抗原（Antigen）／抗體（Antibody）添加至其中，使該抗原 ／抗體吸附或結合於該磁性粒子上；利用一磁場將該些磁性粒子聚集吸附住，並將剩餘沒反應之抗原 ／抗體及其溶液以一吸取器（Needle）吸走，形成純粹帶有抗原／抗體之磁性粒子；添加一待測試樣至帶有該抗原之磁性粒子之溶液中，使該待測試樣中之抗體（Antibody）/抗原（Antigen）與該抗原／抗體進行特異性反應而吸附或結合至該磁性粒子上，之後再施以一磁場將其聚集吸附住，俾以分離出未被吸附或結合之待測試樣中之其他物質；在接上該抗體之磁性粒子之溶液中，再添加一二級抗體，俾使吸附或結合有該二級抗體之磁性粒子能藉此標識作為指標進行後續放射免疫分析法（Radioimmunoassay, RIA）、冷光免疫分析法（Chemiluminescence Immunoassa, CLIA）、 呈色免疫分析法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）或進行免疫-聚合酶連鎖反應法（Immuno PCR）之測定，其中在吸附或結合該二級抗體後，同樣再施以一磁場將其聚集吸附住，俾以分離出未被吸附或結合之二級抗體；
當進行放射免疫分析法時，係用以在該二級抗體上耦合一碘-125放射性同位素，透過該碘-125放射出之伽瑪射線（Gamma Ray, γ-ray），俾以偵測該伽瑪射線之強度判定該待測試樣中抗體之含量；
當進行冷光 /呈色免疫分析法時，係用以在該二級抗體上耦合一冷光/ 呈色酵素，透過該冷光/ 呈色酵素作用於冷光基質（Chemiluminescence Substrate）/ 呈色基質，俾以偵測該光子之發光強度/ 呈色吸光值判定該待測試樣中抗體之含量；以及
當進行免疫-聚合酶連鎖反應法時，係用以在該二級抗體接上一生物素（Biotin），並在一核酸分子也接上一生物素，透過一鏈抗生物素蛋白（Streptavidin）將該核酸分子與該二 級抗體連接，再利用Tag酵素進行PCR反應將訊號放大，俾以透過一分離程序將核酸分子加以分離以判定該待測試樣中抗體之含量。
 (本發明部分)
11．．．步驟(A)碳磁性粒子接枝抗原
12．．．步驟(B)磁性吸附清洗
13．．．步驟(C)碳磁性粒子接枝抗體
14．．．步驟(D)碳磁性粒子接枝二級抗體
15．．．步驟(E)放射免疫分析
16．．．步驟(F)冷光/呈色免疫分析
17．．．步驟(G)免疫-聚合酶連鎖反應
2．．．容器
20．．．溶液
21．．．磁鐵
3．．．碳磁性粒子
31．．．奈米微粒
32．．．接枝官能性分子
33．．．磁性物質
4．．．待測試樣
40．．．抗原/抗體
41．．．抗體/抗原
42．．．二級抗體
5．．．吸取器
6．．．訊號分子
6a．．．放射性同位素
6b．．．冷光/呈色酵素
6c．．．核酸分子
61c．．．生物素
62c．．．鏈抗生物素蛋白
7a．．．伽瑪射線探測器
7b．．．光電倍增管偵測器
7c．．．凝膠電泳
(習用部分)
8．．．容器
9．．．抗原
第１圖，係本發明之奈米碳輻射載體之改質流程示意圖。
第２圖，係本發明之改質流程一示意圖。
第３圖，係本發明之改質流程二示意圖。
第４圖，係本發明之改質流程三示意圖。
第５圖，係本發明之改質流程四示意圖。
第６圖，係本發明之改質流程五示意圖。
第７圖，係本發明之改質流程六示意圖。
第８圖，係本發明之改質流程七示意圖。

第９圖，係習用之酵素連結免疫吸附分析法示意圖。
請參閱『第１圖～第８圖』所示，係分別為本發明之奈米碳輻射載體之改質流程示意圖、本發明之改質流程一示意圖、本發明之改質流程二示意圖、本發明之改質流程三示意圖、本發明之改質流程四示意圖、本發明之改質流程五示意圖、本發明之改質流程六示意圖及本發明之改質流程七示意圖。如圖所示：本發明係一種奈米碳輻射載體改質方法，係至少包含下列步驟：
（Ａ）磁性粒子接枝抗原步驟１１：如第２圖所示，於一容置有溶液２０之容器２中提供複數個 碳磁性粒子（Magnetic Beads）３，並將一抗原（Antigen） ／抗體（Antibody）４０添加至其中，使該抗原４０吸附或結合於該磁性粒子３上，其中該磁性粒子３係為奈米碳輻射載體結構，包括一奈米微粒（Nanoparticle）３１、一分佈於該奈米微粒３１上之接枝官能性分子３２、以及一分佈於該奈米微粒３１上之磁性物質３３；
（Ｂ）磁性吸附清洗步驟１２：如第３圖所示，於該容器２下方放置一磁鐵（Magnet）２１，利用一磁場將該些磁性粒子３聚集吸附住，並將剩餘沒反應之抗原 ／抗體４０及其溶液２０以一吸取器（Needle）５吸走，形成純粹帶有抗原 ／抗體４０之磁性粒子３；
（Ｃ）磁性粒子接枝抗體步驟１３：如第４圖所示，添加一待測試樣４至帶有該抗原 ／抗體４０之磁性粒子３之溶液２０中，使該待測試樣４中之抗體（Antibody） ／抗原（Antigen）４１與該抗原４０進行特異性反應而吸附或結合至該磁性粒子３上，之後再如步驟（Ｂ）施以一磁場將其聚集吸附住，俾以分離出未被吸附或結合之待測試樣４中之其他物質；
（Ｄ）磁性粒子接枝二 級抗體步驟１４：如第５圖所示，在接上該抗體４１之磁性粒子３之溶液２０中，再添加一二 級抗體４２，俾使吸附或結合有該二 級抗體４２之磁性粒子３能藉此標識作為指標進行後續步驟（Ｅ）、步驟（Ｆ）或步驟（Ｇ）之測定，其中該二 級抗體４２係可分別接上三種不同之訊號分子６，包括放射性同位素（Isotope）、酵素或核酸分子（DNA）；
（Ｅ）放射免疫分析步驟１５：如第６圖所示，進行放射免疫分析法（Radioimmunoassay, RIA），用以在該二 級抗體４２上耦合一碘-125放射性同位素６a，透過該碘-125放射出之伽瑪射線（Gamma Ray, γ-ray），俾以偵測該伽瑪射線之強度判定該待測試樣４中抗體４１之含量；
（Ｆ）冷光 /呈色免疫分析步驟１６：如第７圖所示，進行冷光免疫分析法（Chemiluminescence Immunoassa, CLIA）/ 呈色免疫分析法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA），用以在該二 級抗體４２上耦合一冷光/ 呈色酵素６b，透過該冷光 /呈色酵素６b作用於冷光基質（Chemiluminescence Substrate）/ 呈色基質，俾以偵測該光子之發光強度/ 呈色吸光值判定該待測試樣４中抗體４１之含量；以及
（Ｇ）免疫-聚合酶連鎖反應步驟１７：如第８圖所示，進行免疫-聚合酶連鎖反應法（Immuno PCR），用以在該二 級抗體４２接上一生物素（Biotin）６１c，並在一核酸分子６c也接上一生物素６１c，透過一鏈抗生物素蛋白（Streptavidin）６２c將該核酸分子６c與該二 級抗體４２連接，再利用Tag酵素進行PCR反應將訊號放大，俾以透過一分離程序將核酸分子６c加以分離以判定該待測試樣４中抗體４１之含量。
上述奈米微粒３１係為一奈米碳珠，且該接枝官能性分子３２係含有一官能基，並可為羧基（-COOH）、胺基（-NH2）、硫醇基（-SH）、羥基（-OH）、醛基（-COH）或酯基（-COO-），係經酸鹼處理與游離輻射照射所形成者，而該磁性物質３３係為鐵、鈷、鎳及三氧化四鐵（Fe4O3）之磁粉。
當本發明於運用時，於一較佳實施例中，係以上述磁性粒子３作為載體之結構，利用其接枝官能性分子３２將一抗原４０結合於該奈米微粒３１表面；繼之，藉由在一容器２底部放置之磁鐵２１，使該磁性粒子３中之磁性物質３３對磁場起反應而往該磁鐵２１方向移動聚集，並利用該吸取器５將剩餘溶液吸走，藉此即可輕易地將剩下沒反應之抗原４０清洗去除，形成純粹帶有抗原４０之磁性粒子３；接著，加入一待測試樣４於其中，在本實施例中係使用鼻 咽癌患者之血清。利用對疾病具專一性吸附之磁性粒子３，能僅將該血清中之Anti-EBV IgA抗體４１接枝於該磁性粒子３上，於其中，同樣施以一磁場將該磁性粒子３聚集吸附住，未被吸附住之血清中之其他物質即被分離去除；最後，將此接上EBV IgA之磁性粒子３再接枝上Anti-Human IgA二 級抗體４２，並再施以一磁場將其聚集吸附住，未被吸附住之二 級抗體４２即被分離去除，隨後即可利用該二 級抗體４２可分別接上三種不同之訊號分子６選擇進行放射免疫分析法、冷光免疫分析法、 呈色免疫分析法或免疫-聚合酶連鎖反應法之測定。
當進行放射免疫分析法時，係在該二 級抗體４２上耦合一碘-125放射性同位素６a，該碘-125會放射出伽瑪射線，藉以一伽瑪射線探測器（Gamma-ray Detector）７a偵測該伽瑪射線之強度即可判定該待測試樣４中Anti-EBV IgA抗體４１之含量，係具準確性高且成本低之檢測方法。
當進行冷光 /呈色免疫分析法時，係在該二 級抗體４２上耦合山葵過氧化酶（Horse Radish Peroxidase,HRP）或鹼性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AP）等之冷光 /呈色酵素６b，透過此兩種冷光 /呈色酵素會作用 於冷光 /呈色基質，藉以一光電倍增管（Photomultiplier Tube, PMT）偵測器７b偵測該光子之發光強度 /呈色吸光值判定該待測試樣４中抗體４１之含量。該法所得之訊號相比該放射免疫分析法係可放大許多，不僅具準確度佳，並且亦可配合現行自動化血清免疫分析儀進行，更具方便性。
當進行免疫-聚合酶連鎖反應法時，係在該二 級抗體４２接上一生物素６１c，同時亦在該核酸分子６c接上另一個生物素６１c，利用該一鏈抗生物素蛋白６２c對生物素係具有很強之吸附力，並且每一個鏈抗生物素蛋白係可接上4個生物素，藉此可把該核酸分子６c與該二 級抗體４２連接起來，然後再利用Tag酵素進行PCR反應，再透過一凝膠電泳（Gel Electrophoresis）７c將核酸分子６c加以分離以判定該待測試樣４中抗體４１之含量。於其中，如果反應30個循環（Cycle），則所得之訊號將可被放大10億倍，故該法係最為敏感之檢測方法，可測到約580個分子之濃度。
由上述可知，本發明使用之磁性粒子針對疾病係具有高專一性，可利用其接枝官能性分子增加接枝抗原之表面積，使被結合於該奈米微粒表面之抗原相比習知- 酵素連結免疫吸附分析法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）明顯可增加許多倍，因而可提高檢測之靈敏度與準確度 ，為可取代一般傳統方法而能有效達到大幅降低成本並具方便性之方法，可供應用於疾病之純化醫療上，進行臨床大量例行活體外定量量測癌症診斷與治療之評估 。
綜上所述，本發明係一種奈米碳輻射載體改質方法，可有效改善習用之種種缺點，係針對疾病具有高專一性，可利用其接枝官能性分子增加接枝抗原之表面積，使被結合於該奈米微粒表面之抗原 可明顯增加許多倍，因而可提高檢測之靈敏度與準確度並有效達到大幅降低成本且具方便性之方法 ，可供應用於樣品純化或進行臨床大量例行活體外定量量測癌症診斷與治療之評估，進而使本發明之産生能更進步、更實用、更符合使用者之所須，確已符合發明專利申請之要件，爰依法提出專利申請。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
11．．．步驟(A)碳磁性粒子接枝抗原
12．．．步驟(B)磁性吸附清洗
13．．．步驟(C)碳磁性粒子接枝抗體
14．．．步驟(D)碳磁性粒子接枝二級抗體
15．．．步驟(E)放射免疫分析
16．．．步驟(F)冷光/呈色免疫分析
17．．．步驟(G)免疫-聚合酶連鎖反應

Claims (14)

  1. 一種奈米碳輻射載體改質方法，係可應用於臨床大量例行活體外定量量測癌症診斷與治療之評估，其至少包含下列步驟：
        （Ａ）於一溶液中提供複數個 碳磁性粒子（Magnetic Beads），並將一抗原（Antigen）/抗體（Antibody）添加至其中，使該抗原吸附或結合於該磁性粒子上，其中該 碳磁性粒子係為奈米碳輻射載體結構，包括一 碳奈米微粒（Nanoparticle）、一分佈於該 碳奈米微粒上之接枝官能性分子、以及一分佈於該奈米微粒上之磁性物質；
        （Ｂ）利用一磁場將該些磁性粒子聚集吸附住，並將剩餘沒反應之抗原及其溶液以一吸取器（Needle）吸走，形成純粹帶有抗原之磁性粒子；
        （Ｃ）添加一待測試樣至帶有該抗原之磁性粒子之溶液中，使該待測試樣中之抗體（Antibody）／抗原(Antigen)與該抗原/抗體進行特異性反應而吸附或結合至該磁性粒子上，之後再施以一磁場將其聚集吸附住，俾以分離出未被吸附或結合之待測試樣中之其他物質；
        （Ｄ）在接上該抗體之磁性粒子之溶液中，再添加一二 級抗體，俾使吸附或結合有該二 級抗體之磁性粒子能藉此標識作為指標進行後續步驟（Ｅ）、步驟（Ｆ）或步驟（Ｇ）之測定，其中該二次抗體係可分別接上三種不同之訊號分子，包括放射性同位素（Isotope）、酵素或核酸分子（DNA）；
        （Ｅ）進行放射免疫分析法（Radioimmunoassay, RIA），用以在該二次抗體上耦合一碘-125放射性同位素，透過該碘-125放射出之伽瑪射線（Gamma Ray, γ-ray），俾以偵測該伽瑪射線之強度判定該待測試樣中抗體之含量；
        （Ｆ）進行冷光免疫分析法（Chemiluminescence Immunoassa, CLIA） 或呈色免疫分析法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA），用以在該二 級抗體上耦合一冷光/ 呈色酵素，透過該冷光/ 呈色酵素作用於冷光基質（Chemiluminescence Substrate）/ 呈色基質，俾以偵測該光子之發光強度/ 呈色吸光值判定該待測試樣中抗體之含量；以及
         （Ｇ）進行免疫-聚合酶連鎖反應法（Immuno PCR），用以在該二 級抗體接上一生物素（Biotin），並在一核酸分子也接上一生物素，透過一鏈抗生物素蛋白（Streptavidin）將該核酸分子與該二 級抗體連接，再利用Tag酵素進行PCR反應將訊號放大，俾以透過一分離程序將核酸分子加以分離以判定該待測試樣中抗體之含量。
  2. 依據申請專利範圍第１項所述之奈米碳輻射載體改質方法，其中，該待測試樣係為癌症病患之血清。
  3. 依據申請專利範圍第２項所述之奈米碳輻射載體改質方法，其中，該癌症係為鼻咽癌。
  4. 依據申請專利範圍第１項所述之奈米碳輻射載體改質方法，其中，該抗體係為Anti-EBV IgA。
  5. 依據申請專利範圍第１項所述之奈米碳輻射載體改質方法，其中，該二 級抗體係為Anti-Human IgA。
  6. 依據申請專利範圍第１項所述之奈米碳輻射載體改質方法，其中，該步驟（Ｄ）在吸附或結合該二 級抗體後，係施以一磁場將其聚集吸附住，俾以分離出未被吸附或結合之二 級抗體。
  7. 依據申請專利範圍第１項所述之奈米碳輻射載體改質方法，其中，該步驟（Ｆ）之冷光 /呈色酵素係為山葵過氧化酶（Horse Radish Peroxidase,HRP）或鹼性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AP）。
  8. 依據申請專利範圍第１項所述之奈米碳輻射載體改質方法，其中，該步驟（Ｆ）係以自動化血清免疫分析儀進行冷光 /呈色免疫分析法。
  9. 依據申請專利範圍第１項所述之奈米碳輻射載體改質方法，其中，該步驟（Ｆ）係以光電倍增管（Photomultiplier Tube, PMT）偵測器偵測光子之發光強度 /呈色吸光值。
  10. 依據申請專利範圍第１項所述之奈米碳輻射載體改質方法，其中，該步驟（Ｇ）之分離程序係為凝膠電泳（Gel Electrophoresis）。
  11. 依據申請專利範圍第１項所述之奈米碳輻射載體改質方法，其中，該奈米微粒係為一奈米碳珠。
  12. 依據申請專利範圍第１項所述之奈米碳輻射載體改質方法，其中，該接枝官能性分子係含有一官能基，係經酸鹼處理與游離輻射照射所形成者。
  13. 依據申請專利範圍第１２項所述之奈米碳輻射載體改質方法，其中，該官能基係可為羧基（-COOH）、胺基（-NH2）、硫醇基（-SH）、羥基（-OH）、醛基（-COH）或酯基（-COO-）。
  14. 依據申請專利範圍第１項所述之奈米碳輻射載體改質方法，其中，該磁性物質係為鐵、鈷、鎳及三氧化四鐵（Fe4O3）之磁粉（Magnet）。
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