CN111334066A - 一类640nm激发的近红外荧光染料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一类640nm激发的近红外荧光染料及其制备方法，其结构通过不同刚性的五元环与六元环的氮端修饰，具体如式(1)所示，实现了吸收与荧光光谱的红移，最大红移了45nm。同时，本发明涉及的染料光稳定性高，量子产率高(在甲醇中达到0.3以上)，且其底环的螺环开环与闭环形式分别对应有色与无色，可进行光调控，用于生物荧光探针及其超分辨成像中。
Description
技术领域
本发明属于荧光染料领域，具体涉及一类640nm激发的近红外荧光染料及其制备方法。
背景技术
随着生命科学不断突飞猛进式的发展，荧光成像技术作为一种新兴的分析技术，其具有高灵敏度、高选择性及实时观察等优势，在医学、生物学、环境科学等领域有着十分广泛的应用。同时，近红外荧光染料(通常是指荧光发射波长在650-1000nm波段)波段为生物自发荧光的沉默区，背景干扰小，且其具有深的组织穿透性特点，而引起人们广泛的关注。
目前近红外的商业化荧光染料主要为菁染料，640nm的荧光染料主要为Cy5，其光稳定性差，而硅基罗丹明，其保持了罗丹明类染料光稳定性高、量子产率高的特点，成为生物医学成像领域的新宠儿。但是，目前关于硅基罗丹明的研究才刚起步，构效关系还不是十分明确，基于此母体结构的不同波段的近红外染料较少。因此，开发设计出一系列不同波段的640nm激发的近红外硅基罗丹明荧光染料具有重要意义。
发明内容
本发明目的是提供一类640nm激发的近红外荧光染料及其制备方法。
一类640nm激发的近红外荧光染料，该类染料光稳定性高，量子产率在甲醇中均达到0.3以上。
一类640nm激发的近红外荧光染料的制备方法，该方法具有原料廉价，合成操作简便，易于纯化等优点。
本发明一类640nm激光激发的近红外荧光染料，所用原料廉价易得，该类荧光染料具有如下结构：
其中：n可为1，2，
R为H、
m＝0，1，2，3。
一类640nm激发的近红外荧光染料的制备方法，第一种对称形式，合成如下：
(1)中间体1的合成
4-溴吲哚(5-溴喹啉)溶于乙酸中，在冰浴条件下，分批少量的加入还原性试剂，升至室温搅拌4-8h后，停止反应；减压除去大部分的乙酸后，调节pH到弱碱性后，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，除去有机溶剂得到中间体1；
其中，4-溴吲哚或5-溴喹啉与还原试剂的质量比为1：0.5-1，4-溴吲哚或5-溴喹啉与冰醋酸的质量与体积比为1：10-15g/mL；
(2)中间体2的合成
称取强拔氢性试剂于史莱克瓶中，在氮气保护、冰浴条件下，依次加入中间体1的四氢呋喃溶液，卤代物，升温至室温搅拌过夜；用水淬灭后，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品，经200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为纯石油醚，得到中间体2；
其中，中间体1与拔氢性试剂、卤代物的质量比为1：0.3-0.5：1-2，中间体1的质量与四氢呋喃的体积比为1-10-20g/mL；
(3)中间体3的合成
取中间体2于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃，置于-78℃体系中搅拌；加入丁基锂溶液搅拌20-40min后，再加入二氯二甲基硅烷，升至室温搅拌过夜；饱和氯化铵溶液淬灭，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去溶剂得粗产品，经200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为体积比40-10:1的石油醚和乙酸乙酯，得到中间体3；
其中，中间体2的质量与丁基锂的体积比为1:2-3g/mL,丁基锂溶液与二氯二甲基硅烷、四氢呋喃的体积比为1:0.1-0.2:10-15；
(4)中间体4的合成
中间体3溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，分批少量的加入N-溴琥珀酰亚胺；室温搅拌1-4h，减压除去溶剂后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去溶剂后，得到粗产品，经200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为体积比为30-10:1石油醚的乙酸乙酯，得到中间体4；
其中，中间体3与N-溴琥珀酰亚胺的质量比为1：1-2，中间体3的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为30-50:1mg/mL；
(5)中间体5的合成
中间体4于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，使体系温度降至-15℃至-10℃，搅拌条件下丁基锂溶液，搅拌20-40min；加入二甲胺基甲酰氯，升至室温搅拌过夜；饱和氯化铵水溶液淬灭，加水稀释，乙酸乙酯萃取，洗涤干燥；减压除去溶剂得到粗产品，经200-300目的硅胶柱分离，洗脱剂为体积比为600-300：1的二氯甲烷和甲醇，得到中间体5；
其中，丁基锂溶液与二甲胺基甲酰氯、四氢呋喃的体积比为10-20：1:200-400，中间体4的质量与丁基锂溶液的体积比为1:2-4g/mL；
(6)目标荧光分子合成
2-溴苯甲酸叔丁酯于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入丁基锂溶液，搅拌20-40min后；加入中间体5的四氢呋喃溶液，升至室温搅拌避光过夜；饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品，经200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为体积比50-20:1的石油醚和乙酸乙酯，得到目标荧光染料分子；
其中，中间体5与2-溴苯甲酸叔丁酯的质量比为1:4-8，中间体5的质量与丁基锂溶液的体积比为10-20：1mg/mL。
步骤(1)中，还原试剂为氰基硼氢化钠、硼氢化钠；干燥试剂为无水硫酸钠或者无水硫酸钾。
步骤(2)中，强的拔氢试剂可以为NaH、KH；卤代物可以为RI，RBr，RCl，其中R可为H，低碳烷烃。
步骤(3)中，丁基锂溶液可以为正丁基锂的不同浓度的己烷溶液，或者异丁基锂的不同浓度的庚烷溶液。
步骤(5)中，丁基锂溶液可以为正丁基锂的不同浓度的己烷溶液，或者异丁基锂的不同浓度的庚烷溶液。
步骤(6)中，丁基锂溶液可以为正丁基锂的不同浓度的己烷溶液，或者异丁基锂的不同浓度的庚烷溶液。
一类640nm激发的近红外荧光染料的制备方法，第二种不对称形式，合成如下：
(1)中间体1的合成
4-溴吲哚(5-溴喹啉)溶于乙酸中，在冰浴条件下，分批少量的加入还原性试剂，升至室温搅拌4-8h后，停止反应；减压除去大部分的乙酸后，调节pH到弱碱性后，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，除去有机溶剂得到中间体1；
其中，4-溴吲哚或5-溴喹啉与还原试剂的质量比为1：0.5-1，4-溴吲哚或5-溴喹啉的质量与冰醋酸的体积比为1：10-15g/mL；
(2)中间体2的合成
称取强拔氢性试剂于史莱克瓶中，在氮气保护、冰浴条件下，依次加入中间体1的四氢呋喃溶液，卤代物，升温至室温搅拌过夜；用水淬灭后，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品，经200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为纯石油醚，得到中间体2；
其中，中间体1与拔氢性试剂、卤代物的质量比为1：0.3-0.5：1-2，中间体1的质量与四氢呋喃的体积比为1-10-20g/mL；
(3)中间体7的合成
中间体2溶于DMF中，加入三氯氧磷，升温至80-100℃搅拌，冷却后调节酸碱性至弱碱性，二氯甲烷萃取，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后，加入甲醇，缓慢加入硼氢化钠，室温搅拌1-4h；减压除去甲醇后，加水淬灭，二氯甲烷萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂得到粗产品，经200-300目硅胶柱分离，脱洗剂为体积比20-5:1的石油醚和乙酸乙酯，得白色固体；
其中，中间体2与硼氢化钠的质量比为50-80:1，三氯氧磷与DMF、甲醇的体积比为1:30-50:5-15，中间体2的质量与DMF的体积比为1:15-30g/mL；
(4)中间体8的合成
中间体2和中间体7溶于二氯甲烷中，加入三氟化硼乙醚，室温搅拌24-36h。减压除去二氯甲烷后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂得粗产品，经200-300目硅胶柱分离，脱洗剂为体积比50-20:1的石油醚和乙酸乙酯，得到白色固体；
其中，中间体2与中间体7的质量比为1:1-1.5，中间体2的质量与三氟化硼乙醚的体积比为1:1-2mg/μL；
(5)中间体9的合成
取中间体8与史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，置于温度-15℃至-10℃的冰盐浴中，加入丁基锂试剂，搅拌20-40min，氮气保护下加入二氯二甲基硅烷，室温搅拌过夜；氯化铵水溶液淬灭，加水稀释，乙酸乙酯萃取，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后，加入丙酮，零度下缓慢分批加入高锰酸钾，保持此温度搅拌1-3h；过滤，滤液减压除去有机溶剂得粗产品，经200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为体积比600-200:1的二氯甲烷和甲醇，得到黄色固体；
其中，中间体8与高锰酸钾的质量比为1:0.5-2，丁基锂溶液与二氯二甲基硅烷、四氢呋喃、丙酮的体积比为5-10:1：300-500:500-1000，中间体8的质量与丁基锂溶液的体积比为1:2-3mg/μL；
(6)目标荧光染料的合成
2-溴苯甲酸叔丁酯于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入丁基锂溶液，搅拌20-40min后；加入中间体9的四氢呋喃溶液，升至室温搅拌避光过夜；饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品；粗产品经过柱层析分离，洗脱剂为体积比为50-20:1的石油醚和乙酸乙酯，减压除去有机溶剂后得到目标荧光染料分子；
其中，中间体9与2-溴苯甲酸叔丁酯的质量比为1:4-7，丁基锂溶液与四氢呋喃的体积比为1：30-50，中间体9的质量与丁基锂的体积比为1:10-20mg/μL。
步骤(5)中，丁基锂溶液可以为正丁基锂的不同浓度的己烷溶液，或者异丁基锂的不同浓度的庚烷溶液。
步骤(6)中，丁基锂溶液可以为正丁基锂的不同浓度的己烷溶液，或者异丁基锂的不同浓度的庚烷溶液。
本发明的640nm激光激发的近红外荧光染料的合成方法具有原料廉价易得、合成步骤简单、产物易纯化、反应收率高等优点。
一种如权利要求1所述640nm激发的荧光染料的应用，所述荧光染料具有较高的光稳定性，荧光发射波长在近红外区域，较高的荧光量子产率(甲醇中均达到0.3以上)，可控的光开关性能，使其应用于更加复杂的发光材料、生物探针及超分辨成像领域中。
本发明提供了一类新型640nm激光激发的荧光染料及其制备方法。该类染料具有合成原料廉价易得、操作简单，同时底环的结构易修饰等优点。同时，具有高的光稳定性，荧光发射波长在近红外区域，高的荧光量子产率，可控的光开关性能以及高的激光器的匹配程度，使其可应用于更加复杂的发光材料、生物探针及超分辨成像等领域中。
附图说明
图1：实施例1制备的荧光染料SiR-1的核磁氢谱，
图2：实施例1制备的荧光染料SiR-1的高分辨质谱，
图3：实施例1制备的荧光染料SiR-1在甲醇中的吸收和荧光归一化图，
图4：实施例2制备的荧光染料SiR-2的核磁氢谱，
图5：实施例2制备的荧光染料SiR-2的高分辨质谱，
图6：实施例2制备的荧光染料SiR-2在甲醇中的吸收和荧光归一化图，
图7：实施例3制备的荧光染料SiR-3的高分辨质谱，
图8：实施例3制备的荧光染料SiR-3在甲醇中的吸收和荧光归一化图，
图9：实施例1制备的荧光染料SiR-1的细胞的成像图，染料终浓度为1μM。
具体实施方式
实施例1
目标荧光染料SiR-1的合成
中间体5-溴四氢喹啉的合成
5-溴喹啉(3.5g)溶于45mL乙酸中，在冰浴条件下，分批少量的加入氰基硼氢化钠，共2.5g，升至室温搅拌2h后，加入多聚甲醛继续搅拌4h后，减压除去大部分的乙酸，饱和的碳酸钠水溶液调节pH为弱碱性，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为纯石油醚，除去有机溶剂后得到无色液体1.7g，产率46％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.90(t,J＝7.9Hz,1H),6.86(dd,J＝7.9,1.4Hz,1H),6.52(dd,J＝7.9,1.1Hz,1H),3.20(t,2H),2.88(s,3H),2.79(t,J＝6.6Hz,2H),2.05–1.93(m,2H).
中间体2的合成
取N-甲基-5-溴四氢喹啉450mg于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃15mL，置于-78℃体系中搅拌。加入1.17mL 1.7M异丁基锂的庚烷溶液搅拌30min后，再加入95μL的二氯二甲基硅烷，升至室温搅拌过夜。饱和氯化铵溶液淬灭，加入50mL水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝20:1(体积比)。得到无色液体272mg，产率78％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.08(t,J＝7.7Hz,2H),6.83(dd,J＝7.3,0.8Hz,2H),6.66(d,J＝8.0Hz,2H),3.14(t,2H),2.87(s,3H),2.63(t,J＝6.4Hz,2H),1.85–1.77(m,J＝15.6,6.2Hz,2H),0.54(s,3H).
中间体3的合成
272mg的中间体2溶于干燥5mL N,N-二甲基甲酰胺中，分批少量的加入N-溴琥珀酰亚胺，共239mg。室温搅拌三个小时，减压除去溶剂后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂后，得到粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1(体积比)，减压除去溶剂得到白色固体300mg，产率76％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.20(d,J＝8.7Hz,2H),6.43(d,J＝8.7Hz,2H),3.10(t,J＝6.2Hz,2H),2.82(s,3H),2.70(t,2H),1.80–1.72(m,2H),0.81(s,3H).
中间体4的合成
200mg中间体3于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，使体系温度降至零下15℃，搅拌条件下加入1.7M异丁基锂的庚烷溶液0.46mL，搅拌半个小时后。加入二甲胺基甲酰氯60μL，升至室温搅拌过夜。饱和氯化铵水溶液淬灭，加水稀释，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥。减压除去溶剂得到粗产品，粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝300:1(体积比)，得到黄色固体90mg，产率61％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(d,J＝8.9Hz,2H),6.75(d,J＝9.0Hz,2H),3.38(t,J＝6.0Hz,2H),2.99(s,3H),2.90(t,2H),2.07–1.98(m,2H),0.61(s,3H).
目标荧光染料SiR-1的合成
2-溴苯甲酸叔丁酯96mg于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入220μL 1.7M异丁基锂的庚烷溶液，搅拌30min后。加入20mg中间体4的四氢呋喃溶液，升至室温搅拌避光过夜。饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝30:1(体积比)，减压除去有机溶剂后得到无色固体14mg，产率55％。
实施例1中制备的荧光染料SiR-1的核磁氢谱如图1所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(d,J＝7.6Hz,1H),7.48(td,J＝7.5,1.0Hz,1H),7.39(td,J＝7.4Hz,1H),7.08(d,J＝7.7Hz,1H),6.78(d,J＝8.8Hz,2H),6.49(d,J＝8.9Hz,2H),3.26(t,J＝6.1Hz,4H),2.97–2.89(m,J＝11.1,5.5Hz,4H),2.01(t,4H),0.76(s,3H),0.67(s,3H).
实施例1中得到的目标染料SiR-1的高分辨质谱如图2所示，具体数据为：高分辨质谱理论值C30H33N2O2Si[M+H]+481.2311,实测值481.2284.
经检测，其结构如上式SiR-1所示，可以进行细胞中线粒体的成像，其光性能如下：
硅基取代罗丹明类染料分子SiR-1在乙醇中的吸收与发射光谱测试。将实施例1所得到的染料分子SiR-1溶解于DMSO溶液中，配制成不同染料的2mM母液，取20μL母液于4mL甲醇中，配成终浓度10μM的测试液，测试其吸收与荧光光谱。
SiR-1在乙醇中的吸收与发射归一化谱图分别如图3所示：图3为实施例1中得到的染料分子SiR-1在甲醇中的吸收和荧光归一化图，其吸收为648nm，发射波长在663nm，经计算得量子产率为0.34。
实施例2
目标荧光染料SiR-2的合成
中间体5的合成
3.5g 4-溴吲哚溶于45mL乙酸中，在冰浴条件下，分批少量的加入氰基硼氢化钠，共2.2g，升至室温搅拌4h后，停止反应。减压除去大部分的乙酸后，用饱和碳酸钠溶液调节pH到弱碱性后，乙酸乙酯萃取三次，收集有机相，无水硫酸钠干燥，除去有机溶剂得到无色液体产品3.2g，产率91％。
中间体6的合成
称取381mg氢化钠的70％油状分散物品于史莱克瓶中，在氮气保护、冰浴条件下，依次加入4-溴吲哚啉1.0g溶于四氢呋喃溶液，碘甲烷1.6g，升温至室温搅拌过夜。用水淬灭后，乙酸乙酯萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为纯石油醚，得到无色液体1.0g，产率96％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.84(t,J＝7.9Hz,1H),6.69(d,J＝8.0Hz,1H),6.26(d,J＝7.8Hz,1H),3.26(t,J＝8.3Hz,2H),2.87(t,J＝8.3Hz,2H),2.65(s,3H).
中间体7合成
取N-甲基-4-溴二氢吲哚450mg于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃15mL，置于-78℃体系中搅拌。加入1.37mL 1.7M异丁基锂的庚烷溶液搅拌30min后，再加入103μL的二氯二甲基硅烷，升至室温搅拌过夜。饱和氯化铵溶液淬灭，加入50mL水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝20:1(体积比)。得到无色液体220mg，产率42％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.08(t,J＝7.6Hz,2H),6.83(dd,J＝7.4,0.8Hz,2H),6.52(d,J＝7.7Hz,2H),3.16(t,J＝8.2Hz,4H),2.72(s,6H),2.68(t,J＝8.2Hz,4H),0.53(s,6H).
中间体8的合成
双(4-N-甲基吲哚啉)二甲基硅烷217mg溶于干燥5mL N,N-二甲基甲酰胺中，分批少量的加入N-溴琥珀酰亚胺，共239mg。室温搅拌三个小时，减压除去溶剂后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂后，得到粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1(体积比)，减压除去溶剂得到白色固体158mg，产率49％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.19(d,J＝8.3Hz,2H),6.32(d,J＝8.3Hz,2H),3.21(t,J＝8.2Hz,4H),2.89(t,J＝8.2Hz,4H),2.70(s,9H),0.75(s,3H).
中间体9的合成
121mg的中间体8于史莱克瓶中，氮气保护下加入10mL四氢呋喃溶液，使体系温度降至零下15℃，搅拌条件下加入1.7M异丁基锂的庚烷溶液0.33mL，搅拌半个小时后。加入二甲胺基甲酰氯26μL，升至室温搅拌过夜。饱和氯化铵水溶液淬灭，加水稀释，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥。减压除去溶剂得到粗产品，粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝300:1(体积比)，得到黄色固体26mg，产率30％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.40(d,J＝8.6Hz,2H),6.58(d,J＝8.6Hz,2H),3.52(t,J＝8.4Hz,4H),3.12(t,J＝8.4Hz,4H),2.86(s,6H),0.52(s,6H).
目标荧光分子SiR-2的合成
2-溴苯甲酸叔丁酯93mg于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入0.21mL 1.7M异丁基锂的庚烷溶液，搅拌30min后。加入中间体9(18mg)溶于四氢呋喃溶液注入反应体系，升至室温搅拌避光过夜。饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝30:1(体积比)，减压除去有机溶剂后得到无色固体11mg，产率47％。
实施例2中制备的荧光染料SiR-2的核磁氢谱如图4所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.92(d,J＝7.6Hz,1H),7.60(td,J＝7.5,1.1Hz,1H),7.49(td,1H),7.24(d,1H),6.71(d,J＝8.5Hz,2H),6.31(d,J＝8.5Hz,2H),3.42(dd,J＝15.5,8.3Hz,2H),3.32(dd,J＝17.0,8.6Hz,2H),3.12(dd,4H),2.71(s,6H),0.65(s,J＝16.3Hz,6H).
实施例2中得到的目标染料SiR-2的高分辨质谱如图5所示，具体数据为：高分辨质谱理论值C28H29N2O2Si[M+H]+453.1998,实测值453.1996.
经检测，其结构如上式SiR-2所示，其光性能如下：
硅基取代罗丹明类染料分子SiR-2在乙醇中的吸收与发射光谱测试。将实施例2中所得到的染料分子SiR-2分别溶解于DMSO溶液中，配制成不同染料的2mM母液，取20μL母液于4mL甲醇中，配成终浓度10μM的测试液，测试其吸收与荧光光谱。
SiR-2在乙醇中的吸收与发射归一化谱图分别如图6所示：图6为实施例2中得到的染料分子SiR-2在甲醇中的吸收和荧光归一化图，其吸收为649nm，发射波长在659nm，经计算得量子产率高达0.4。
实施例3
目标荧光染料SiR-3的合成
中间体10的合成
N-甲基-4-溴吲哚啉270mg溶于5mL DMF中，加入三氯氧磷140μL，升温至80-100℃搅拌，冷却后调节酸碱性至弱碱性，二氯甲烷萃取，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后，加入10mL甲醇，缓慢加入硼氢化钠共40mg，室温搅拌1-4h。减压除去甲醇后，加水淬灭，二氯甲烷萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂得到粗产品白色固体247mg，产率80％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.10(d,J＝7.9Hz,1H),6.33(d,J＝7.9Hz,1H),4.63(s,2H),3.38(t,J＝8.3Hz,2H),2.98(t,J＝8.3Hz,2H),2.75(s,3H),1.87(s,1H).
中间体12的合成
100mg N-甲基-4-溴-5-羟甲基吲哚啉和99mg N-甲基-6-溴吲哚啉溶于10mL二氯甲烷中，加入120μL三氟化硼乙醚，室温搅拌24h。减压除去二氯甲烷，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂得粗产品，经过硅胶柱(200-300目)，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝50-20:1(体积比)，分离得粘稠状无色液体183mg，产率89％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.66–6.61(m,2H),6.58(s,1H),6.22(d,J＝7.9Hz,1H),3.90(s,2H),3.28(dd,J＝15.1,6.8Hz,2H),3.20(td,J＝8.2,2.1Hz,2H),2.91(t,J＝8.2Hz,2H),2.74(td,J＝8.1,2.5Hz,2H),2.65(s,J＝0.8Hz,6H).
中间体13的合成
51mg的双(N-甲基-4-溴吲哚啉-N’-甲基-6’-溴吲哚啉)甲烷于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，置于零下78℃，加入110μL的1.7M的异丁基锂庚烷溶液，搅拌30min后，加入16μL的二氯二甲基硅烷。室温搅拌过夜，氯化铵水溶液淬灭，加水稀释，乙酸乙酯萃取，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后溶于10mL丙酮中，在零度条件下，缓慢加入40mg高锰酸钾，保持此温度搅拌2h，过滤，滤液减压除去溶剂后得粗产品，经过硅胶柱(200-300目)分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝600-200:1(体积比)，得到黄色固体7mg，产率18％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(d,J＝8.6Hz,1H),8.21(s,1H),6.57(d,J＝8.6Hz,1H),6.49(s,1H),3.50(t,4H),3.11(t,J＝8.4Hz,2H),3.05(t,J＝8.3Hz,2H),2.90(s,3H),2.86(s,3H),0.48(s,2H).
目标染料SiR-3的合成
2-溴苯甲酸叔丁酯36mg于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入80μL 1.7M异丁基锂的庚烷溶液，搅拌30min后。加入中间体13硅酮7mg溶于四氢呋喃溶液注入反应体系，升至室温搅拌避光过夜。饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝30:1(体积比)，减压除去有机溶剂后得到无色固体2mg，产率24％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(d,J＝7.7Hz,1H),7.52(t,J＝7.5Hz,1H),7.43(t,2H),7.16(d,J＝7.7Hz,1H),6.64(d,J＝8.5Hz,1H),6.59(s,1H),6.57(s,2H),6.23(d,J＝8.5Hz,1H),3.65(t,J＝7.0Hz,5H),3.20(t,J＝8.2Hz,2H),3.04(t,J＝8.2Hz,2H),2.73(s,4H),2.64(s,3H),0.57(s,J＝3.1Hz,3H),0.53(s,3H).
实施例3中得到的目标染料SiR-3的高分辨质谱如图7所示，具体数据为：高分辨质谱理论值C28H29N2O2Si[M+H]+453.1998,实测值453.2050.
经检测，其结构如上式SiR-3所示，其光性能如下：
硅基取代罗丹明类染料分子SiR-3在乙醇中的吸收与发射光谱测试。将实施例3中所得到的染料分子SiR-3分别溶解于DMSO溶液中，配制成不同染料的2mM母液，取20μL母液于4mL甲醇中，配成终浓度10μM的测试液，测试其吸收与荧光光谱。
SiR-3在乙醇中的吸收与发射归一化谱图分别如图8所示：图8为实施例3中得到的染料分子SiR-3在甲醇中的吸收和荧光归一化图，其吸收为662nm，发射波长在684nm，经计算得量子产率为0.36。
实施例4
目标荧光染料SiR-4的合成
中间体14的合成
称取381mg氢化钠的70％油状分散物品于史莱克瓶中，在氮气保护、冰浴条件下，依次加入4-溴吲哚啉1.0g溶于四氢呋喃溶液，溴丁烷1.38g，升温至室温搅拌过夜。用水淬灭后，乙酸乙酯萃取，收集有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为纯石油醚，得到无色液体1.23g，产率96％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.84(t,J＝7.9Hz,1H),6.69(d,J＝8.0Hz,1H),6.26(d,J＝7.8Hz,1H),3.61(t,J＝8.3Hz,2H),3.38(t,J＝8.3Hz,2H),3.01(t,J＝8.3Hz,2H),2.65(s,3H),1.3-1.5(m,J＝8.2Hz,4H),0.93(s,3H).
中间体15合成
取N-甲基-4-溴二氢吲哚450mg于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃15mL，置于-78℃体系中搅拌。加入1.26mL 1.7M异丁基锂的庚烷溶液搅拌30min后，再加入74μL的二氯二甲基硅烷，升至室温搅拌过夜。饱和氯化铵溶液淬灭，加入50mL水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝20:1(体积比)。得到无色液体274mg，产率38％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.08(t,J＝7.6Hz,2H),6.83(dd,J＝7.4,0.8Hz,2H),6.52(d,J＝7.7Hz,2H),3.16(t,J＝8.2Hz,4H),3.01(t,J＝8.3Hz,4H),2.89(t,J＝7.8Hz,4H),1.3-1.6(m,J＝8.2Hz,8H),0.93(s,6H),0.53(s,6H).
中间体16的合成
双(4-N-甲基吲哚啉)二甲基硅烷217mg溶于干燥5mL N,N-二甲基甲酰胺中，分批少量的加入N-溴琥珀酰亚胺，共239mg。室温搅拌三个小时，减压除去溶剂后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂后，得到粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝10:1(体积比)，减压除去溶剂得到白色固体158mg，产率49％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.19(d,J＝8.3Hz,2H),6.32(d,J＝8.3Hz,2H),3.21(t,J＝8.2Hz,4H),3.01(t,J＝8.3Hz,4H),2.89(t,J＝8.2Hz,4H),1.3-1.6(m,J＝8.2Hz,8H),0.75(s,6H),0.49(s,6H)
中间体17的合成
120mg的中间体16于史莱克瓶中，氮气保护下加入10mL四氢呋喃溶液，使体系温度降至零下15℃，搅拌条件下加入1.7M异丁基锂的庚烷溶液0.14mL，搅拌半个小时后。加入二甲胺基甲酰氯20μL，升至室温搅拌过夜。饱和氯化铵水溶液淬灭，加水稀释，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥。减压除去溶剂得到粗产品，粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝400:1(体积比)，得到黄色固体38mg，产率41％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.40(d,J＝8.6Hz,2H),6.58(d,J＝8.6Hz,2H),3.52(t,J＝8.4Hz,4H),3.35(t,J＝8.2Hz,4H),3.12(t,J＝8.4Hz,4H),1.2-1.5(m,J＝8.2Hz,8H),0.87(s,6H),0.52(s,6H).
目标荧光分子SiR-4的合成
2-溴苯甲酸叔丁酯115mg于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入0.26mL 1.7M异丁基锂的庚烷溶液，搅拌30min后。加入中间体9(22mg)溶于四氢呋喃溶液注入反应体系，升至室温搅拌避光过夜。饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝30:1(体积比)，减压除去有机溶剂后得到无色固体13mg，产率49％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.92(d,J＝7.6Hz,1H),7.60(td,J＝7.5,1.1Hz,1H),7.49(td,1H),7.24(d,1H),6.71(d,J＝8.5Hz,2H),6.31(d,J＝8.5Hz,2H),3.42(dd,J＝15.5,8.3Hz,2H),3.32(dd,J＝17.0,8.6Hz,2H),3.12(dd,4H),2.71(t,J＝8.5Hz,4H),1.2-1.6c(m,J＝8.2Hz,8H),1.06(s,6H).0.65(s,J＝16.3Hz,6H).
经检测，其结构如上式SiR-4所示，其光性能如下：
SiR-4在甲醇中的吸收和荧波长分别为：吸收波长为660nm，发射波长为681nm，经计算得量子产率为0.31。
实施例5
SiR-1对活细胞染色后荧光共聚焦成像测试。将实施例1中所得到的染料分子SiR-1溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，取0.5μL染料母液加入HeLa细胞培养皿中，染料终浓度为1μM。孵育5min后进行共聚焦成像。激发波长为640nm。
SiR-1对活细胞染色5min后荧光共聚焦成像如图9所示：染料SiR-1直接于细胞的成像图，可以清晰的看到细胞的线粒体，能够进行细胞中线粒体的染色。
Claims (11)
1.一类640nm激发的近红外荧光染料，其特征在于该近红外荧光染料通过五元、六元环的位置改变，使其分子构象改变，实现了光谱的红移，最大红移45nm，该荧光染料具有如下两种结构形式：
其中：n＝0或1；
R为H、
m＝0，1，2或3。
2.一种如权利要求1所述640nm激发的荧光染料的制备方法，其特征在于第一种对称形式按照以下步骤合成：
(1)中间体1的合成
4-溴吲哚(5-溴喹啉)溶于乙酸中，在冰浴条件下，分批少量的加入还原性试剂，升至室温搅拌4-8h后，停止反应；减压除去大部分的乙酸后，调节pH到弱碱性后，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，除去有机溶剂得到中间体1；
其中，4-溴吲哚或5-溴喹啉与还原试剂的质量比为1：0.5-1，4-溴吲哚或5-溴喹啉与冰醋酸的质量与体积比为1：10-15g/mL；
(2)中间体2的合成
称取强拔氢性试剂于史莱克瓶中，在氮气保护、冰浴条件下，依次加入中间体1的四氢呋喃溶液，卤代物，升温至室温搅拌过夜；用水淬灭后，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品，经200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为纯石油醚，得到中间体2；
其中，中间体1与拔氢性试剂、卤代物的质量比为1：0.3-0.5：1-2，中间体1的质量与四氢呋喃的体积比为1-10-20g/mL；
(3)中间体3的合成
取中间体2于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃，置于-78℃体系中搅拌；加入丁基锂溶液搅拌20-40min后，再加入二氯二甲基硅烷，升至室温搅拌过夜；饱和氯化铵溶液淬灭，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去溶剂得粗产品，经200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为体积比40-10:1的石油醚和乙酸乙酯，得到中间体3；
其中，中间体2的质量与丁基锂的体积比为1:2-3g/mL,丁基锂溶液与二氯二甲基硅烷、四氢呋喃的体积比为1:0.1-0.2:10-15；
(4)中间体4的合成
中间体3溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，分批少量的加入N-溴琥珀酰亚胺；室温搅拌1-4h，减压除去溶剂后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去溶剂后，得到粗产品，经200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为体积比为30-10:1石油醚的乙酸乙酯，得到中间体4；
其中，中间体3与N-溴琥珀酰亚胺的质量比为1：1-2，中间体3的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为30-50:1mg/mL；
(5)中间体5的合成
中间体4于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，使体系温度降至-15℃至-10℃，搅拌条件下丁基锂溶液，搅拌20-40min；加入二甲胺基甲酰氯，升至室温搅拌过夜；饱和氯化铵水溶液淬灭，加水稀释，乙酸乙酯萃取，洗涤干燥；减压除去溶剂得到粗产品，经200-300目的硅胶柱分离，洗脱剂为体积比为600-300：1的二氯甲烷和甲醇，得到中间体5；
其中，丁基锂溶液与二甲胺基甲酰氯、四氢呋喃的体积比为10-20：1:200-400，中间体4的质量与丁基锂溶液的体积比为1:2-4g/mL；
(6)目标荧光分子合成
2-溴苯甲酸叔丁酯于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入丁基锂溶液，搅拌20-40min后；加入中间体5的四氢呋喃溶液，升至室温搅拌避光过夜；饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品，经200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为体积比50-20:1的石油醚和乙酸乙酯，得到目标荧光染料分子；
其中，中间体5与2-溴苯甲酸叔丁酯的质量比为1:4-8，中间体5的质量与丁基锂溶液的体积比为10-20：1mg/mL。
3.根据权利要求1所述640nm激发的荧光染料的制备方法，其特征在于第二种对称形式按照以下步骤合成：
(1)中间体1的合成
4-溴吲哚(5-溴喹啉)溶于乙酸中，在冰浴条件下，分批少量的加入还原性试剂，升至室温搅拌4-8h后，停止反应；减压除去大部分的乙酸后，调节pH到弱碱性后，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，除去有机溶剂得到中间体1；
其中，4-溴吲哚或5-溴喹啉与还原试剂的质量比为1：0.5-1，4-溴吲哚或5-溴喹啉的质量与冰醋酸的体积比为1：10-15g/mL；
(2)中间体2的合成
称取强拔氢性试剂于史莱克瓶中，在氮气保护、冰浴条件下，依次加入中间体1的四氢呋喃溶液，卤代物，升温至室温搅拌过夜；用水淬灭后，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品，经200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为纯石油醚，得到中间体2；
其中，中间体1与拔氢性试剂、卤代物的质量比为1：0.3-0.5：1-2，中间体1的质量与四氢呋喃的体积比为1-10-20g/mL；
(3)中间体7的合成
中间体2溶于DMF中，加入三氯氧磷，升温至80-100℃搅拌，冷却后调节酸碱性至弱碱性，二氯甲烷萃取，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后，加入甲醇，缓慢加入硼氢化钠，室温搅拌1-4h；减压除去甲醇后，加水淬灭，二氯甲烷萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂得到粗产品，经200-300目硅胶柱分离，脱洗剂为体积比20-5:1的石油醚和乙酸乙酯，得白色固体；
其中，中间体2与硼氢化钠的质量比为50-80:1，三氯氧磷与DMF、甲醇的体积比为1:30-50:5-15，中间体2的质量与DMF的体积比为1:15-30g/mL；
(4)中间体8的合成
中间体2和中间体7溶于二氯甲烷中，加入三氟化硼乙醚，室温搅拌24-36h，减压除去二氯甲烷后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂得粗产品，经200-300目硅胶柱分离，脱洗剂为体积比50-20:1的石油醚和乙酸乙酯，得到白色固体；
其中，中间体2与中间体7的质量比为1:1-1.5，中间体2的质量与三氟化硼乙醚的体积比为1:1-2mg/μL；
(5)中间体9的合成
取中间体8与史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，置于温度-15℃至-10℃的冰盐浴中，加入丁基锂试剂，搅拌20-40min，氮气保护下加入二氯二甲基硅烷，室温搅拌过夜；氯化铵水溶液淬灭，加水稀释，乙酸乙酯萃取，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后，加入丙酮，零度下缓慢分批加入高锰酸钾，保持此温度搅拌1-3h；过滤，滤液减压除去有机溶剂得粗产品，经200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为体积比600-200:1的二氯甲烷和甲醇，得到黄色固体；
其中，中间体8与高锰酸钾的质量比为1:0.5-2，丁基锂溶液与二氯二甲基硅烷、四氢呋喃、丙酮的体积比为5-10:1：300-500:500-1000，中间体8的质量与丁基锂溶液的体积比为1:2-3mg/μL；
(6)目标荧光染料的合成
2-溴苯甲酸叔丁酯于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入丁基锂溶液，搅拌20-40min后；加入中间体9的四氢呋喃溶液，升至室温搅拌避光过夜；饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品；粗产品经过柱层析分离，洗脱剂为体积比为50-20:1的石油醚和乙酸乙酯，减压除去有机溶剂后得到目标荧光染料分子；
其中，中间体9与2-溴苯甲酸叔丁酯的质量比为1:4-7，丁基锂溶液与四氢呋喃的体积比为1：30-50，中间体9的质量与丁基锂的体积比为1:10-20mg/μL。
4.根据权利要求2或3所述640nm激发的荧光染料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，还原试剂为氰基硼氢化钠、硼氢化钠；干燥试剂为无水硫酸钠或者无水硫酸钾。
5.根据权利要求2或3所述640nm激发的荧光染料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，强的拔氢试剂为NaH、KH；卤代物可以为RI，RBr，RCl，其中R可为H，低碳烷烃。
6.根据权利要求2所述640nm激发的荧光染料的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，丁基锂溶液为正丁基锂的不同浓度的己烷溶液，或者异丁基锂的不同浓度的庚烷溶液。
7.根据权利要求2所述640nm激发的荧光染料的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，丁基锂溶液为正丁基锂的不同浓度的己烷溶液，或者异丁基锂的不同浓度的庚烷溶液。
8.根据权利要求2所述640nm激发的荧光染料的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，丁基锂溶液为正丁基锂的不同浓度的己烷溶液，或者异丁基锂的不同浓度的庚烷溶液。
9.根据权利要求3所述640nm激发的荧光染料的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，丁基锂溶液为正丁基锂的不同浓度的己烷溶液，或者异丁基锂的不同浓度的庚烷溶液。
10.根据权利要求3所述640nm激发的荧光染料的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，丁基锂溶液为正丁基锂的不同浓度的己烷溶液，或者异丁基锂的不同浓度的庚烷溶液。
11.一种如权利要求1所述640nm激发的荧光染料的应用，其特征在于所述荧光染料具有较高的光稳定性，荧光发射波长在近红外区域，较高的荧光量子产率，可控的光开关性能，应用于更加复杂的发光材料、生物探针及超分辨成像领域中。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN111334066B (zh) | 2021-12-10 |
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