CN105153214A

CN105153214A - 一种硅基罗丹明一氧化氮荧光探针及其制备方法和应用

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Publication number: CN105153214A
Application number: CN201510726262.0A
Authority: CN
Inventors: 汪亭; 王保刚; 柴晓云; 吴秋业; 俞世冲; 张志强; 付奔
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2015-10-30
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2035-10-30
Also published as: CN105153214B

Abstract

本发明涉及一种硅基罗丹明一氧化氮荧光探针，其结构如下所示：所述的Lyso-SiRB-NO(式II)具有溶酶体定位功能。本发明的优点：本发明的硅基罗丹明一氧化氮探针的激发和发射波长位于近红外光区，在应用于生物成像时可以降低生物体自身荧光背景的干扰，且穿透能力强，对活体组织或细胞的损伤较小；该探针的另一优势在于能够特异性检测溶酶体内的一氧化氮分子，为研究一氧化氮分子的生理作用提供了可靠的研究工具。

Description

一种硅基罗丹明一氧化氮荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化学和生物技术领域，具体地说，是一种硅基罗丹明一氧化氮荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

一氧化氮是生物体内一种十分重要的生物信息分子。体内的一氧化氮是由一氧化氮合成酶(一氧化氮Synthetase,NOS)催化氧化L-精氨酸生成。研究表明，一氧化氮参与生物体内许多重要的生理过程，特别是在心血管系统中发挥着重要的作用，具有舒张血管、防止血栓形成、抗动脉粥样硬化等作用。人们对于一氧化氮进行了广泛和深入的研究，但是一氧化氮分子化学稳定性差，在生物体内性质活泼，半衰期不足5秒；此外，作为一种亲脂性的小分子，一氧化氮极易透过细胞膜，能够快速地从生成处迁移到其他组织细胞；生理条件下，一氧化氮在细胞中的浓度极低，并且极易转变为其稳定代谢产物NO^3-和NO^2-。一氧化氮的这些特点对实现在活细胞条件下对其进行实时、准确和直接监测提出了挑战。目前用于一氧化氮监测的方法主要有荧光法、化学发光法、紫外-可见光谱法和毛细管电泳法等。荧光分析法具有响应时间短、灵敏度高、仪器设备简单等诸多优点，并且其获得的信息直观、准确，能科学表达解释生物复杂样品重分析物的分布及含量等诸多问题。这使得荧光分析法成为在活细胞条件下监测内源性一氧化氮分子、研究其生理学功能最为行之有效的一种方法。而检测一氧化氮的荧光探针多有报道，其中应用最为广泛的设计原理是利用邻苯二胺在氧气存在下，能够与一氧化氮发生特异性反应，生成苯并三唑结构。利用这一特异性反应，实现对荧光基团的调控，进而对一氧化氮分子进行检测。

溶酶体是细胞内的消化器官，是由单层膜包被的囊状结构，内含多种水解酶，其pH(≈4.5)低于胞浆内pH(≈7.0)，参与细胞的凋亡、吞噬等多种生理过程。有研究表明，溶酶体的功能可能会受到一氧化氮的调控。实时监测线粒体和溶酶体内的一氧化氮水平具有重要的研究价值和实用价值。HongZheng等人利用邻苯二胺与一氧化氮的反应特性，涉及了一种基于罗丹明“开-关”环原理的一氧化氮小分子探针，可以实现对一氧化氮的选择性荧光检测(Org.Lett.,2008，10，2357-2360)；在此基础上，HaiboYu等人报道了一种具有线粒体定位功能的一氧化氮荧光探针，可以定位于细胞的线粒体中，实现对细胞线粒体内一氧化氮的检测(Anal.Chem.,2013,85,7076-7084)。专利中也有报道检测一氧化氮的小分子荧光探针，如专利CN102617467A，CN103194214A，CN103923641A，CN104194773A等，这些专利中所涉及的一氧化氮小分子荧光探针均利用邻苯二胺与一氧化氮的反应特性而实现对一氧化氮的检测，特异性好，灵敏度高，但是均无法满足近红外检测的要求。中国专利201310021200.0，公开日2013年6月公开了一种荧光素内酰胺一氧化氮荧光探针的制备和用途，该荧光内酰胺在水溶液中无荧光，当与一氧化氮反应开环水解生成有荧光的荧光素衍生物。青岛科技大学2012年6月硕士学位论文《以罗丹明为骨架的NO分子荧光探针的合成及性能研究》，其利用叔丁基苯酚、邻苯二甲酸、N,N二乙氨基苯酚、邻苯二胺为原料合成以7位叔丁基取代的新型NO分子荧光探针，该探针对温度、pH有较好的稳定性，但其与NO的反应时间长。以上所述荧光探针都能较好的特异性识别NO，但其以荧光素和罗丹明为母体结构，以邻苯二胺为识别基团，激发波长和发射波长在可见光区，且不具备溶酶体特异性定位功能。我们知道，细胞内一氧化氮产生量较少，且性质活泼，实现活细胞内一氧化氮的荧光检测具有一定的难度，因此设计灵敏度高、特异性好的一氧化氮小分子荧光探针具有重要意义。特别是特异性检测特定细胞器中一氧化氮的小分子探针，对于研究一氧化氮在细胞内的分布情况及在生命活动中发挥的作用具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种硅基罗丹明一氧化氮荧光探针。

本发明的再一的目的是，提供如上所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针的制备方法。

本发明的另一的目的是，提供如上所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种硅基罗丹明一氧化氮荧光探针，所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针为SiRB-NO或Lyso-SiRB-NO；所述SiRB-NO结构如式(I)所示；所述Lyso-SiRB-NO结构如式(II)所示：

所述的Lyso-SiRB-NO具有溶酶体定位功能。

所述硅基罗丹明一氧化氮荧光探针检测pH值为2-8；优选为2-5；最优为4-5。

所述硅基罗丹明一氧化氮荧光探针在含20％乙腈的磷酸缓冲液中(10mM)，最大激发波长为分别为667nm(SiRB-NO，pH＝7.4)，667nm(Lyso-SiRB-NO，pH＝7.4)，671nm(Lyso-SiRB-NO，pH＝5.0)，最大发射波长分别为682nm(SiRB-NO，pH＝7.4)，680nm(Lyso-SiRB-NO，pH＝7.4)，685nm(Lyso-SiRB-NO，pH＝5.0)。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

所述具有通式(I)结构的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针的制备方法包括如下步骤：

1)将SiRB与POCl₃反应生成SiR-COCl；

2)将步骤1)的产物SiR-COCl与邻苯二胺反应生成SiRB-NO；

具体制备方法如下：

a、以1.0当量的SiRB溶于1,2-二氯乙烷中，缓慢滴加5.0当量的POCl₃，回流反应5小时，蒸干溶剂，固体用乙腈溶解；

b、将6.0当量邻苯二胺溶于乙腈和三乙胺的混合溶剂中，将步骤a固体的乙腈溶液缓慢滴加到该溶液中，室温下反应过夜，蒸干溶剂，加入CH₂Cl₂溶解，水洗，水层用CH₂Cl₂萃取，合并CH₂Cl₂层，水洗，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析，得探针SiRB-NO。其反应过程如下：

所述具有通式(II)结构的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针的制备方法包括如下步骤：

1)将Br-SiRB与POCl₃反应生成Br-SiR-COCl；

2)将步骤1)的产物Br-SiR-COCl与邻苯二胺反应生成Br-SiRB-NO；

3)将Br-SiRB-NO与CuI、PdCl₂(PPh₃)₂、N-炔丙基吗啉反应生成Lyso-SiRB-NO；

具体制备方法如下：

a、将1.0当量的Br-SiRB-NO溶于1,2-二氯乙烷中，缓慢滴加5.0当量的POCl₃，回流反应5小时，蒸干溶剂，固体用乙腈溶解；

b、将6.0当量邻苯二胺溶于乙腈和三乙胺的混合溶剂中，将步骤a固体的乙腈溶液缓慢滴加到该溶液中，室温下反应过夜，蒸干溶剂，加入CH₂Cl₂溶解，水洗，水层用CH₂Cl₂萃取，合并CH₂Cl₂层，水洗，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析，得探针Br-SiRB-NO；

c、将1.0当量Br-SiRB-NO溶于等体积的THF和三乙胺的混合溶剂中，加入0.4当量CuI，0.2当量PdCl₂(PPh₃)₂，5.0当量N-炔丙基吗啉，氩气保护，80℃下反应12小时后，反应液倒入水中，CH₂Cl₂萃取三次，合并CH₂Cl₂层，水洗，无水硫酸钠干燥，柱层析，得探针Lyso-SiRB-NO。其反应过程如下：

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:

如上所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针在检测一氧化氮中的应用。

如上所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针在制备一氧化氮检测试剂中的应用。

如上所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针在制备细胞染料、生物染色剂、生物分子或生物粒子荧光标记中的应用。

如上所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针在检测细胞内一氧化氮及生物成像中的应用。

所述检测为体外样品检测。

特别的，所述探针具有溶酶体定位功能，在活细胞荧光成像的应用中，可以定位于细胞的溶酶体，并识别溶酶体内的一氧化氮。

如上所述的具有通式(II)结构的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针在靶向传感细胞溶酶体中一氧化氮及生物成像中的应用。

本发明荧光探针的结构中以硅原子取代氧原子，实现了光谱红移；引入带有吗啉碱性结构的溶酶体识别基团，实现了溶酶体定位的功能。

本发明优点在于：

本发明设计并合成一种新型硅基罗丹明一氧化氮探针，该探针的优势在于其激发和发射波长位于近红外光区，在应用于生物成像时可以降低生物体自身荧光背景的干扰，且穿透能力强，对活体组织或细胞的损伤较小；该探针的另一优势在于能够特异性检测溶酶体内的一氧化氮分子，为研究一氧化氮分子的生理作用提供了可靠的研究工具。

附图说明

图1为本发明中探针SiRB-NO的核磁氢谱图。

图2为本发明中探针SiRB-NO的核磁碳谱图。

图3为本发明中探针Lyso-SiRB-NO的核磁氢谱图。

图4为本发明中探针Lyso-SiRB-NO的核磁碳谱图。

图5为本发明中探针SiRB-NO在不同pH下激发光波长为630nm时，682nm处的荧光变化图。

图6为本发明中探针Lyso-SiRB-NO在不同pH下激发光波长为630nm时，680nm处的荧光变化图。

图7为本发明中探针SiRB-NO在pH为7.4条件下加入不同当量一氧化氮的荧光光谱图。

图8为本发明中探针Lyso-SiRB-NO在pH为7.4条件下加入不同当量一氧化氮的荧光光谱图。

图9为本发明中探针Lyso-SiRB-NO在pH为5.0条件下加入不同当量一氧化氮的荧光光谱图。

图10为本发明的探针选择性实验结果。

图11为本发明中探针Lyso-SiRB-NO对人肝癌细胞(HepG2)染色激光共聚焦荧光成像效果图。

图12为本发明中探针Lyso-SiRB-NO对人正常肝细胞(LO2)染色激光共聚焦荧光成像效果图。

图13为本发明中探针Lyso-SiRB-NO检测巨噬细胞(Raw264.7)内源性生成的一氧化氮激光共聚焦成像效果图。

图10、11、12中，(a)均表示激发光为633nm时激光共聚焦荧光成像效果图；(b)均表示激发光为488nm时激光共聚焦荧光成像效果图；(c)均表示细胞明场效果图；(d)均表示(a)、(b)、(c)的叠加效果图。

图13中，(a)表示激发光为633nm时激光共聚焦荧光成像效果图；(b)表示细胞明场效果图；(c)均表示(a)、(b)的叠加效果图。

图14为探针Rh-NO在不同pH下激发波长530nm时，574nm荧光变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1探针SiRB-NO的合成

在装有磁力搅拌子的50ml反应瓶中，加入原料SiRB727mg(1.5mmol)，ClCH₂CH₂Cl(10ml)溶解，氩气保护，磁力搅拌，室温下，缓慢加入POCl₃0.55ml，滴加完毕后，加热回流，反应4小时后，停止加热，自然冷却至室温，减压蒸干溶剂，剩余固体加入10mL乙腈溶解，备用。在另一50mL反应瓶中，加入邻苯二胺973mg(9.0mmol)，加入乙腈5mL，三乙胺5mL，磁力搅拌，氩气保护下，将之前所得固体的乙腈溶液缓慢导入该反应液中，室温下反应过夜。减压蒸干溶剂，剩余物用30mLCH₂Cl₂溶解，再加入30mL水，萃取，分取CH₂Cl₂层，水层用CH₂Cl₂萃取(20mL×3)，合并CH₂Cl₂层，水洗两遍，饱和NaCl溶液洗一遍，无水Na₂SO₄干燥，过滤，硅胶柱层析，洗脱剂石油醚:乙酸乙酯＝5:1，得白色固体535mg，产率62％。高分辨质谱HRMS(ESI):m/zcalcdforC₃₆H₄₂N₄OSi[M+H]⁺:575.3200；found:575.3204；其核磁¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ8.06-5.83(m,014H),3.37(q,8H,J＝7.1Hz),3.17(br,2H),1.17(t,12H,J＝7.0Hz),0.43(s,3H),-0.32(s,3H)；¹³CNMR(75MHz,CDCl₃):δ167.3,155.1,146.1,145.5,137.2,132.6,132.4,131.3,130.6,130.2,128.8,127.8,124.3,123.4,122.1,118.0,116.6114.8,113.9,75.1,44.2,12.5,-0.6,-1.7。

实施例2探针Lyso-SiRB-NO的合成

1.Br-SiRB-NO的合成：

在装有磁力搅拌子的50mL反应瓶中，加入原料Br-SiRB450mg(0.8mmol)，ClCH₂CH₂Cl(5mL)溶解，氩气保护，磁力搅拌，室温下，缓慢加入POCl₃0.3mL，滴加完毕后，加热回流，反应4小时后，停止加热，自然冷却至室温，减压蒸干溶剂，剩余固体加入5mL乙腈溶解，备用。在另一50mL反应瓶中，加入邻苯二胺519mg(4.8mmol)，加入乙腈4mL，三乙胺4mL，磁力搅拌，氩气保护下，将之前所得固体的乙腈溶液缓慢导入该反应液中，室温下反应过夜。减压蒸干溶剂，剩余物用30mLCH₂Cl₂溶解，再加入30mL水，萃取，分取CH₂Cl₂层，水层用CH₂Cl₂萃取(20mL×3)，合并CH₂Cl₂层，水洗两遍，饱和NaCl溶液洗一遍，无水Na₂SO₄干燥，过滤，硅胶柱层析，洗脱剂石油醚:乙酸乙酯＝5:1，得白色固体280mg，产率54％。高分辨质谱HRMS(ESI)calcd.forC₃₆H₄₂BrN₄OSi[M+H]⁺:653.2306,found:653.2319。其核磁¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ7.92-5.79(m,13H),3.38(q,8H,J＝6.7Hz),3.15(s,2H),1.19(t,12H,J＝7.0Hz),0.44(s,3H),-0.31(s,3H)；¹³CNMR(75MHz,CDCl₃):δ166.3,156.7,146.2,145.4,137.3,137.2,131.5,131.3,130.3,129.0,127.5,127.4,126.3,125.0,121.6,118.10,116.8,114.8,114.0,74.7,44.2,12.5,-0.7,-1.7。

2.Lyso-SiRB-NO的合成：

在装有磁力搅拌子的10mL反应管中，加入Br-SiRB-NO65mg(0.10mmol),CuI8mg(0.04mmol)，PdCl₂(PPh₃)₂14mg(0.02mmol)，N-炔丙基吗啉63mg(0.50mmol)，氩气保护，加入THF(1mL)和三乙胺(1mL)溶解，磁力搅拌，80℃下反应12小时后，将反应液倒入水中(30mL)CH₂Cl₂萃取(20mL×3)，合并CH₂Cl₂层，水洗两遍，饱和NaCl溶液洗一遍，无水Na₂SO₄干燥，过滤，硅胶柱层析，洗脱剂石油醚:乙酸乙酯＝4:1，得白色固体49mg，产率70％。高分辨质谱HRMS(ESI)calcd.forC₃₃H₄₃N₄OSi[M+H]⁺:698.3885,found:698.3886。其核磁¹HNMR(600MHz,CDCl₃):δ5.80-7.96(m,13H),3.73(t,4H,J＝4.2Hz),3.45(s,2H),3.32-3.39(m,8H),2.59(t,4H,J＝4.2Hz),1.16(t,12H,J＝7.2Hz),0.41(s,3H),-0.34(s,3H)；¹³CNMR(150MHz,CDCl₃):δ167.98,156.54,147.57,146.84,138.66,133.35,132.72,132.16,131.85,131.64,130.23,129.04,128.55,124.72,123.30,119.44,118.07,116.18,115.32,87.88,86.73,76.34,68.23,53.77,49.37,45。

实施例3：探针SiRB-NO在不同pH下荧光变化情况测定

1、探针SiRB-NO高标溶液配置

准确称取一定量的探针SiRB-NO，用乙腈溶剂，配置成浓度为0.5mM的高标溶液。

2、探针SiRB-NO自身在不同pH下荧光变化情况测定

移液器吸取20μL探针母液分别加入2000μL不同pH(2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,7.4,8.0,9.0,10.0,11.0,12.0)的磷酸缓冲液(0.1M，含20％乙腈)中，15分钟后测其荧光值，激发波长630nm，检测波长682nm。荧光效果见附图5。

3、不同pH对SiRB-NO在一氧化氮识别性能的影响测定

移液器吸取20μL探针母液分别加入2000μL不同pH(2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,7.4,8.0,9.0,10.0,11.0,12.0)的磷酸缓冲液中，再分别加入10当量的一氧化氮，15分钟后测其荧光值，激发波长630nm，检测波长682nm。荧光效果见附图5。

实施例4：探针Lyso-SiRB-NO在不同pH下荧光变化情况测定

1、探针Lyso-SiRB-NO高标溶液配置

准确称取一定量的探针Lyso-SiRB-NO，用乙腈溶剂，配置成浓度为0.5mM的高标溶液。

2、探针Lyso-SiRB-NO自身在不同pH下荧光变化情况测定

移液器吸取20μL探针母液分别加入2000μL不同pH(2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,7.4,8.0,9.0,10.0,11.0,12.0)的磷酸缓冲液中，15分钟后测其荧光值，激发波长630nm，检测波长680nm。荧光效果见附图6。

3、不同pH对探针Lyso-SiRB-NO的一氧化氮识别性能的影响测定

移液器吸取20μL探针母液分别加入2000μL不同pH(2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,7.4,8.0,9.0,10.0,11.0,12.0)的磷酸缓冲液中，再分别加入10当量的一氧化氮，15分钟后测其荧光值，激发波长630nm，检测波长680nm。荧光效果见附图6。

实施例5：探针SiRB-NO在pH为7.4条件下荧光光谱测定

微量移液器吸取20μL探针高标溶液，加入2000μL磷酸缓冲液(pH＝7.4)，再在该缓冲液中加入不同当量的一氧化氮，15分钟后测其荧光值。激发波长630nm，检测波长650-760nm荧光效果见附图7。

实施例6：探针Lyso-SiRB-NO在pH为7.4条件下荧光光谱测定

测定方法同实施例5，只是加入的探针为Lyso-SiRB-NO。结果见图8。

实施例7：探针Lyso-SiRB-NO在pH为5.0条件下荧光光谱测定

测定方法同实施例6，只是磷酸缓冲液的pH值为5.0。结果见图9。

实施例8：探针SiRB-NO在pH为7.4条件下的选择性实验

微量移液器吸取20μL探针SiRB-NO高标溶液，加入2000μL磷酸缓冲液(pH＝7.4)中，再在该缓冲液中加入10equiv.NO或者100equiv.不同干扰物(L-Arg,L-Cys,GSH,DHA,AA,H₂O₂,ClO^-,NO^2-,NO^3-,^·OH,¹O₂)，反应15分钟后测其荧光值。激发波长630nm，检测波长682nm，荧光效果见附图10。

实施例9：探针Lyso-SiRB-NO在pH为7.4条件下的选择性实验

测定方法同实施例8，只是加入的探针为Lyso-SiRB-NO，检测波长为680nm。结果见图10。

实施例10：探针Lyso-SiRB-NO在pH为5.0条件下的选择性实验

测定方法同实施例8，只是加入的探针为Lyso-SiRB-NO,磷酸缓冲液pH为5.0，检测波长为685nm。结果见图10。

实施例11：探针Lyso-SiRB-NO活细胞荧光成像实验

1.细胞培养

试验细胞：选用人正常细胞(LO2)和人肝癌细胞(HepG2)；

细胞培养条件：使用含10％FBS、0.1mg/mL链霉素和100U/mL的青霉素的DMEM培养基，在含5％CO₂、95％空气，37℃恒温，饱和湿度的细胞培养箱中培养细胞。细胞聚合度达到90％时，吸出培养基并用PBS溶液清洗细胞2次，使用0.25％胰蛋白酶消化2分钟，吸出胰蛋白酶，加入培养基吹散细胞，将细胞以1:3比例传代到培养皿，每天更换一次培养基。

2.试验用荧光染料的配置

将探针Lyso-SiRB-NO用DMSO配置成1.0mM的溶液备用。

3.细胞染色方法

将HepG2细胞以2×10⁵密度接种于激光共聚焦培养皿中，在含5％CO₂、95％空气，37℃恒温，饱和湿度的细胞培养箱中培养细胞24h后，弃去培养基并用PBS清洗1遍。在2.0mL新鲜培养基中加入探针Lyso-SiRB-NO溶液10μL，混合均匀后加入培养皿中，培养箱中孵育40分钟，弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤三遍。再在2.0mL新鲜培养基中加入DND-26(1.0mM)2μL，混合均匀后加入培养皿中，培养箱中再孵育30分钟，弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤三遍，加入一氧化氮浓度为100μM的PBS缓冲液，激光共聚焦显微镜下观察，激发光源488nm和633nm。激光共聚焦荧光成像图见附图11。探针Lyso-SiRB-NO对LO2细胞染色方法同对HepG2细胞染色方法一致，激光共聚焦荧光成像图见附图12。

4.细胞染色实验结果

细胞染色结果见附图11、附图12(成像效果转化为灰度模式)，可见探针Lyso-SiRB-NO可以透过细胞膜进入细胞并与DND-26定位于相同的细胞器—溶酶体，并且可以选择性的对一氧化氮分子进行识别成像。

实施例12：探针Lyso-SiRB-NO检测细胞内源性生成一氧化氮荧光成像实验

1.细胞培养

试验细胞：选用巨噬细胞(Raw264.7)；

细胞培养条件：使用含10％FBS、0.1mg/mL链霉素和100U/mL的青霉素的DMEM培养基，在含5％CO₂、95％空气，37℃恒温，饱和湿度的细胞培养箱中培养细胞。细胞聚合度达到90％时，吸出培养基并加入新的培养基，用培养基吹打细胞，使细胞呈悬浮状态，将细胞以1:5比例传代到培养皿，每天传代一次。

2.试验用荧光染料的配置

将探针Lyso-SiRB-NO用DMSO配置成1.0mM的溶液备用。

3.细胞染色方法

将Raw264.7细胞以1×10⁵密度接种于激光共聚焦培养皿中，加入含有探针Lyso-SiRB-NO(5.0μM),L-精氨酸(L-Arg,5.0mg/mL)，干扰素γ(IFN-γ,20ng/mL)和脂多糖(LPS,50μg/mL)的培养基2mL，在含5％CO₂、95％空气，37℃恒温，饱和湿度的细胞培养箱中培养细胞12h后，弃去培养基并用PBS清洗3遍，激光共聚焦显微镜下观察；将Raw264.7细胞以1×10⁵密度接种于激光共聚焦培养皿中，加入含有探针Lyso-SiRB-NO(5.0μM)，干扰素γ(IFN-γ,20ng/mL)，脂多糖(LPS,50μg/mL)和N-硝基-L-精氨酸(L-NNA，20.0μM)的培养基2mL，在含5％CO₂、95％空气，37℃恒温，饱和湿度的细胞培养箱中培养细胞12h后，弃去培养基并用PBS清洗3遍，激光共聚焦显微镜下观察。将Raw264.7细胞以1×10⁵密度接种于激光共聚焦培养皿中，加入含有探针Lyso-SiRB-NO(5.0μM)的培养基2mL，在含5％CO₂、95％空气，37℃恒温，饱和湿度的细胞培养箱中培养细胞12h后，弃去培养基并用PBS清洗3遍，激光共聚焦显微镜下观察。实验结果见附图13。

4.细胞染色实验结果

细胞染色结果见附图13(成像效果转化为灰度模式)，可见探针可以选择性的对巨噬细胞内源性产生的一氧化氮分子进行识别成像，该探针灵敏度高，选择性好，具有良好的应用价值。

对比例

发明人在实验过程中还合成了具有如下结构的荧光探针Rh-NO，并检测不同pH对其荧光强度的影响。

实验方法如下：

1、探针Rh-NO高标溶液配置

准确称取一定量的探针Rh-NO，用乙腈溶剂，配置成浓度为0.5mM的高标溶液。

2、探针Rh-NO自身在不同pH下荧光变化情况测定

移液器吸取20μL探针母液分别加入2000μL不同pH(2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,7.4,8.0,9.0,10.0,11.0,12.0)的磷酸缓冲液(0.1M，含20％乙腈)中，15分钟后测其荧光值，激发波长530nm，检测波长574nm。

3、不同pH对Rh-NO在一氧化氮识别性能的影响测定

移液器吸取20μL探针母液分别加入2000μL不同pH(2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,7.4,8.0,9.0,10.0,11.0,12.0)的磷酸缓冲液中，再分别加入10当量的一氧化氮，15分钟后测其荧光值，激发波长530nm，检测波长574nm。

检测结果如下，结果显示：上述结构的化合物的激发波长位于可见光区域，当缓冲液pH小于6时，探针受pH影响，荧光背景随pH减小而逐渐增强(见图14)；且由于无特殊定位基团，该探针无法特异性的定位于溶酶体，不适合用于溶酶体内一氧化氮的检测。本发明中硅原子的引入，不但使探针的光谱红移至近红外光区，且增强了螺环的稳定性，在低pH条件下，荧光背景不会增加。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种硅基罗丹明一氧化氮荧光探针，其特征在于，所述硅基罗丹明一氧化氮荧光探针为SiRB-NO或Lyso-SiRB-NO；所述SiRB-NO结构如式(I)所示；所述Lyso-SiRB-NO结构如式(II)所示；所述的Lyso-SiRB-NO具有溶酶体定位功能；

2.根据权利要求1所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针，其特征在于，所述硅基罗丹明一氧化氮荧光探针检测pH值为2-8。

3.根据权利要求1所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针，其特征在于，所述硅基罗丹明一氧化氮荧光探针在含20％乙腈的磷酸缓冲液中(10mM)，最大激发波长为分别为667nm(SiRB-NO，pH＝7.4)，667nm(Lyso-SiRB-NO，pH＝7.4)，671nm(Lyso-SiRB-NO，pH＝5.0)，最大发射波长分别为682nm(SiRB-NO，pH＝7.4)，680nm(Lyso-SiRB-NO，pH＝7.4)，685nm(Lyso-SiRB-NO，pH＝5.0)。

4.一种制备权利要求1所述的具有式(I)结构的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)将SiRB与POCl₃反应生成SiR-COCl；

2)将步骤1)的产物SiR-COCl与邻苯二胺反应生成SiRB-NO；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进一步包括：

1)以1.0当量的SiRB溶于1,2-二氯乙烷中，缓慢滴加5.0当量的POCl₃，回流反应5小时，蒸干溶剂，固体用乙腈溶解；

2)将6.0当量邻苯二胺溶于乙腈和三乙胺的混合溶剂中，将步骤1)固体的乙腈溶液缓慢滴加到该溶液中，室温下反应过夜，蒸干溶剂，加入CH₂Cl₂溶解，水洗，水层用CH₂Cl₂萃取，合并CH₂Cl₂层，水洗，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析，得探针SiRB-NO。

6.一种制备权利要求1所述具有式(II)结构的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)将Br-SiRB与POCl₃反应生成Br-SiR-COCl；

2)将步骤1)的产物Br-SiR-COCl与邻苯二胺反应生成Br-SiRB-NO；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进一步包括：

1)将1.0当量的Br-SiRB-NO溶于1,2-二氯乙烷中，缓慢滴加5.0当量的POCl₃，回流反应5小时，蒸干溶剂，固体用乙腈溶解。

2)将6.0当量邻苯二胺溶于乙腈和三乙胺的混合溶剂中，将步骤1)固体的乙腈溶液缓慢滴加到该溶液中，室温下反应过夜，蒸干溶剂，加入CH₂Cl₂溶解，水洗，水层用CH₂Cl₂萃取，合并CH₂Cl₂层，水洗，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析，得探针Br-SiRB-NO；

3)将1.0当量Br-SiRB-NO溶于等体积的THF和三乙胺的混合溶剂中，加入0.4当量CuI，0.2当量PdCl₂(PPh₃)₂，5.0当量N-炔丙基吗啉，氩气保护，80℃下反应12小时后，反应液倒入水中，CH₂Cl₂萃取三次，合并CH₂Cl₂层，水洗，无水硫酸钠干燥，柱层析，得探针Lyso-SiRB-NO。

8.权利要求1所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针的用途，其特征在于，所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针用于：

a)检测一氧化氮；

b)制备一氧化氮检测试剂；

c)制备细胞染料、生物染色剂、生物分子或生物粒子荧光标记；

d)检测细胞内一氧化氮及生物成像。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的检测为体外样品检测。

10.权利要求1所述的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针的用途，其特征在于，所述的具有通式(II)结构的硅基罗丹明一氧化氮荧光探针在靶向传感细胞溶酶体中一氧化氮及生物成像中的应用。