CN107208136A - 通过与免疫测定法偶联的核酸扩增的固体支持物上的分析物检测 - Google Patents

通过与免疫测定法偶联的核酸扩增的固体支持物上的分析物检测 Download PDF

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Abstract

本发明的实施方案提供了一种用于检测来源于样品中的至少一种分析物的方法，所述方法包括步骤：a)使所述样品沉积在固体支持物的表面上；b)将至少一部分所述固体支持物转移至适于针对关注的一种或多种分析物进行特异性结合测定的容器；c)任选洗涤所述部分；d)向所述容器中加入用于各关注分析物的单个特异性结合配偶体，所述结合配偶体经寡核苷酸序列标记；e)将所述部分与核酸扩增试剂混合；f)使所述寡核苷酸序列扩增；和g)检测扩增的核酸。本发明亦提供用于使用所述方法检测来源于样品中的至少一种分析物的试剂盒。

Description

通过与免疫测定法偶联的核酸扩增的固体支持物上的分析物 检测
发明领域
本发明涉及用于检测来源于样品的至少一种分析物的方法。更具体而言，本发明涉及用于固体支持物上的分析物的超灵敏检测法，以及用于进行所述方法的试剂盒。
发明背景
免疫-聚合酶链式反应(iPCR)为用于蛋白质及其他抗原的超灵敏分析的有前景的技术。其将已充分建立的ELISA方法与PCR的信号放大能力组合在一起。与常规ELISA相比，iPCR得到在灵敏性上约1000倍至10,000倍的增加(Adler, M.、Wacker, R. & Niemeyer C.M.用于蛋白质的常规超灵敏定量的实时免疫PCR测定法(A real-time immune-PCR assayfor routine ultrasensitive quantification of proteins). 生物化学和生物物理学研究通讯(Biochemical and Biophysical Research Communications) (2003) 308，240-250。)，并显示了高达六个数量级的非常宽的线性动态范围。因此，使用免疫聚合酶链式反应(iPCR)和实时iPCR测定法使得能够检测通过常规免疫测定法难以检出的复合生物样品中的罕见生物标志物。
常规ELISA法已用于检测来自涂布至903/Guthrie卡的样品的HIV、HTLV、HCV和许多其他疾病标志物(Parker, S.P. & Cubitt, W.D.，J. Clin. Pathol. (1999) 52，633-639。)，例如，已针对用于干燥全血斑点(即涂布至903纸的血液)洗脱物，对市购可得的人免疫缺陷病毒1型p24抗原ELISA测定法成功进行修改，并用作婴儿诊断的可靠检验(Patton,J.C.、Sherman, G.G.、Coovadia, A.H.、Stevens, W.S. & Meyers, T.M.，Clin. Vaccine.Immunol. (2006)，13 (1)，152-155。)。免疫PCR已用于许多与传统ELISA相同的应用，例如朊病毒、毒素、激素、杀虫剂、病毒和其他抗原的检测。iPCR已用于检测原癌基因ETS1(Zhou, H.、Fisher R.J. & Papas, T.S.，用于超灵敏靶蛋白检测的通用免疫PCR(Universal immune-PCR for ultra-sensitive target protein detection)，核酸研究(Nucleic Acids Research)，(1993) 21，6038-6039。)、TNF-α (Komatsu, M.等，如通过高灵敏性免疫PCR测量的患有炎性肠病的患者血清中的肿瘤坏死因子-α (Tumour necrosisfactor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measuredby a highly sensitive immune-PCR). Clin. Chem. (2001) 47，1297-1301。)、白介素-3和干细胞因子(Putuckova, L.等，与免疫PCR和ELISA相比，使用基于官能化金纳米粒子的免疫PCR快速灵敏检测细胞因子(Rapid and sensitive detection of cytokines usingfunctionalized gold nanoparticles based immune-PCR, comparison with immuno-PCR and ELISA). J.Immunol. Methods (2011) 37，38-47；T-细胞受体(Sperl, J.等，可溶性T细胞受体；经由ELISA或免疫PCR在流体相中的检测和定量测定法(Soluble T cellreceptors; detection and quantitative assay in fluid phase via ELISA orimmune-PCR). J. Immunol. Methods (1995) 186，181-194。)、血管紧张素原(Sugawara,K.等，使用相同的第一和第二多克隆抗体用于人血管紧张素原的高灵敏免疫聚合酶链式反应测定法(A highly sensitive immune-polymerase chain reaction assay for humanangiotensinogen using the identical first and second polyclonal antibodies).Clin. Chim. Acta (2000) 299，45-54。)、蛋白毒素(He, X.等，通过新型免疫PCR测定法灵敏检测环境样品中的志贺毒素2及其某些变体(Sensitive detection of Shiga toxin 2and some of its variants in environmental samples by a novel immune-PCRassay). Appl. Environ. Microbiol. (2011) 77，3558-3564；Zhang, W.等，用于检测低浓度的Shiga毒素2及变体的新型免疫PCR测定法(New immune-PCR assay for detectionof low concentrations of Shiga toxin 2 and variants). J. Clin. Microbiol.(2008) 46，1292-1297。)、朊病毒蛋白(Barletta, J.A.等，使用实时免疫PCR检测绵羊瘙痒病感染的仓鼠脑匀浆中超低水平的病理性朊病毒蛋白(Detection of ultra-low levelsof pathologic prion protein in scrapie infected hamster brain homogenatesusing real-time immuno-PCR) J. Virol. Methods (2005) 127，154-164。)、潜在的病毒性及细菌性抗原(Niemeyer, C.M.、Adler, M. & Wacker, R.免疫PCR：通过核酸扩增的蛋白质的高灵敏性检测(Immuno-PCR: high sensitivity detection of proteins bynucleic acid amplification). Trends Biotechnol. (2005) 3，208-216；Perez, J.W.等，使用纳米粒子扩增的免疫聚合酶链式反应检测呼吸道合胞体病毒(Detection ofrespiratory syncytial virus using nanoparticle amplified immuno polymerasechain reaction). Anal. Biochem. (2011) 410，141-148。)、分枝杆菌RD抗原(Mehta,P.K.等，基于分枝杆菌RD抗原的超灵敏聚合酶链式反应扩增的免疫测定法的开发：涉及结核的血清诊断(Development of an ultrasensitive polymerase chain reaction-amplified immunoassay based on mycobacterial RD antigens: implications forthe serodiagnosis of tuberculosis).诊断微生物学及传染病(DiagnosticMicrobiology and Infectious Disease) (2012) 72，166-174。)，并且可修改为用于各种传染病的新型诊断工具(Malou, N. & Raoult, D.检测抗原和抗体的有前景的超灵敏诊断法(A promising ultrasensitive diagnostic method to detect antigens andantibodies). Trends Microbiol. (2011) 19，295-392。)。
例如，iPCR可用于检测固相固定的抗原。习惯上，将使用生物素化的IgG和链霉抗生物素酶缀合物的ELISA测定法用于检测固相固定的抗原。实时iPCR可用作更灵敏的测定法，其使用抗体-DNA缀合物。为了提高rt-iPCR测定法的性能，可在PCR扩增之前向PCR混合物中加入内部竞争者DNA片段。针对待扩增的各DNA，加入荧光基团标记的TaqMan探针。在PCR扩增期间，通过聚合酶的外切核酸酶活性降解所述TaqMan探针，从而释放荧光染料，其通过所述仪器原位定量。再如另一个实例，可将夹心iPCR测定法应用于例如使用抗-r槲寄生素抗体-DNA聚集物检测人血浆样品中的r槲寄生素。间接iPCR测定法使用对来自特定物种的IgG具有结合特异性的DNA-抗体缀合物，作为用于检测与待测抗原偶联的第一抗体的第二试剂。例如，将对兔-IgG特异的DNA-抗体缀合物，称为抗兔第二试剂(“RSR，” CHIMERABIOTEC)，用于检测兔-IgG，或者将抗鼠第二试剂(“MSR，”CHIMERA BIOTEC)用于检测鼠IgG。(Adler, M.、Wacker, R. & Niemeyer C. M.用于常规超灵敏定量蛋白质的实时免疫PCR测定法(A real-time immune-PCR assay for routine ultrasensitive quantificationof proteins).生物化学和生物物理学研究通讯(Biochemical and BiophysicalResearch Communications) (2003) 308，240-250。)。
存在对于将iPCR及相关方法应用于检测沉积在固体支持物上的低丰度分析物而无需将所述分析物从所述固体支持物分离的需求。所述干燥形式提供了增加的益处，其与以非液体形式储存样品的便利性和稳定性相关。
发明概述：
本发明描述了使得能够检测来自样品中的低丰度分析物的新方法和试剂盒。因此，在一方面，提供了用于检测来源于样品中的至少一种分析物的方法。所述方法包括步骤：
a)使所述样品沉积在固体支持物的表面上；
b)将至少一部分所述固体支持物转移至适于针对关注的一种或多种分析物进行特异性结合测定的容器；
c)任选洗涤所述部分；
d)向所述容器中加入用于各关注分析物的单个特异性结合配偶体，所述结合配偶体经寡核苷酸序列标记；
e)将所述部分与核酸扩增试剂混合；
f)使所述寡核苷酸序列扩增；和
g)检测扩增的核酸。
在另一方面，本发明提供用于进行所述新方法的试剂盒。所述试剂盒包含固体支持物；经寡核苷酸序列标记的用于各关注分析物的特异性结合配偶体；用于扩增所述寡核苷酸序列的试剂；和用户说明书。
本发明的另外的详情和优点，将因下文说明书和权利要求而显而易见。
附图简述
图1显示来自固体支持物的模型蛋白(IL-2)的测量结果。
图2显示来自经肝素处理并保存在不同固体支持物上的人血的500 bp基因组DNA片段的直接扩增的结果。
图3显示来自经EDTA处理并保存在不同固体支持物上的人血的1 kb、3.8 kb和7.5kb基因组DNA扩增子的直接PCR的结果。
发明详述：
在一方面，本发明提供使用iPCR来检测与诸如903 Guthrie卡、31-ETF纸、FTA或FTA洗脱纸等固体支持物结合的抗体或抗原的方法和试剂盒。本发明使得在浓度通常太低而不能通过现有应用检测诊断的用于单细胞分析的样品或体液(例如唾液、血、尿、淋巴等)成为可能。其使得能够使用903卡(和其他固体支持物)用于疾病的诊断，这在先前是不可行的。所述PCR扩增法亦可替换成等温扩增(例如使用Phi29 DNA聚合酶的滚环扩增)。
因此，在一个实施方案中，提供了用于检测来源于样品的至少一种分析物的方法，其包括步骤：
a)使所述样品沉积在固体支持物的表面上；
b)将至少一部分所述固体支持物转移至适于针对关注的一种或多种分析物进行特异性结合测定的容器；
c)任选洗涤所述转移的固体支持物的部分；
d)向所述容器中加入用于各关注分析物的单个特异性结合配偶体，所述结合配偶体经寡核苷酸序列标记；
e)将所述部分与核酸扩增试剂混合；
f)使所述寡核苷酸序列扩增；和
g)检测扩增的核酸。
对于术语“分析物”，其意指在分析程序中受关注且通常在实验室中检测的物质或化学成分。因此分析物为正在进行分析的物质或化学成分。
对于术语“容器”，其意指用于容纳含所述分析物的固体支持物的一部分的空腔物体，用于根据本发明的实施方案检测所述分析物。容器的实例有但不限于管、试管、微孔板、丛式孔（cluster wells）、皿、瓶等。用于制造容器的材料的实例有但不限于玻璃、塑料、金属、橡胶、聚四氟乙烯树脂和聚乙烯。
特异性结合测定为测量分子的存在或浓度的生化试验，通常通过使用特异性结合配偶体、抗体或免疫球蛋白、适体、核酸序列、配体或特异性结合蛋白或受体在溶液中测量。通过特异性结合测定检测的分子常常称为分析物。使用特异性结合测定法测量的分析物时常用于临床、研究、环境、法医及其他分析目的。
术语“寡核苷酸”是指长度为15-500 nt、优选20-400 nt、更优选30-300 nt的单链DNA或RNA分子。对于PCR或PCR扩增反应的变体，所述寡核苷酸与抗体或特异性结合部分连接并用作扩增的标签或模板。在另一些其它扩增方法中，所述寡核苷酸可用作引物，例如在其中所述抗体与线性寡核苷酸结合的RCA的情况下。然后可加入与所述线性寡核苷酸结合的单链环状寡核苷酸(其包含所述线性寡核苷酸的互补序列)。然后所述线性寡核苷酸将成为用于DNA/RNA复制的引物。
在某些实施方案中，用于检测来源于样品中的至少一种分析物的所述方法进一步包括基于扩增核酸的数量来定量关注的分析物。例如，可使用核酸成像系统或者通过qPCR/Taqman测定法来定量扩增的核酸。
在某些实施方案中，所述固体支持物包括：纤维素基纸、机织或非机织纤维材料(包括人造的或天然存在的聚合纤维，例如藻酸盐)、矿物纤维基材料(例如玻璃纤维材料)或者经表面处理的固体材料，例如化学处理或机械处理的材料，包括激光蚀刻表面，均提供有粗糙度足以支持的表面微粗糙度，均任选经稳定试剂或稳定试剂混合物进行化学处理。所述固体支持物亦可由尼龙或硝酸纤维素材料制成。
在某些实施方案中，所述固体支持物为纤维的，例如纤维素纤维材料，或者玻璃纤维/微纤维材料。
在某些实施方案中，所述固体支持物为多孔聚合物，例如多孔膜材料，如聚酯、聚醚砜(PES)、聚酰胺(尼龙)、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、硝酸纤维素、醋酸纤维素、藻酸盐或氧化铝。
在某些其他的实施方案中，所述固体支持物为但不限于FTA纸、FTA洗脱纸、Whatman 903纸、Whatman 31-ETF纸、藻酸盐或藻酸盐包被的支持物。
在本文中，FTA (包括FTA微型卡、FTA指示卡和FTA经典卡)为使用例如弱碱、螯合剂和阴离子表面活性剂等稳定化化学品处理的纤维素纤维纸，借此所述支持物表面浸透有所述稳定化化学品。以此方式，所述生物样品材料可作为干燥材料储存在所述固体支持物上达多个月乃至数年，从而在需要的情况下，允许用于在环境温度下将所述固体支持物运输至实验室的时间。然后可能进行简单的回收，通过例如从所述固体支持物纯化所述生物样品材料。或者，可使用直接的或经洗涤的打孔方案处理所述样品。将样品储存在所述固体支持物上，亦使得能够通过移出一部分所述样品并根据需要检测所述部分，随时间重新检测所述样品。
在本文中，FTA洗脱纸描述类似的纸，但经诸如硫氰酸胍等离液剂包被。在本文中，Whatman 903描述未包被的纤维素纤维纸。
在某些实施方案中，所述固体支持物表面为经化学品浸透的，例如弱碱、螯合剂、阴离子表面活性剂及任选抗氧化剂。
在某些实施方案中，所述固体支持物表面为经离液剂浸透的。在一个实施方案中，所述离液盐为胍盐。在另一些实施方案中，所述胍盐选自硫氰酸胍、氯化胍和盐酸胍。在一个实施方案中，所述离液盐为钠盐，例如碘化钠。
在某些实施方案中，所述固体支持物为纤维素基基质。在一些实施方案中，所述固体支持物为经表面活性剂处理的纤维素基固体支持物。术语“表面活性剂”是指降低两种液体之间或者液体与固体之间的表面张力(或界面张力)的化合物。表面活性剂可充当去污剂、湿润剂、乳化剂、起泡剂和分散剂。
某些固体支持物描述于WO 2012113911、WO 2012113907、WO 2012113906和WO2013165870，所述公开内容各自通过引用以其整体结合。
意图上述固体支持物用于大致平坦的构造，但备选地，可例如用于卷形物上。
在某些实施方案中，直接从自含所述样品的固体支持物上切下的冲孔片进行所述一个或多个测定。因此，可直接从自样品已涂布于其上的固体支持物切下的冲孔片进行所述测定。可将含所述样品的冲孔片直接加至测定反应中。任选的是，可进行简单的“打孔”加入，其中在加至所述反应之前，将所述切下的冲孔片(固体支持物加样品)洗涤以去除任何可能的抑制性化学品。
在某些实施方案中，在存在多价螯合剂的情况下进行添加和混合步骤，以抵消特异性结合配偶体结合或酶活性的表面活性剂抑制。在某些实施方案中，所述多价螯合剂为环糊精。环糊精充当去污剂的多价螯合剂，其包被在特定固体支持物的外部，从而可进行改进的DNA扩增和特异性结合测定。
在某些实施方案中，所述固体支持物包被有特异性结合部分或者表面电荷改性剂。所述特异性结合部分例如抗体(多克隆和单克隆抗体二者)、特异性受体蛋白、配体、核酸序列及类似试剂，通过与标本中的物质特异性结合或起化学反应，意图其用于鉴定、测量和定量标本中独立的化学物质或分析物。所述表面电荷改性剂包括离子交换纸，例如带阳离子或阴离子电荷的纤维素纸。
在某些实施方案中，所述样品来源于生物样品。生物样品(或者生物标本，亦称为生物样本)为这样的生物样品，其包括但不限于血、血浆、血清、脑脊液、滑液、淋巴液、唾液、颊的、尿、粪便、皮肤、毛发或组织。其他生物样品为传染性物质(例如细菌、病毒、立克次氏体、寄生虫或真菌)和获自动物的样品。
在某些实施方案中，所述样品为药物或来源于环境，例如污染物、除草剂、杀虫剂、重金属或药物。对于“环境”，其意指作为整体或者特定地理区域中的自然界。
在某些实施方案中，所述样品来源于犯罪现场且用于法医目的，例如但不限于血、精液、毛根、纤维、酒精、药物滥用、爆炸物和火药。对于“犯罪现场”，其意指犯罪发生的位置或者可发现犯罪证据的另一位置，且包括执法机关人员从其回收物证的区域。
在某些实施方案中，所述特异性结合配偶体为抗体。
在某些其他的实施方案中，所述特异性结合配偶体为适体。
在其他实施方案中，所述特异性结合配偶体为天然蛋白或重组蛋白。
在又另外的实施方案中，所述特异性结合配偶体为重组普列克底物蛋白同源结构域、FYVE结构域、PX结构域、ENTH结构域、CALM结构域、PDZ结构域、PTB结构域、FERM结构域或金属硫蛋白。这些特异性结合配偶体均为肌醇磷脂识别模块，即，其均为磷酸肌醇的特异性结合配偶体。
在另一个实施方案中，所述特异性结合配偶体为网格蛋白衔接蛋白和抑制蛋白家族的成员。网格蛋白衔接蛋白充当特定蛋白质(例如可溶性受体)和脂质的特异性结合配偶体，而抑制蛋白为G蛋白偶联受体的特异性结合配偶体。
在又一个实施方案中，所述特异性结合配偶体为金属硫蛋白，其为富含半胱氨酸的低分子量(MV范围为500-14000 Da)蛋白质的家族。金属硫蛋白可用作生理性污染物和重金属污染物二者的特异性结合配偶体。金属硫蛋白具有通过半胱氨酸残基的巯基来结合锌、铜、硒、镉、汞、银、砷、铅、铁金属的能力。
所述核酸扩增反应可包括聚合酶链式反应。因此，本发明的某些方面涉及应用免疫PCR用于沉积在固体支持物上的样品。如前所述的，常规的ELISA法已用于检测来自沉积于诸如903/Guthrie卡等固体支持物上的样品中的HIV、HTLV、HCV和许多其他的疾病标志物(Parker, S.P. & Cubitt, W.D. J. Clin. Pathol. (1999) 52，633-639)。例如，已针对用于干燥全血斑点(即涂布至903滤纸的血液)洗脱物，对市购可得的人免疫缺陷病毒1型p24抗原ELISA测定法成功进行修改，并用作婴儿诊断的可靠检验(Patton, J.C.、Sherman,G.G.、Coovadia, A.H.、Stevens, W.S. & Meyers, T.M.，Clin. Vaccine. Immunol.(2006)，13 (1)，152-155。)。随着免疫PCR的显著增加的灵敏性，使用根据本发明的某些方面的方法，目前成功检测低丰度样品。
在某些实施方案中，所述核酸扩增反应可包括等温扩增反应。所述等温扩增反应可包括滚环扩增。当所述核酸扩增反应包括滚环扩增时，可使用T4连接酶将所述寡核苷酸环化，并使用Phi 29 DNA聚合酶进行扩增。或者，使用环状DNA，所述寡核苷酸可充当与所述环状DNA杂交的引物，且可在存在Phi29 DNA聚合酶的情况下进行RCA。
在某些实施方案中，所述核酸扩增包括环介导等温扩增、T7 RNA聚合酶、重组酶聚合酶扩增或基于核酸序列的扩增。
在某些实施方案中，用于检测来源于样品中的至少一种分析物的所述方法可以进一步包括基于扩增核酸的数量来定量关注的分析物。用于定量所述核酸扩增产物的方法为众所周知的。例如，所述扩增产物可通过杂交反应来测量。
在某些实施方案中，所述方法可进行多重组合。因此，通过检测与各特异性结合配偶体缔合的扩增核酸序列，可同时分别检测多于一种分析物，所述特异性结合配偶体各自经独特的寡核苷酸序列标记。“多重测定法”或“多重方法”涉及或者为测量或传递来自相同来源的两个或更多个报告(message)的信息或信号的方法。简单地说，多重测定法为在所述测定法的单次运行/循环中同时测量多重分析物的一类测定法。其与每次测量一种分析物的程序存在区别。(多重测定法的一个实例通过Ugozzoli等，(分析生物化学(AnalyticalBiochemistry)，2002，307，47-53)阐述)。
在某些实施方案中，使用冻干试剂进行所述一个或多个测定法。诸如GEHealthcare’s illustra Ready-To-Go (RTG)产品等冻干试剂为众所周知的。这些试剂可包含特异性结合配偶体，和/或用于分析所述特异性寡核苷酸的试剂等。
在某些实施方案中，预先将所述样品保存在固体支持物上并于室温储存。可容易地将所述样品涂布至所述固体支持物，并允许于环境温度干燥以用于保存。保存在固体支持物上的生物样品可以在较长时期内为稳定的，参见例如，GE Healthcare Life Sciences应用笔记29-0082-33 AA。因此，所述样品可在所述固体支持物上储存达至少30分钟。可将所述样品固定在所述固体支持物上达更长时期，例如至少24小时、至少7天、至少30天、至少90天、至少180天、至少1年以及至少10年。以此方式，所述样品可以适于后续分析的干燥形式储存。通常，将样品储存在-200℃-40℃的温度。此外，任选将储存的样品储存在干性或脱水条件中或者惰性气氛下。
iPCR的能力允许超灵敏检测来自沉积在固体支持物材料上的样品中的抗体或抗原，其带来检测微生物疾病的新工具，尤其是用于检测病毒感染或者用于难以分离的难养菌。本方法亦显著有助于某些细菌性或病毒性疾病的血清学诊断，例如立克次氏体或巨细胞病毒感染，其中传统的血清学方法未能在感染早期检出抗体且其中在数周后检出血清转换。
在另一方面，本发明提供用于进行所述方法的试剂盒，其用以检测来源于样品中的至少一种分析物。所述试剂盒包含固体支持物；经寡核苷酸序列标记的用于各关注分析物的特异性结合配偶体；用于扩增所述寡核苷酸序列的试剂；和用户说明书。
在某些实施方案中，所述试剂盒亦包含适于进行用于一种或多种关注分析物的特异性结合测定的容器。
在某些实施方案中，所述试剂盒中的特异性结合配偶体或用于扩增所述寡核苷酸序列的试剂，以在环境温度下稳定、干燥的形式提供。
实施例：
意图下列实施例仅阐述根据本发明的方法和实施方案，并因此不应将其理解为对权利要求加以限制。
实施例1：从固体支持物直接测量白介素
以50 pg或100 pg/μl将重组IL-2 ±载体(R & D Systems；分别为目录202-IL-CF-10μg；批号AE4309112和目录202-IL-10μg；批号AE4309081)溶于血液(TCS Biosciences)。将等份(1 μl包含50 (B)或100 (A) pg的IL-2)涂布至GE Healthcare 903滤纸。
允许这些样品于环境温度和湿度干燥过夜。使用适当大小的打孔器从各种滤纸类型取得3mm直径冲孔出的圆片。使用来自完整配置的IL-2 Quantikine ELISA试剂盒(R & DSystems，目录D2050，批号273275)的试剂对单个圆片直接分析IL-2。以“洞中冲孔片”进行直接测定，即，其中冲孔出所述903滤纸的一部分并存放在常规多层板的反应孔中。
在所述测定完成时，于450 nm监测光密度。通过将值与已知IL-2浓度的标准曲线进行比较来确定IL-2的回收。回收率在图1中显示，且证实当蛋白质沉积在固体支持物上时，可回收有效量的蛋白质。
因此，来自诸如血液或脑脊液等生物样品中的蛋白质在固体支持物上为稳定的，且可使用诸如ELISA等免疫学方法检测和定量。
实施例2：从储存在Whatman FTA和903卡上的血液进行直接PCR
Thermo Scientific高保真血液直接PCR试剂盒被证实为支持直接从储存于一系列固体支持物上的血样进行DNA扩增，所述固体支持物包括Whatman 903、FTA和FTA洗脱卡(Chum和Andre 2013；Thermo Fisher Scientific)。FTA和FTA洗脱卡为化学包被纸基卡的实例，而903卡为未经化学包被的。在直接扩增工作流程中，无需预先的DNA提取或纯化步骤，且简单地将所述卡加入PCR反应混合物中。
样品制备：根据制造商说明书，将新鲜血液或者使用肝素(1.4 IU/mL)、K2EDTA(1.8 mg/mL)或柠檬酸钠(109 mM)保存的血液涂布至Whatman 903卡、FTA洗脱卡或者FTAGene卡并干燥。对于直接PCR，对卡中的样品冲孔1 mm直径圆片并用于以下PCR反应体积：Whatman 903：10-50 μl，FTA洗脱卡：25-50 μl和FTA Gene卡：50 μl。
当使用较大的冲孔片或较小的反应体积时，于50℃用20 μL的水将冲孔片洗涤3分钟。去除水之后，将PCR组分直接加至所述经漂洗的冲孔片。使用的参数和试剂在下表1、2、3中列出。
表1. PCR反应混合物
表2. PCR热循环方案。当引物Tm值为69-72℃时，使用2步方案。
表3.用于扩增关注的示例性基因的引物
图2显示从经肝素处理并保存在不同卡上的人血直接扩增500 bp基因组DNA片段的结果。从经漂洗的1 mm冲孔片或者直接置于体积为50、25或10 μl的PCR反应中的1 mm冲孔片进行反应。使用所述的2步PCR方案。
图3显示来自经EDTA处理并保存在不同卡上的人血的1 kb、3.8 kb和7.5 kb gDNA扩增子的直接PCR的结果。以50 μl反应从1 mm冲孔片进行反应(对于7.5 kb片段，通过用水漂洗来洗涤FTA Gene卡冲孔片)。将2步方案用于1 kb和7.5 kg片段，将3步方案用于3.8 kb扩增子。
所述PCR研究证实，可从储存在不同滤纸卡上的血液直接扩增DNA。
来源于903卡的样品几乎未显示抑制，且可以低至10 μl的反应体积使用1 mm冲孔片。FTA洗脱卡和FTA卡表现出不同水平的抑制。FTA洗脱卡略微抑制直接PCR反应；25-50 μl反应中的1 mm圆片运行良好，但是当置于10 μl反应中时，所述PCR被完全抑制。FTA Gene卡显示最大水平的抑制。未经任何预处理的情况下，FTA Gene卡的1 mm冲孔片仅在50 μl反应体积中运行良好。对于更小的反应体积，非常简单的洗涤方案足以从FTA洗脱卡和FTA Gene卡二者中去除抑制剂。用水将卡冲孔片洗涤3分钟之后，所述样品纯度足以以测试的所有反应体积用于使用高保真血液直接PCR试剂盒的直接PCR反应中。
将来自903卡的冲孔片和来自FTA洗脱卡和FTA Gene卡的漂洗冲孔片(直径均为1mm)用于使用对1 kb、3.8 kb和7.5 kb扩增子特异的引物的50 μl反应体积。在所有情况下，所述PCR反应产生适当大小的扩增产物。
固体支持物上的iPCR的实施例
将重组人IL-2用MADB缓冲液(150mM NaCl、20mM Tris-HCl pH 7.4、2M胍)稀释，并于4℃加至所述固体支持物过夜。此简单添加足以使所述抗原与所述固体支持物永久结合。用Tris缓冲盐水(TBS)将固定的抗原洗涤三次并使用MESTBS (补充有4.5%脱脂奶粉、0.1 mMEDTA、1 mg/ml鲑精DNA和0.2%叠氮化钠的TBS)于37℃将所述固体支持物上的非特异性结合位点封闭1小时。使用TETBS (补充有0.04%吐温和0.1 mM EDTA的TBS)将所述固体支持物洗涤3次。所有后续洗涤步骤均遵循此程序。
使用一次性Harris 3 mm Uni-core打孔器从所述固体支持物切下多个冲孔片，然后加至适于PCR的96孔板中。
使用由1份MESTBS加9份TETBS组成的试剂稀释缓冲液(RDB)稀释生物素化的羊抗IL-2 (R&D Systems，目录编码BAF202)并将其加至含有所述固体支持物冲孔片的96孔板中。于室温(22℃)将IL-2抗原及生物素化的抗体孵育一小时，接着使用TETBS进行三分钟洗涤步骤。重复洗涤5次。
如描述于GenBank登录号BC003596的共同对应于p53 cDNA的217-1255的p53 mRNA的1038 bp片段(IMAGE；3544714，MGC；646)，用作免疫PCR反应的模板。将所述适当大小的p53 DNA片段从载体上切下并使用随机引物DNA生物素化试剂盒(KPL，目录编码60-01-00)、使用Klenow DNA聚合酶的exo-minus片段用生物素d-CTP进行生物素化。
将游离的链霉抗生物素(Sigma目录编码S4762)用于将所述生物素化的抗体与所述生物素化的P53片段连接。
所述iPCR检测反应包括使用p53特异性正向引物1；5’-GCGCACAGAGGAAGAGAATC-3’和反向引物2；5’-CCAAGGCCTCATTCAGCTCT-3 (Sigma Genosys)产生250 bp PCR产物。
使用PCR预混液(95 μl；1 U Taq DNA聚合酶，20 pmol正向和反向引物)生成PCR扩增子并相应地进行扩增(变性94℃，3 min。30个循环的94℃，30 s；55℃，1 min；72℃，2min；最后浸浴于72℃，10 min)。
在1%琼脂糖凝胶上使所得扩增子显影(未显示数据)。
尽管已显示和阐述了本发明的具体实施方案，但对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在不背离本发明的教导的情况下，可进行修改和变动。在前文详述和附图中陈述的事件，仅以举例说明而提供且并非作为限制。当基于先有技术以其适当的观点考虑时，意图本发明的实际范围在下列权利要求中界定。

Claims (24)

1.一种用于检测来源于样品中的至少一种分析物的方法，所述方法包括步骤：
a)使所述样品沉积在固体支持物的表面上；
b)将至少一部分所述固体支持物转移至适于针对关注的一种或多种分析物进行特异性结合测定的容器；
c)任选洗涤所述部分；
d)向所述容器中加入用于各关注分析物的单个特异性结合配偶体，所述结合配偶体用寡核苷酸序列标记；
e)将所述部分与核酸扩增试剂混合；
f)使所述寡核苷酸序列扩增；和
g)检测扩增的核酸。
2.权利要求1的方法，其进一步包括：
基于扩增核酸的数量来定量所述关注的分析物。
3.权利要求1的方法，其中所述固体支持物包括：纤维素基纸、机织或非机织纤维材料(包括人造的或天然存在的聚合纤维，例如藻酸盐)、矿物纤维基材料(例如玻璃纤维材料)或者经表面处理的固体材料，例如化学处理或机械处理的材料，包括激光蚀刻表面，均提供粗糙度足以支持的表面微粗糙度，均任选经稳定试剂或稳定试剂混合物进行化学处理。
4.权利要求1的方法，其中所述固体支持物表面为经化学品浸透的，例如弱碱、螯合剂、阴离子表面活性剂及任选抗氧化剂。
5.权利要求1的方法，其中所述固体支持物表面为经离液剂浸透的。
6.权利要求1的方法，其中所述固体支持物为经表面活性剂处理的纤维素基固体支持物。
7.权利要求1的方法，其中在存在多价螯合剂的情况下进行所述添加和混合步骤，以抵消酶活性或特异性结合配偶体结合的表面活性剂抑制。
8.权利要求7的方法，其中所述多价螯合剂为环糊精。
9.权利要求1的方法，其中所述固体支持物包被有特异性结合部分或者表面电荷改性剂。
10.权利要求1的方法，其中所述特异性结合配偶体为抗体。
11.权利要求1的方法，其中所述特异性结合配偶体为适体。
12.权利要求1的方法，其中所述特异性结合配偶体为天然蛋白或重组蛋白。
13.权利要求1的方法，其中所述特异性结合配偶体为重组普列克底物蛋白同源结构域、FYVE结构域、PX结构域、ENTH结构域、CALM结构域、PDZ结构域、PTB结构域、FERM结构域或金属硫蛋白。
14.权利要求1的方法，其中所述样品来源于生物样品。
15.根据权利要求1的方法，其中所述样品为药物或来源于环境，例如污染物、除草剂、杀虫剂、金属。
16.权利要求1的方法，其中所述样品来源于犯罪现场且用于法医目的，例如但不限于血、精液、毛根、纤维、酒精、滥用的药物、爆炸物和火药。
17.权利要求1的方法，其中所述核酸扩增反应包括聚合酶链式反应。
18.权利要求1的方法，其中所述核酸扩增反应包括等温扩增。
19.权利要求18的方法，其中所述等温扩增反应包括滚环扩增。
20.权利要求19的方法，其中所述扩增产物通过杂交反应来测量。
21.权利要求1的方法，其中通过检测与各特异性结合配偶体缔合的扩增核酸序列，同时单独检测多于一种分析物，所述特异性结合配偶体各自用独特的寡核苷酸序列标记。
22.一种试剂盒，其包含固体支持物；经寡核苷酸序列标记的用于各关注分析物的特异性结合配偶体；用于扩增所述寡核苷酸序列的试剂；和用户说明书。
23.权利要求22的试剂盒，其进一步包含适于进行用于一种或多种关注分析物的特异性结合测定的容器。
24.权利要求22的试剂盒，其中所述特异性结合配偶体或用于扩增所述寡核苷酸序列的试剂，以在环境温度下稳定、干燥的形式提供。
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