CN112763484A - 一种基于比色生物传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于比色生物传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法，包括：(a)、构建磁性复合材料h‑Fe3O4@ppy；(b)、h‑Fe3O4@ppy、TMB和不同浓度的H2O2孵育反应，测量紫外吸收曲线，建立过氧化氢标准曲线；(c)、按照步骤(b)测得待测样品的最大紫外吸收值，代入标准曲线，得到H2O2浓度。本发明还包括(d)、h‑Fe3O4@ppy、H2O2、TMB和不同浓度的谷胱甘肽孵育反应，分离出h‑Fe3O4@ppy，加入硫酸，建立谷胱甘肽标准曲线；(e)、按照步骤(d)测得待测样品的最大紫外吸收值，代入标准曲线，得到GSH浓度。本发明能简单快速、灵敏地检测谷胱甘肽、过氧化氢。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域，涉及一种基于比色生物传感器检测谷胱甘肽(GSH)和/或过氧化氢(H2O2)的方法，更具体地，涉及一种基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法。
背景技术
酶被广泛地用于级联催化反应。天然酶因其高制备成本、严格的储存要求和有限的反应条件，限制了它的进一步应用。与天然酶相比，模拟酶拥有成本低、稳定性高、催化作用可调、可大规模制备和易于表面改性等优点。特别是模拟的纳米酶被广泛地应用于医学、生物检测，食品和工业等领域。近几十年来，纳米复合材料由于其独特的物理、化学性质已成为一种新型的复合材料。特别是在Fe3O4纳米颗粒(NAT NANOTECHNOL,2007,2(9),577-583)被报道具有固有的过氧化物酶活性后，一系列的具有酶活性的纳米材料已经被陆续开发，包括金属氧化物、碳材料、贵金属、G-四联体和金属有机骨架等。其中，Fe3O4 NP因其在分离技术中发挥着卓越的作用而备受关注。基于Fe3O4 NP制备的纳米复合材料不仅具有良好的磁性能和优越的催化性能，还具有良好的分散性和生物相容性。基于磁性纳米复合材料易分离的特点，它不仅可以实现分析系统的纯化减少干扰的缺点，而且能有效地分离富集靶标提高检测灵敏度。因此，研发出一种新型磁性模拟酶，具有可预见的多重优势，其应用前景广阔。
血红素是多种酶和特殊细胞蛋白的活性辅助因子。一些血红素纳米复合材料是天然过氧化物酶的有效替代品，显示出意想不到的酶活性，并已应用于各个领域。例如采用湿法合成的血红素石墨烯纳米片(h-GNs)可以用于单核苷酸比色检测。但是，h-GNs仍然受到不稳定的约束。此外，发明人还设计了含血红素的g-四联体纳米酶，并成功地应用于腺苷的测定。
过氧化氢(H2O2)作为一种必需分子，是生命过程中活性氧的主要来源。然而，过量产生的H2O2会导致氧化应激，对蛋白质和DNA造成严重损害，与许多疾病有关，如心血管疾病、糖尿病、炎症等。谷胱甘肽(GSH)是一种重要的内源性抗氧化剂，广泛地存在于人细胞内和细胞外液，它能清除体内自由基，与人体健康密切相关。人体内的总谷胱甘肽水平由大部分谷胱甘肽和少量氧化谷胱甘肽(GSSG)组成。正常人内源性GSH水平为0.8～1.1mM,GSSG水平为0.10～0.15mM。GSH/GSSG的失衡与多种临床疾病有关，如心血管疾病、帕金森病、糖尿病和多种癌症。因此，GSH和GSH/GSSG可以作为这些疾病的关键生物标志物和预后指标。目前，报道最多的测定H2O2和谷胱甘肽的分析技术是光学和电化学传感。其中，比色法可以通过测量紫外-可见吸收值来实现，甚至可以通过肉眼直接监测显色溶液反应后的颜色变化，它具有简单、快速、直观、通用性强的特点，易于广泛应用。然而，目前广泛使用的H2O2和GSH比色测定试剂盒主要由天然辣根过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶组成，存在检测耗时、成本过高等不足。
发明内容
本发明的目的是克服现有检测方法灵敏度低、检测耗时、成本过高以及步骤繁琐的缺点，提供一种基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法，该方法能够简单快速、高灵敏的检测GSH和/或H2O2。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法，包括如下步骤：
步骤(a)、构建磁性复合材料h-Fe3O4@ppy(hemin-Fe3O4@polypyrrole)：将Fe3O4NPs与吡咯(pyrrole)、血红素(hemin)加入到十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)水溶液中，再加入FeCl3反应，得到磁性复合材料h-Fe3O4@ppy；
步骤(b)、构建过氧化氢比色传感器和H2O2的检测：步骤(a)构建的磁性生物复合材料h-Fe3O4@ppy、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)和不同浓度的H2O2孵育反应，在450-800nm波长下测量样品的紫外吸收曲线，以450nm处的最大紫外吸收值建立过氧化氢标准曲线；
步骤(c)、样品检测：按照步骤(b)测得未知H2O2浓度的待测样品的最大紫外吸收值，代入步骤(b)的标准曲线，得到待测样品中H2O2浓度。
作为本发明所述的基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法的进一步优选技术方案，还包括谷胱甘肽的含量检测，包括：
步骤(d)、构建GSH比色传感器：步骤(a)构建的磁性生物复合材料h-Fe3O4@ppy、H2O2、3,3',5,5'-四甲基联苯胺和不同浓度的谷胱甘肽孵育反应，反应结束后，磁性分离出磁性复合材料h-Fe3O4@ppy，往上清液中加入硫酸，观察颜色的变化，在300-600nm波长下测量样品的紫外吸收曲线，以450nm处的最大紫外吸收值建立谷胱甘肽标准曲线；
步骤(e)、样品检测：按照步骤(d)测得未知GSH浓度的待测样品的比色和最大紫外吸收值，进行颜色比对或代入步骤(d)的谷胱甘肽标准曲线，得到待测样品中GSH浓度。
作为本发明所述的基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法的进一步优选技术方案，包括：
步骤(f)、构建过氧化氢比色生物传感器：步骤(b)反应结束后，磁性分离出磁性复合材料h-Fe3O4@ppy，往上清液中加入硫酸，观察颜色的变化，在300-600nm波长范围内测量样品的紫外吸收曲线，以450nm处的最大紫外吸收值建立过氧化氢标准曲线；
步骤(e)、样品检测：依次按照步骤(b)、步骤(f)测得未知H2O2浓度的待测样品的最大紫外吸收值，代入步骤(f)的标准曲线得到样品中H2O2的浓度。
本发明方法的检测机理为(图1)：h-Fe3O4@ppy在H2O2存在下发挥过氧化物酶活性，催化无色的TMB氧化生成蓝色的OxTMB。然后，通过磁性分离去除h-Fe3O4@ppy以消除残留的催化效应。最后，通过加入H2SO4，OxTMB形成了更稳定的黄色产物，具有更大的信号响应值。因此，可以利用OxTMB的最大吸收值来定量检测H2O2。同时，利用谷胱甘肽将黄色的OxTMB还原为无色的TMB，制备了一种谷胱甘肽比色传感器。
步骤(a)中，h-Fe3O4@ppy通过化学氧化聚合作用制得。
具体的，h-Fe3O4@ppy的制备方法如下：将Fe3O4NPs、吡咯和血红素加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液，充分搅拌0.5-2小时，再在搅拌下，加入FeCl3，室温过夜反应，得到黑色产物，用乙醇和去离子水依次洗涤，真空干燥，4℃存放。
所述的Fe3O4NPs、吡咯和血红素的用量比为20～120mg:90μL:4×10-8mol，优选为60mg:90μL:4×10-8mol。
所述的Fe3O4NPs和十六烷基三甲基溴化铵的用量比为20～120mg:40mg，优选为60mg:40mg。
所述的吡咯和FeCl3的用量比为90μL:0.4×10-3mol。
所述的Fe3O4NPs是由以下方法制得的：取FeCl3·6H2O溶于水中，超声溶解，搅拌，待温度达到80℃时，加入FeCl2·4H2O，制得混合水溶液；往混合水溶液中通入N2除氧，逐滴加入氨水，滴加完毕后继续保温反应20～40min，停止加热，冷却至室温，通过外加磁场磁性分离出Fe3O4NPs，水洗至中性；其中，FeCl3·6H2O与FeCl2·4H2O的摩尔比为3:1～1:1，FeCl3·6H2O在混合水溶液的体积浓度为0.1～0.25mmol/mL，每100mL混合水溶液加入10～15mL氨水。
所述的十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为1mg/mL。十六烷基三甲基溴化铵水溶液由以下方法配制得到：将0.04gCTAB通过连续搅拌分散到40mL水溶液中，形成均匀透明的溶液。
本发明也可以将十六烷基三甲基溴化铵替换为Pluronic P-123。
步骤(b)中，以pH 3.0、5mM柠檬酸钠缓冲液为反应溶剂。体系中h-Fe3O4@ppy的终浓度为60mg/L，TMB的终浓度为0.2mM，H2O2的终浓度为0～200μM。
根据本发明具体实施方式，体系中加入等体积不同浓度的双氧水，双氧水中H2O2的浓度为0μM，0.2μM，1μM，5μM，10μM，20μM，40μM，60μM，80μM，100μM，120μM，140μM，160μM，180μM，200μM。
孵育反应的温度为45℃，孵育反应的时间为40分钟。
步骤(d)中，以pH 3.0、5mM柠檬酸钠缓冲液为反应溶剂。
体系中H2O2终浓度为0.1～0.3mM，优选为0.2mM，TMB终浓度为0.1～0.4mM，优选为0.2mM，h-Fe3O4@ppy终浓度为40～100μg/mL，优选为60μg/mL，GSH的终浓度为0～120μM。
根据本发明具体实施方式，体系中加入等体积不同浓度的谷胱甘肽溶液，谷胱甘肽溶液中GSH的浓度为0μM，0.1μM，0.5μM，1μM，5μM，10μM，20μM，40μM，60μM，80μM，100μM，120μM。
孵育反应的温度为45℃，孵育反应的时间为40分钟。
优选的，所述的硫酸的加入量和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的摩尔比为25～35:1，优选为30:1。
步骤(f)中，所述的硫酸的加入量和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的摩尔比为25～35:1，优选为30:1。
与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
1、h-Fe3O4@ppy比Fe3O4NPs和h-ppy NPs具有更强的过氧化物酶活性。
2、利用h-Fe3O4@ppy的磁性特性，可以从传感系统中去除残留的催化效应，实现对催化反应的实时调控，提高方法的稳定性和准确性。磁性纳米酶h-Fe3O4@ppy在纳米传感器分析装置的构建和应用方面具有多重优势和巨大潜力。
3、h-Fe3O4@ppy因其优异的稳定性和可重复使用特性，增加了比色传感器的实用性，并能够简单快速、灵敏的检测GSH或H2O2，实现可视化检测谷胱甘肽。
4、实际临床样本分析显示GSH/GSSG在临床诊断中具有更重要的意义。
附图说明
图1为本发明基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和过氧化氢的原理图。
图2A为实施例1所构建的检测体系中不加硫酸不同浓度H2O2的紫外吸收曲线；图2B为实施例1所构建的检测体系中不加硫酸不同浓度H2O2的标准曲线图；图中，H2O2浓度为400μL双氧水中H2O2浓度。
图3A为实施例2所构建的检测体系中加入硫酸不同浓度H2O2的紫外吸收曲线；图3B为实施例2所构建的检测体系中加入硫酸不同浓度H2O2的标准曲线图；图中，H2O2浓度为400μL双氧水中H2O2浓度。
图4A为实施例3所构建的检测体系中不同浓度GSH的紫外吸收曲线；图4B为实施例3所构建的检测体系中不同浓度GSH的标准曲线图；图中，GSH浓度为400μL谷胱甘肽中GSH浓度。
图5为实施例1所构建的检测体系对于GSH的选择性比较图。
图6为不同pH体系对h-Fe3O4@ppy过氧化物酶活性的影响。
图7为不同酶活性的比较图；其中，图7A、B、C分别为h-Fe3O4@ppy，Fe3O4 NPs和h-ppy的双倒数曲线，图7D为h-Fe3O4@ppy，Fe3O4 NPs和h-ppy的米氏曲线。
具体实施方式
通过结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行更详细的描述。虽然以下为本发明的优选具体实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
具体实施方式中Fe3O4NPs的制备方法如下：取4.7215gFeCl3·6H2O溶于80mL水中，超声溶解，搅拌。转移到油浴锅中，待温度达到80℃时，加入1.7256gFeCl2·4H2O，制得混合水溶液；往混合水溶液中通入N2除氧，逐滴加入10mL氨水(28-30wt％)，滴加完毕后继续保温反应30min，停止加热，冷却至室温，通过外加磁场磁性分离出Fe3O4NPs，水洗至中性。
实施例1
一种基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测过氧化氢的方法，步骤如下：
步骤(a)、构建磁性复合材料h-Fe3O4@ppy：先将0.04g CTAB通过连续搅拌分散到40mL H2O中，形成均匀透明的表面活性剂溶液；将60mgFe3O4 NPs、90μL吡咯单体和40μL血红素溶液(1mM，由血红素溶于水配成溶液)，分别滴入表面活性剂溶液中；充分搅拌2小时后，在连续搅拌下，将2mL 0.2M FeCl3溶液缓慢滴入上述混合液中，室温反应24h，得到黑色产物，用乙醇和去离子水依次洗涤，真空干燥，存放在4℃冰箱；
步骤(b)、磁性复合材料h-Fe3O4@ppy的催化作用：将400μL不同浓度的双氧水和TMB、h-Fe3O4@ppy、柠檬酸钠缓冲液(5mM，pH 3.0)混合，最终反应溶液体积为1mL，体系中TMB终浓度为0.2mM，h-Fe3O4@ppy终浓度为60μg/mL，45℃反应40分钟；如图2A、图2B，对不同含量H2O2的反应体系进行比色，用紫外分光光度计在450-800nm波长范围内测量紫外吸收值，以650nm处的最大紫外吸收值建立过氧化氢标准曲线：A＝0.0065CH2O2+0.0533，R2＝0.992。
步骤(c)、样品检测：按照步骤(b)，将待测样品、TMB、h-Fe3O4@ppy和柠檬酸钠缓冲液(5mM，pH 3.0)混合，最终反应溶液体积为1mL，体系中TMB终浓度为0.2mM，h-Fe3O4@ppy终浓度为60μg/mL，45℃反应40分钟；测得650nm处未知浓度的待测样品的比色和最大紫外吸收值，进行颜色比对或代入步骤(b)的标准曲线得到样品中H2O2的浓度。
实施例2
一种基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测过氧化氢的方法，步骤如下：
步骤(a)、构建磁性复合材料h-Fe3O4@ppy(同实施例1步骤(a))；
步骤(b)、磁性复合材料h-Fe3O4@ppy的催化作用(同实施例1步骤(b))；
步骤(c)、构建过氧化氢比色生物传感器：磁性分离出磁性复合材料h-Fe3O4@ppy，得到上清液，加入20μL3 M硫酸，如图2A、图2B，用紫外分光光度计，在450nm处测量反应溶液的最大紫外吸收值，建立标准曲线：A＝0.0037CH2O2+0.1812，R2＝0.994。
步骤(d)、样品检测：按步骤(b)、步骤(c)处理未知浓度的样品，在450nm处检测样品的最大紫外吸收值，代入步骤(c)标准曲线得到样品中的过氧化氢浓度。
实施例3
一种基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽的方法，步骤如下：
步骤(a)、构建磁性复合材料h-Fe3O4@ppy(同实施例1步骤(a))。
步骤(b)、构建GSH比色传感器：将400μLH2O2、TMB、h-Fe3O4@ppy、400μL不同浓度的谷胱甘肽溶液(由谷胱甘肽溶在水中配制而成)和柠檬酸钠缓冲液(5mM，pH 3.0)混合，最终反应溶液体积为1mL，体系中H2O2终浓度为0.2mM，TMB终浓度为0.2mM，h-Fe3O4@ppy终浓度为60μg/mL，45℃反应40分钟；磁性分离出磁性复合材料h-Fe3O4@ppy，往上清液中加入20μL3 M硫酸，观察颜色的变化；如图4A、图4B，对不同含量谷胱甘肽的反应体系进行比色，用紫外分光光度计，在450nm处测量反应溶液的最大紫外吸收值，建立谷胱甘肽标准曲线：A＝0.0127CGSH+0.0666，R2＝0.990；
步骤(c)、样品检测：按步骤(b)处理未知GSH浓度的样品，进行比色，在450nm处检测样品的最大紫外吸收值，代入谷胱甘肽标准曲线得到样品中的谷胱甘肽浓度。
实施例4
构建磁性复合材料h-Fe3O4@ppy：先将0.04g CTAB通过连续搅拌分散到40mL H2O中，形成均匀透明的表面活性剂溶液；将20mgFe3O4 NPs、90μL吡咯和40μL血红素(1mM)，分别滴入表面活性剂溶液中，充分搅拌2小时，在连续搅拌下，将2mL 0.2M FeCl3溶液缓慢滴入上述混合液中，室温反应24h，得到黑色产物，用乙醇和去离子水依次洗涤，真空干燥，存放在4℃冰箱。
实施例5
构建磁性复合材料h-Fe3O4@ppy：先将0.04g CTAB通过连续搅拌分散到40mL H2O中，形成均匀透明的表面活性剂溶液；将120mgFe3O4 NPs、90μL吡咯和40μL血红素(1mM)，分别滴入表面活性剂溶液中，充分搅拌2小时，在连续搅拌下，将2mL 0.2M FeCl3溶液缓慢滴入上述混合液中，室温反应24h，得到黑色产物，用乙醇和去离子水依次洗涤，真空干燥，存放在4℃冰箱。
实施例6
GSH的选择性实验
实施例参照实施例3步骤(b)，研究了传感器系统对常见阳离子(Na+，K+和Ca2+)以及葡萄糖(Glu)、尿酸(UA)和多巴胺(DA)、牛血清白蛋白(BSA)和氨基酸包括L-半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、L-赖氨酸(Lys)、L-天冬氨酸(Asp)和组氨酸(His)的选择性：反应溶液体积为1mL，体系中H2O2终浓度为0.2mM，TMB终浓度为0.2mM，h-Fe3O4@ppy终浓度为60μg/mL，GSH的终浓度为80μM，BSA的浓度为10mg/L，其它干扰物的浓度为80μM，45℃反应40分钟；磁性分离出磁性复合材料h-Fe3O4@ppy，往上清液中加入20μL3 M硫酸，用紫外分光光度计，在450nm处测量反应溶液的最大紫外吸收值。
比色法结果见图5。结果表明，除了Cys外，其余干扰物都不会干扰GSH的定量检测。Cys是GSH发挥其抗氧化能力的有效成分，还可以抑制TMB的氧化。而在实际的生物环境中，Cys含量远低于GSH，并且其对谷胱甘肽选择性的影响是可以接受的。
实施例7
不同pH体系对h-Fe3O4@ppy过氧化物酶活性的影响
分别配制pH＝3、4、5、6、7的柠檬酸钠缓冲溶液，按照实施例1步骤(b)进行分析：分别以上述不同pH的柠檬酸钠缓冲溶液作为反应溶剂，体系中H2O2终浓度为0.2mM，TMB终浓度为0.2mM，h-Fe3O4@ppy终浓度为60μg/mL，45℃反应40分钟，用紫外分光光度计在650nm波长处测量紫外吸收值。结果如图6所示，当pH＝3时，h-Fe3O4@ppy具有最高的酶活性。
实施例8
为了量化材料的催化效率和亲和力，采用双倒数方法计算稳态动力学参数，包括米氏常数(Km)和最大初始速度值Vmax。Km值越低，模拟酶与基体的亲和力越高。Vmax值越大，饱和反应速率越高。
不同酶活性比较：取相同浓度的h-Fe3O4@ppy，Fe3O4 NPs和h-ppy NPs(终浓度均为60μg/L)，加入4μL双氧水(过氧化氢终浓度为0.2mM)，分别加入10μL不同浓度的TMB溶液(由TMB溶在pH 3.0、5mM柠檬酸钠缓冲液配制而成)，用pH＝3的柠檬酸钠缓冲溶液补齐到200μL，使TMB终浓度分别为0.05,0.1,02,0.3,0.4,0.5,0.6mM，在45℃下孵育10min，用酶标仪在650nm处测量溶液的吸收值。利用各吸收值求得反应速度值，代入1/V＝(Km/Vmax)(1/[S])+1/Vmax中，得到双倒数曲线，利用截距和斜率求得米氏常数Km和最大初使速度Vmax。
图7为常温、pH＝3下Fe3O4纳米粒、h-ppy纳米粒和h-Fe3O4@ppy催化氧化TMB的Michaelis-Menten曲线。h-Fe3O4@ppy、Fe3O4纳米粒和h-ppy纳米粒的Km值分别为0.27mM、0.38mM、0.43mM，h-Fe3O4@ppy的Km值小于Fe3O4纳米粒和h-ppy纳米粒；h-Fe3O4@ppy、Fe3O4纳米粒和h-ppy纳米粒的Vmax值分别为6.80×10-8M·s-1、2.98×10-8M·s-1、4.40×10-8M·s-1，h-Fe3O4@ppy的Vmax值大于Fe3O4纳米粒和h-ppy纳米粒的Vmax值。由此表明h-Fe3O4@ppy对TMB具有较高的催化效率。
Fe3O4纳米粒(Fe3O4NPs)的制备方法如下：取4.7215g FeCl3·6H2O溶于80mL水中，超声溶解，搅拌。转移到油浴锅中，待温度达到80℃时，加入1.7256g FeCl2·4H2O，制得混合水溶液；往混合水溶液中通入N2除氧，逐滴加入10mL氨水，滴加完毕后继续保温反应30min，停止加热，冷却至室温，通过外加磁场磁性分离出Fe3O4纳米粒，水洗至中性。
h-ppy纳米粒(h-ppy NPs)的制备方法如下：将0.04g CTAB通过连续搅拌分散到40mL H2O中，形成均匀透明的表面活性剂溶液；将90μL吡咯和40μL血红素溶液(1mM，由血红素溶于水配成溶液)，分别滴入表面活性剂溶液中；充分搅拌2小时，在连续搅拌下，将2mL0.2M FeCl3溶液缓慢滴入上述混合液中，室温反应24h，得到黑色产物，用乙醇和去离子水依次洗涤，真空干燥，存放在4℃冰箱。
应用实施例1
以人全血样品进行测定，以1.25mM加入量为基准，在全血中分别加入基准量80％、100％、120％的谷胱甘肽标准品，按照实施例3的方法测定紫外吸收信号，代入实施例3建立的谷胱甘肽标准曲线得到样品中谷胱甘肽标准品浓度，每份样品重复测定3次取平均值，计算RSD及回收率见表1。
表1.全血中谷胱甘肽加样回收率(n＝3)
应用实施例2
以人全血样品进行测定，在全血中分别加入10、20、40μM的过氧化氢标准品，按照实施例2的方法测定紫外吸收信号，代入实施例2建立的过氧化氢标准曲线得到样品中的过氧化氢标准品浓度，每份样品重复测定3次取平均值，计算RSD及回收率见表2。
表2.全血中过氧化氢加样回收率(n＝3)
以上已经描述了本发明的实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (10)
1.一种基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤(a)、构建磁性复合材料h-Fe3O4@ppy：将Fe3O4 NPs与吡咯、血红素加入到十六烷基三甲基溴化铵水溶液中，再加入FeCl3反应，得到磁性复合材料h-Fe3O4@ppy；
步骤(b)、构建过氧化氢比色传感器和H2O2的检测：步骤(a)构建的磁性生物复合材料h-Fe3O4@ppy、3,3',5,5'-四甲基联苯胺和不同浓度的H2O2孵育反应，测量样品的紫外吸收曲线，以450nm处的最大吸收值建立过氧化氢标准曲线；
步骤(c)、样品检测：按照步骤(b)测得未知H2O2浓度的待测样品的最大紫外吸收值，代入步骤(b)的标准曲线，得到待测样品中H2O2浓度。
2.根据权利要求1所述的基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法，其特征在于还包括谷胱甘肽的含量检测，包括：
步骤(d)、构建GSH比色传感器：步骤(a)构建的磁性生物复合材料h-Fe3O4@ppy、H2O2、3,3',5,5'-四甲基联苯胺和不同浓度的谷胱甘肽孵育反应，反应结束后，磁性分离出磁性复合材料h-Fe3O4@ppy，往上清液中加入硫酸，测量样品的紫外吸收曲线，以450nm处的最大紫外吸收值建立谷胱甘肽标准曲线；
步骤(e)、样品检测：按照步骤(d)测得未知GSH浓度的待测样品的最大紫外吸收值，代入步骤(d)的谷胱甘肽标准曲线，得到待测样品中GSH浓度。
3.根据权利要求1所述的基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法，其特征在于包括：
步骤(f)、构建过氧化氢比色生物传感器：步骤(b)反应结束后，磁性分离出磁性复合材料h-Fe3O4@ppy，往上清液中加入硫酸，观察颜色的变化，测量样品的紫外吸收曲线，以450nm处的最大紫外吸收值建立过氧化氢标准曲线；
步骤(e)、样品检测：依次按照步骤(b)、步骤(f)测得未知H2O2浓度的待测样品的最大紫外吸收值，代入步骤(f)的标准曲线得到样品中H2O2的浓度。
4.根据权利要求1所述的基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法，其特征在于步骤(a)中，h-Fe3O4@ppy的制备方法如下：将Fe3O4NPs、吡咯和血红素加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液，充分搅拌0.5-2小时，再在搅拌下，加入FeCl3，室温反应，产物用乙醇和去离子水依次洗涤，真空干燥。
5.根据权利要求4所述的基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法，其特征在于所述的Fe3O4NPs、吡咯和血红素的用量比为20～120mg:90μL:4×10-8mol；所述的Fe3O4NPs和十六烷基三甲基溴化铵的用量比为20～120mg:40mg；所述的吡咯和FeCl3的用量比为90μL:0.4×10-3mol。
6.根据权利要求1所述的基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法，其特征在于步骤(b)中，以pH 3.0、5mM柠檬酸钠缓冲液为反应溶剂。
7.根据权利要求1所述的基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法，其特征在于步骤(b)中，体系中h-Fe3O4@ppy的终浓度为60mg/L，TMB的终浓度为0.2mM，H2O2的终浓度为0～200μM；
孵育反应的温度为45℃，孵育反应的时间为40分钟。
8.根据权利要求2所述的基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法，其特征在于步骤(d)中，以pH 3.0、5mM柠檬酸钠缓冲液为反应溶剂。
9.根据权利要求2所述的基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法，其特征在于步骤(d)中，体系中H2O2终浓度为0.1～0.3mM，优选为0.2mM，TMB终浓度为0.1～0.4mM，优选为0.2mM，h-Fe3O4@ppy终浓度为40～100μg/mL，优选为60μg/mL，GSH的终浓度为0～120μM；所述的硫酸的加入量和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的摩尔比为25～35:1，优选为30:1；
孵育反应的温度为45℃，孵育反应的时间为40分钟。
10.根据权利要求3所述的基于一锅法制备高过氧化物酶活性h-Fe3O4@ppy的灵敏比色传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法，其特征在于步骤(f)中，所述的硫酸的加入量和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的摩尔比为25～35:1，优选为30:1。
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