CN106220663A - 一种过氧化氢荧光探针化合物的制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种反应型过氧化氢荧光探针化合物及其制备与应用，所述过氧化氢荧光探针化合物具有式I的结构。制备方法是：将4‑二乙基氨基水杨醛，对溴溴苄，以无水碳酸钾为催化剂，溶于丙酮在氮气保护下回流反应得到产物II；将产物II与联硼频哪醇酯在[1,1‑双（二苯基膦）二茂铁]二氯化钯为催化剂，在氮气保护下反应得到产物III；将产物III与丙二腈以哌啶为催化剂，室温下搅拌得到最终的产物探针Ⅰ。该探针化合物对过氧化氢具有很好的选择性和灵敏性，检测限低，且对细胞没有毒性，可应用于细胞内过氧化氢的检测和成像。
Description
技术领域
本发明涉及一种过氧化氢荧光探针化合物及其制备与应用，属于荧光探针技术领域。
技术背景
过氧化氢是人体内活性氧物种其中的一种，通过氧气的代谢及酶的催化而产生。适量水平的过氧化氢对免疫细胞的活化，细胞的生长和增殖具有促进作用，然而过量的过氧化氢水平可能会造成许多严重的疾病，例如，阿兹海默症、帕金森症、心脑血管疾病，以及癌症等等。因此，识别以及实时监测细胞内过氧化氢的含量具有十分重要的意义。
目前，作为生物体内过氧化氢的检测方法主要有电化学方法，元素分析质谱等方法，这些方法的样品制备过程复杂，检测过程对样品的损伤较大，而且不能进行实时监测。与之对比，作为一种价格低廉的检测手段，荧光探针检测法由于其不仅具有灵敏度高、选择性好、响应速度快、能够进行实时可视化监测等优点，而且可在生物医学成像方面进行进一步的应用，近几年来备受研究人员的关注。
在现有的荧光探针技术中，现有的过氧化氢探针存在种类少、选择性低、检测不够灵敏等问题。比如DCFH是检测体内ROS的探针，但它容易被空气中的氧气氧化，容易对过氧化氢的检测产生干扰，降低灵敏度。另外，由于过氧化氢存在时间短，易与其它物质反应生成新的活性氧物种，因此对过氧化氢的检测本身就存在一定的难度，设计一种响应时间短，灵敏度高，选择性强的探针具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种反应型过氧化氢荧光探针化合物，既可以检测水中的过氧化氢，还可以在生物体内识别和检测过氧化氢。
本发明还提供所述反应型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法与应用。
本发明的技术方案如下：
一种反应型过氧化氢荧光探针化合物，具有式I所示的结构：
。
本发明所述的过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将4-二乙基氨基水杨醛和对溴溴苄，以无水碳酸钾为催化剂，丙酮为溶剂，在氮气保护下回流反应，得到化合物II；
（2）上步制得的化合物II溶于干燥的DMF中，加入联硼酸频哪醇酯，以[1,1-双（二苯基膦）二茂铁]二氯化钯和乙酸钾为催化剂，在80℃下搅拌过夜反应，得到化合物III；
（3）上步制得的化合物III溶于乙醇中，加入丙二腈，以哌啶为催化剂，在室温下反应一小时，得到最终产物探针I。
根据本发明，优选的，步骤（1）所述4-二乙基氨基水杨醛、对溴溴苄的摩尔比为1.5:1；
根据本发明，优选的，步骤（2）所述II、联硼频哪醇酯的摩尔比为1:1.1；
根据本发明，优选的，步骤（3）所述III、丙二腈的摩尔比为1:1.1；
根据本发明，优选的，步骤（1）、（2）全程在氮气保护下进行；
根据本发明，优选的，步骤（1）反应温度为50℃；
根据本发明，优选的，步骤（2）反应温度为80℃；
根据本发明，优选的，步骤（3）反应温度为25℃。
更为详细的，所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，步骤如下：
(a) 取4-二乙基氨基水杨醛1.613克，对溴溴苄1.38克，无水碳酸钾0.533克置于三口烧瓶中，氮气保护，取13毫升丙酮加入烧瓶中；50℃下搅拌回流过夜，蒸发溶剂，用乙酸乙酯与石油醚（体积比为1:4）的混合溶剂为展开剂，过柱子分离，得到1.004克化合物II，产率53%。
(b) 取化合物II 0.339克、联硼酸频哪醇酯0.285克、[1,1-双（二苯基膦）二茂铁]二氯化钯82毫克溶于10毫升干燥DMF中，80℃下氮气氛围下回流过夜，蒸出溶剂，用石油醚与乙酸乙酯（体积比为1:1）的混合溶剂为展开剂，过柱子分离，得到0.369克化合物II，产率95%。
(c) 取III 80毫克放置于圆底烧瓶中，加入丙二腈24.14毫克，5滴哌啶，10毫升乙醇，室温下搅拌1小时，除去溶剂，过柱子分离，得到化合物I 73.2毫克，产率81%。
本发明所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物的应用，可用于测试细胞和水中的过氧化氢含量。
进一步优选的，所述荧光探针用于在pH=7.4的乙腈和水（体积比1:20）的溶液中过氧化氢的快速检测。在5%乙腈溶液中过氧化氢的检测限为1.44*10-8 mol/L。
本发明通过实验验证，所述荧光探针在pH=7.4的乙腈和水（体积比1:20）的溶液中，用波长437纳米的光作为激发光，可以发现其没有荧光，加入过氧化氢二十分钟后检测，溶液在485纳米处荧光迅速增强，而其他活性氧物种加入后溶液的荧光没有明显变化，该探针对过氧化氢具有很高的选择性。
将本发明的荧光探针化合物加入含有5%乙腈的水溶液中，配成荧光探针化合物浓度为10微摩尔/升的溶液，用HEPES缓冲溶液调节pH=7.4，加入不同浓度的过氧化氢，用波长437纳米的光激发，在波长485纳米处的荧光依次增强。得出工作曲线如图2所示，通过测定待测样品的荧光强度，就可以定量的计算出过氧化氢的浓度。
本发明所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物不仅可以用于水中过氧化氢的检测，还可以应用于组织细胞内过氧化氢的检测和成像。
将MCF-7细胞在含有10%牛胎儿血清的1毫升细胞培养基培养12小时，然后用100微摩尔/升的过氧化氢溶液处理10分钟，在用10微摩尔/升的本发明的荧光探针处理30分钟。细胞用激发波长为437纳米的光源激发，在共聚焦显微镜下成像。
与现有的检测技术相比，本发明的荧光探针设计新颖，选择性好，且具有良好的水溶性，而不具有生物毒性，在制备方面，均使用常用试剂，合成步骤简单。本发明的优良效果如下：
1、本发明的荧光探针化合物具有较好的水溶性、生物相容性以及较好的膜穿透性，可用于细胞内过氧化氢的探测及成像。
2、本发明的荧光探针化合物能用于水体中过氧化氢的定量检测且检测限较低；
3、本发明的荧光探针化合物具有良好的灵敏度和选择性，测试样品前处理简单；
4、本发明的荧光探针化合物为固体粉末，便于储存使用，并且合成方法简单、收率高、成本低、具有良好的推广前景；
5、与现有的技术相比，本发明的荧光探针的选择性高，灵敏度高，检测限低，并且在细胞成像研究对组织细胞几乎无损伤。
附图说明
图1为本发明荧光探针的结构图。
图2本发明的荧光探针的核磁图。
图3为本发明的荧光探针与不同浓度的过氧化氢的荧光强度工作曲线图。
图4为用本发明的荧光探针和过氧化氢进行培养的MCF-7细胞成像图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。实施例中的各种原料均来自于市场购买。
实施例1、探针分子I的合成
（1）取4-二乙基氨基水杨醛1.613克，对溴溴苄1.38克，无水碳酸钾0.533克置于三口烧瓶中，氮气保护，取13毫升丙酮加入烧瓶中；50℃下搅拌回流过夜，蒸发溶剂，用乙酸乙酯：石油醚体积比为1:4为展开剂，过柱子分离，得到纯产物 II 1.004克，产率53%。
（2）取II 0.339克、联硼酸频哪醇酯0.285克、[1,1-双（二苯基膦）二茂铁]二氯化钯82毫克溶于10毫升干燥DMF中，80℃下氮气保护回流过夜，蒸出溶剂，用石油醚:乙酸乙酯体积比为1:1的化合物溶剂为展开剂，过柱子分离，得到化合物III 0.369克，产率95%。
（3）取III 80毫克放置于圆底烧瓶中，加入丙二腈24.14毫克，5滴哌啶，10毫升乙醇，室温下搅拌1小时，蒸发溶剂，过柱子分离，得到探针I 73.2毫克，产率81%。探针分子I的结构如图1所示，核磁氢谱如图2。
实施例2、荧光实验
取实施例1制备的荧光探针化合物，溶解到含有5%乙腈的水溶液中，用HEPES缓冲溶液调节pH=7.4；得荧光探针溶液，备用。
1、取荧光探针溶液，分12组，每组10毫升，其中1组不加活性氧物种，11组分别加入含有CH3COOOH, GSH, H2O2, HOCl, NO, O2•-, •OH, ONOO-, otBU, TBHF, Vc溶液，使得每组溶液中含有探针化合物的浓度为10微摩尔，活性氧物种浓度为300微摩尔，使得活性氧物种与探针化合物的摩尔比为30:1；采用激发波长为437纳米，荧光光度计测试其荧光强度，如图2所示，结果显示：本发明探针溶液本身没有荧光，一旦加入过氧化氢，溶液在485纳米处荧光迅速增强，而其他离子加入后溶液的荧光没有变化，对过氧化氢具有很高的选择性。
2、取荧光探针溶液，分15组，每组10毫升，分别加入不同浓度的过氧化氢溶液，调节到溶液中含有探针化合物的浓度为10微摩尔，过氧化氢的浓度分别为探针化合物浓度的0、5、10、15、20、25、30、40、50倍。采用激发波长为437纳米的光激发，荧光光度计测试其荧光强度，如图3所示，结果显示：溶液在485纳米出荧光迅速增强，其荧光强度与浓度成线性关系。根据测试计算，本探针化合物的最低检测限为1.44×10-8 mol/L。
实施例3、细胞成像实验
将MCF-7细胞在含有10%牛胎儿血清的1毫升细胞培养基培养12小时，然后用100微摩尔/升的氟离子处理10分钟，在用10微摩尔/升的本发明的荧光探针处理30分钟。细胞用激发波长为437纳米的光源激发，在共聚焦显微镜下成像。图4为用本发明的荧光探针和过氧化氢进行培养的MCF-7细胞成像图。
Claims (9)
1.一种双光子氟离子荧光探针化合物，具有式I所示的结构。
2.一种权利要求1所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将4-二乙基氨基水杨醛和对溴溴苄，以无水碳酸钾为催化剂，丙酮为溶剂，在氮气保护下回流反应，得到化合物II；
（2）上步制得的化合物II溶于干燥DMF中，加入联硼酸频哪醇酯，以[1,1-双（二苯基膦）二茂铁]二氯化钯，乙酸钾为催化剂，在80℃下搅拌过夜反应，得到化合物III；
（3）上步制得的化合物III溶于乙醇中，加入丙二腈，以哌啶为催化剂，在室温下反应1小时，得到探针I。
3.如权利要求2所述的过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（1）所述4-二乙基氨基水杨醛、对溴溴苄的摩尔比为1.5:1。
4.如权利要求2所述的过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（2）所述II、联硼频哪醇酯的摩尔比为1:1.1。
5.如权利要求2所述的双光子氟离子荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（3）
所述II、丙二腈的摩尔比为1:1.1。
6.如权利要求2所述的过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（1）、（2）全程在氮气保护下进行。
7.如权利要求2所述的双光子氟离子荧光探针化合物的制备方法，其特征在于步骤（1）、1）、（2）反应温度分别为50、80、25℃。
8.如权利要求2所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(a) 取4-二乙基氨基水杨醛1.613克，对溴溴苄1.38克，无水碳酸钾0.533克置于三口烧瓶中，氮气保护，取13毫升丙酮加入烧瓶中；50℃下搅拌回流过夜，蒸发溶剂，用乙酸乙酯和石油醚（体积比为1:4）的混合溶剂为展开剂，过柱子分离，得到纯产物 II 1.004克，产率53%；
(b) 取II 0.339克、联硼酸频哪醇酯0.285克、[1,1-双（二苯基膦）二茂铁]二氯化钯82毫克溶于10毫升干燥DMF中，80℃下氮气氛围下回流过夜，蒸出溶剂，用石油醚和乙酸乙酯（体积比为1:1）的混合溶剂为展开剂，过柱子分离，得到纯产物III 0.369克，产率95%；
(c) 取III 80毫克于圆底烧瓶中，加入丙二腈24.14毫克，5滴哌啶，10毫升乙醇，室温下搅拌1小时，蒸发溶剂，过柱子分离，得到纯产物I 73.2毫克，产率81%。
9.权利要求1所述的反应型过氧化氢荧光探针化合物的应用，可以用于检测水体中的过氧化氢含量以及细胞内成像研究。
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