CN112851650B - 一种超快速检测生物硫醇荧光探针的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及光学成像领域，具体涉及一种超快速检测生物硫醇荧光探针的制备方法及其应用。本发明载2，6‑双(羟甲基)‑对甲酚和4‑(二乙氨基)水杨醛的基础上经过一系列的化学反应，最终合成了一种粉红色固体探针，即[2‑(7‑二乙胺基香豆素)亚甲基‑7‑甲基‑1‑氧‑3，3a‑二氢环戊[b]色满环‑5‑基]‑甲基‑N，N‑二甲基‑4(1H)‑吡啶亚基碳酸酯。该荧光探针的合成路线简单，原料易得，成本较低，反应时间特别短，可以极快的速度实现某些小分子生物硫醇的检测，具有极强的灵敏性和选择性；此外，它还可以靶向定位于线粒体，从而实现特定位置的快速成像。

Description

一种超快速检测生物硫醇荧光探针的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及光学成像领域，具体涉及一种超快速检测生物硫醇荧光探针的制备方法及其应用。
背景技术
生物硫醇种类繁多，某些小分子生物硫醇包括半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽等，它们在许多生理过程中有着至关重要的作用，当其在细胞内含量发生异常时，常会诱发多种疾病。Cys是人体的条件必需氨基酸和生糖氨基酸，可由体内的蛋氨酸(甲硫氨酸，人体必需氨基酸)转化而来，可与胱氨酸互相转化；此外，Cys也是谷胱甘肽、乙酰辅酶和牛磺酸的前体，同时它也可以作为生物体硫铁络合物中硫配体的提供者。当体内它的含量发生异常时会出现生长缓慢，毛发色素脱色，水肿，嗜睡，肝功能损伤，肌肉松弛和肥胖，皮肤松弛，身体虚弱等症状。Hcy是一种含巯基的氨基酸，主要来源于饮食摄取的蛋氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中一个重要的中间产物。研究表明，同型半胱氨酸水平过高即所谓的高半胱氨酸血症，会导致人体产生认知功能障碍，严重的会导致产生阿尔茨海默氏病，精神分裂症等；此外，高半胱氨酸较高的人也较容易患上血栓症及心血管疾病。谷胱甘肽是哺乳动物细胞中抗氧化胁迫最重要的低分子硫醇，也是细胞内含量最多的小分子生物硫醇(1-10mM)。研究发现，还原型谷胱甘肽(GSH)在细胞的生长，和维持细胞正常功能的氧化还原平衡上起着关键的作用。当其在体内含量发生异常时，会与癌症、阿尔茨海默氏症和心血管等疾病密切相关。因此，使得生物和环境样品中小分子生物硫醇的检测引起了更多的关注，从而导致生物硫醇荧光探针和比色传感器的研究得到快速发展，但是由于生物体内生物硫醇浓度的实时变化，因而需要超快速荧光探针进行检测。
通过相关文献报道及前期实验研究发现，以色烯为母核形成的衍生物骨架结构具有良好小分子生物硫醇的检测位点。因此，以此骨架结构为识别主体开发一种新型的超快速识别小分子生物硫醇的荧光探针具有重要的意义。
发明内容
针对上述问题本发明提供了一种新型用于识别生物硫醇且可以靶向定位于线粒体的荧光探针。该探针的反应时间特别短，可以以极快的速度实现某些小分子生物硫醇的检测，具有极强的灵敏性；此外，它还可以靶向定位于线粒体，从而实现特定位置的快速成像。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
本发明提供一种用于超快速检测生物硫醇的荧光探针，为[2-(7-二乙胺基香豆素)亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-基]-甲基-N，N-二甲基-4(1H)-吡啶亚基碳酸酯，其结构式为：
Figure BDA0002876969130000021
本发明提供一种用于超快速检测生物硫醇的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，3-羟甲基-5-甲基水杨醛的合成：将2，6-双(羟甲基)-对甲酚和MnO2加入丙酮中，室温下搅拌过夜，过滤，滤液浓缩所得残余物，经柱色谱分离，得到白色固体，即3-羟甲基-5-甲基水杨醛。
步骤2，7-(二乙氨基)香豆素的合成：将4-(二乙氨基)水杨醛、丙二酸二乙酯溶于无水乙醇中，搅拌并加入哌啶，75～100℃进行回流反应6～10h，反应结束后旋去有机溶剂，继续加入浓盐酸、冰醋酸，100～120℃进一步回流反应6～10h，冷却至室温，倒入冰水中，并加10mmol/L的氢氧化钠调至pH 5，搅拌20～30min后抽滤、水洗，经真空干燥得土黄色固体，即7-(二乙氨基)香豆素。
步骤3，7-(二乙氨基)香豆素-3-醛的合成：将三氯氧磷在冰水浴条件下逐滴加入到N,N-二甲基甲酰胺中，惰性气体氛围下搅拌20～30min形成混合液，将混合液加入溶有7-(二乙氨基)香豆素的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，55～80℃搅拌10～14h，冷却至室温，倒入冰水中，加入5mmol/L氢氧化钠调至pH 6，搅拌20～30min后抽滤、水洗并真空干燥得到粗产物，利用无水乙醇重结晶得到橘黄色晶体，即7-(二乙氨基)香豆素-3-醛。
步骤4，5-(羟甲基)-7-甲基-3,3a-二氢环戊[b]色满环-1(2H)-酮的合成：将3-羟甲基-5-甲基水杨醛，环戊-2-烯-1-酮和1-H-咪唑溶于四氢呋喃和蒸馏水混合溶液中形成混合物，将混合物在室温搅拌90～108h，用1mol/L的HCl溶液稀释，用乙酸乙酯萃取三次，滤液浓缩所得残余物，通过硅胶柱层析分离，获得5-(羟甲基)-7-甲基-3,3a-二氢环戊[b]色满环-1(2H)-酮。
步骤5，2-(7-二乙氨基香豆素)亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-苄醇的合成：将5-(羟甲基)-7-甲基-3,3a-二氢环戊[b]色满环-1(2H)-酮，7-(二乙氨基)香豆素-3-醛加入无水乙醇中搅拌溶解，逐滴加入哌啶，之后于封管中，55～65℃加热搅拌2.8～3.2h，旋去有机溶剂得粗产物，即2-(7-二乙氨基香豆素)亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-苄醇。
步骤6，2-(7-二乙胺基香豆素)亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-甲氧基甲酰氯的合成：将2-(7-二乙氨基香豆素)亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-苄醇溶解在3mL二氯甲烷中，在0℃条件下加入三光气，并逐滴加入三乙胺，在惰性气体氛围下搅拌10～30min后移至室温，继续搅拌3～3.5h，TLC点板监测反应至原料反应完，旋去有机溶剂，通过硅胶柱层析分离，得到化合物2-(7-二乙胺基香豆素)亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-甲氧基甲酰氯。
步骤7，探针的合成：将2-(7-二乙胺基香豆素)亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-甲氧基甲酰氯溶解于二氯甲烷，依次加入4-二甲氨基吡啶、三乙胺形成混合液，将混合液于10℃～30℃搅拌6h～12h，旋去有机溶剂，用乙醚洗去杂质，通过硅胶柱层析得到所需探针，即[2-(7-二乙胺基香豆素)亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-基]-甲基-N，N-二甲基-4(1H)-吡啶亚基碳酸酯。
进一步，所述步骤1中2，6-双(羟甲基)-对甲酚和MnO2用量的摩尔比为1：7.5～8，柱色谱分离为石油醚：乙酸乙酯＝2：1。
所述步骤2中4-(二乙氨基)水杨醛、丙二酸二乙酯与哌啶的摩尔比为1：1.8～2.2：1.0～1.2，4-(二乙氨基)水杨醛与无水乙醇的摩尔/体积为1：3，无水乙醇与浓盐酸、冰醋酸的体积比为1：1：1。
所述步骤3中7-(二乙氨基)香豆素、三氯氧磷与N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基甲酰胺的摩尔/摩尔/体积/体积为1：4.5～5：0.25：1.5，所述惰性气体为氩气。
所述步骤4中3-羟甲基-5-甲基水杨醛、环戊-2-烯-1-酮和1-H-咪唑的摩尔比为1：1.8～2.2：1.2～1.6，3-羟甲基-5-甲基水杨醛与四氢呋喃和蒸馏水混合溶液、HCl溶液的摩尔/体积/体积为1：3：6，所述硅胶柱层析分离为石油醚：乙酸乙酯＝1：2。
所述步骤5中5-(羟甲基)-7-甲基-3,3a-二氢环戊[b]色满环-1(2H)-酮、7-(二乙氨基)香豆素-3-醛、哌啶和无水乙醇的摩尔/摩尔/摩尔/体积为1：1.0～1.5：1.8～2.2：3。
所述步骤6中2-(7-二乙氨基香豆素)亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-苄醇与三光气、三乙胺的摩尔比为1：1.8～2.2：1.8～2.2，所述惰性气体为氩气，硅胶柱层析分离为石油醚/乙酸乙酯/二氯甲烷＝4：1：1，
所述步骤7中2-(7-二乙胺基香豆素)亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-甲氧基甲酰氯、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的摩尔比为1：7.26～10：1.2～3，2-(7-二乙胺基香豆素)亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-甲氧基甲酰氯与二氯甲烷的摩尔/体积为1：2～4。
本发明提供一种荧光探针应用于某些小分子生物硫醇Cys、Hcy的超快速检测及成像。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
本路线实现了新型荧光探针
1.本发明提供了一种荧光探针的简易合成路线，合成本探针的原料易得，成本较低。
2.本发明的荧光探针可用于超快速检测某些小分子生物硫醇，具有较好的选择性及其灵敏性，此外，它还可以靶向定位于线粒体，从而实现特定位置的快速成像。
3.本发明探针具有良好的水溶性，且将常用检测小分子生物硫醇的香豆素的发射波长延长至578nm。
附图说明
图1是本发明探针的核磁共振的氢谱图
图2是本发明探针的核磁共振的碳谱图
图3是本发明荧光探针检测不同浓度Cys的荧光光谱图；
图4是本发明探针及其加入部分生理浓度小分子硫醇的动力学分析曲线图；
图5是本发明探针在加入小分子生物硫醇以及不同氨基酸作用后的荧光光谱图。
图6是本发明探针在加入小分子生物硫醇以及不同干扰离子作用后的荧光光谱图。
图7是本发明探针在活细胞的生物发光成像。
具体实施方式
实施例1
本发明荧光探针的具体合成过程
(1)化合物4的具体合成步骤如下：
Figure BDA0002876969130000061
将2，6-双(羟甲基)-对甲酚(5g，29mmol)和MnO2(20g，229mmol)在400mL丙酮中的混合物在室温下搅拌过夜，过滤，滤液浓缩所得残余物。经柱色谱分离(PE：EA＝2：1)，得到化合物6(53％)，为白色固体，即3-羟甲基-5-甲基水杨醛。
Figure BDA0002876969130000071
将化合物6(278mg，1.67mmol)，环戊-2-烯-1-酮(化合物7)(0.280mL，3.35mmol)和1-H-咪唑(120mg，1.67mmol)溶于四氢呋喃(THF，2.5mL)与蒸馏水(2.5mL)。将混合物在室温搅拌96h，最终混合物用10mL HCl溶液(1mol/L)稀释，乙酸乙酯(3×15.27mL)萃取。滤液浓缩所得残余物，通过硅胶柱层析分离(PE：EA＝1：2)，以50％的产率获得化合物4(193mg)，即5-(羟甲基)-7-甲基-3,3a-二氢环戊[b]色满环-1(2H)-酮。
(2)化合物5的具体合成步骤如下：
Figure BDA0002876969130000072
将4-(二乙氨基)水杨醛(1.93g，10mmol)，丙二酸二乙酯(3.04mL，20mmol)溶于30mL无水乙醇中，搅拌加入1mL哌啶，80℃回流6h。旋去有机溶剂，加入浓盐酸、冰醋酸各20mL并在110℃回流6h，冷却至室温，倒入100mL冰水中，并加氢氧化钠(40％)调至pH 5，有浅色沉淀析出，搅拌30min后抽滤、水洗，经真空干燥得化合物8(产率85.3％)，为土黄色固体，即7-(二乙氨基)香豆素。
Figure BDA0002876969130000081
取5.3mL三氯氧磷在冰水浴条件下逐滴加入到3.5mL N,N-二甲基甲酰胺中，氩气氛围下搅拌30min，将混合液加入溶于17.7mL N,N-二甲基甲酰胺的化合物8(2.65g，12.21mmol)溶液中，60℃搅拌12h，冷却至室温，倒入177mL冰水中，加入氢氧化钠(5mM)调至pH 6，，搅拌20min后抽滤、水洗并真空干燥得到粗产物，利用无水乙醇重结晶得到化合物5(产率47％)，为橘黄色晶体，即7-(二乙氨基)香豆素-3-醛。
(3)化合物2的具体合成步骤如下：
Figure BDA0002876969130000082
将化合物4(200mg，0.87mmol)，化合物5(255.6mg，1.04mmol)在2.87mL无水乙醇中搅拌溶解，逐滴加入159μL哌啶，之后于封管中60℃加热搅拌3h，旋去有机溶剂得粗产物化合物3，即2-(7-二乙氨基香豆素)亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-苄醇。
Figure BDA0002876969130000083
将化合物3(0.87mmol)溶解在3mL二氯甲烷中，在0℃条件下加入三光气(561.1mg，1.74mmol)，并逐滴加入三乙胺(118.6μL，1.74mmol)，在氩气氛围下搅拌10min后移至室温，继续搅拌3h。TLC点板监测反应至原料反应完，旋去有机溶剂，通过硅胶柱层析分离(石油醚/乙酸乙酯/二氯甲烷＝4：1：1)，以32％的产率得到化合物2，即2-(7-二乙胺基香豆素)亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-甲氧基甲酰氯。
(4)探针的具体合成步骤如下：
Figure BDA0002876969130000091
在氩气保护下，将化合物2(80mg，0.15mmol)溶解在0.6mL二氯甲烷，加入4-二甲氨基吡啶(183mg，1.5mmol)、三乙胺(12μL，0.18mmol)，将混合液于室温搅拌过夜。旋去有机溶剂，用无水乙醚洗去部分杂质得到粗产物，通过硅胶柱层析分离(二氯甲烷/甲醇＝20：1)得到粉红色固体探针10mg，即[2-(7-二乙胺基香豆素)亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-基]-甲基-N，N-二甲基-4(1H)-吡啶亚基碳酸酯。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.35(d,J＝7.4Hz,2H),8.25(s,1H),7.67(d,J＝9.0Hz,1H),7.53(t,J＝2.6Hz,1H),7.39(d,J＝2.4Hz,1H),7.34(d,J＝2.0Hz,1H),7.21(d,J＝2.1Hz,1H),7.05(d,J＝7.3Hz,2H),6.81(dd,J＝9.0,2.4Hz,1H),6.60(d,J＝2.3Hz,1H),5.37(s,2H),5.32(dt,J＝8.0,4.2Hz,1H),3.18(s,6H),2.25(s,3H),1.23(s,6H),1.15(t,J＝7.0Hz,6H)。13C NMR(151MHz,DMSO)δ189.3,162.8,161.5,156.8,156.3,152.3,151.1,144.0,142.6,136.1,134.8,133.1,131.9,131.7,131.6,130.1,128.0,127.3,123.5,123.2,114.1,110.3,108.9,108.3,96.8,74.5,55.3,44.82,36.3,34.8,31.8,27.0,22.6,20.5,14.4,12.9。
实施例2
本发明探针检测不同浓度Cys的荧光光谱图
在本发明的探针溶液(5μM，PBS，pH 7.4)中加入不同浓度的Cys(搅拌)后，测定其荧光强度变化。结果可参见图3，所有的荧光强度均进行了归一法。
如图3所示，本发明探针溶液在加入Cys前后的荧光发射光谱的变化(475nm激发，缝隙：5nm/5nm)。可以发现，在加入Cys后，本发明荧光探针显示出对Cys的荧光开启响应，其荧光发射范围为500nm至700nm，且主要是在578nm处出现了一个新的明显吸收峰，说明本发明探针可以与Cys发生反应，释放出荧光。
实施例3
本发明探针和部分小分子生物硫醇生理浓度下的动力学分析
如图4所示为本发明探针溶液中加入生理浓度的部分小分子生物硫醇后其荧光发射光谱在578nm处随时间的变化情况。在本发明探针溶液中分别加入200μM Cys、20μM Hcy、1mM GSH后，其荧光发射光谱随时间的变化分别在10s、20s、180s内基本完成，说明本发明探针对某些小分子生物硫醇具有很好的响应，尤其是对半胱氨酸和同型半胱氨酸具有超快速的识别能力；且在300s内纯的探针溶液中，本发明荧光探针的荧光强度基本保持不变，说明本发明探针具有很好的稳定性。
实施例4
本发明探针在加入不同氨基酸作用后的荧光光谱图
在本发明的荧光探针溶液(5μM，PBS，pH 7.4)中分别加入200μM亮氨酸(Leu)、苏氨酸(Thr)、甲硫氨酸(蛋氨酸)(Met)、脯氨酸(Pro)、天冬氨酸(Asp)、缬氨酸(Val)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、精氨酸(Arg)、异亮氨酸(Ile)、色氨酸(Trp)、赖氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、组氨酸(His)、丝氨酸(Ser)、谷氨酰胺(Gln)、半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)(搅拌)，5分钟后测试其荧光发射。
如图5所示，只有小分子生物硫醇Cys、Hcy与GSH能够引起显著的荧光增强现象，而其他氨基酸则变化不明显。说明本发明荧光探针对于某些小分子生物硫醇Cys、Hcy与GSH具有较高的选择性，且在反应前后荧光强度有明显的区别，因此，本发明探针在一定程度上能够特异性识别某些小分子生物硫醇，为之后的生物发光成像提供结构基础。
实施例5
本发明探针在加入不同离子后的荧光光谱图
在本发明的荧光探针溶液(5μM，PBS，pH 7.4)中分别加入1mM Mg2+，Ca2+，K+，Na+，Br-，SCN-，HCO3 -，CO3 2-，F-，Cl-，NO2-，NH4 +，SO4 2-，Fe2+，Fe3+，Al3+，Zn2+，H2O2，ClO-5分钟后测试其在加入Cys和不加入Cys时的荧光变化(图6中1是空白组，不外加任何离子，2-19依次代表1mM Mg2+，Ca2+，K+，Na+，Br-，SCN-，HCO3 -，CO3 2-，F-，Cl-，NO2-，NH4 +，SO4 2-，Fe2+，Fe3+，Al3+，Zn2+，H2O2，ClO-)。
如图6所示，上述各种离子的添加对探针的荧光强度影响不大，而在加入Cys后，加有各种离子的探针产生的变化较小，说明上述离子几乎不与探针反应，且对探针与Cys的响应干扰较小。
实施例6
本发明探针在活细胞的生物发光成像
如图7所示，在475nm的选择性激发下，本发明探针溶液(10μM，PBS，pH 7.4)在37℃下孵育15分钟的RAW 264.7细胞显示为橙色的荧光发射；当外加半胱氨酸(50μM)处理细胞15分钟后，其橙色通道中的细胞内荧光会出现增强。以上现象说明，本发明探针能特异性识别RAW 264.7细胞内的生物硫醇产生内源性的发光成像；当外加外源性的半胱氨酸，其会使细胞内生物硫醇含量升高，致使出现通道内荧光增强的现象。所以，本发明探针可特异性识别内源性和外源性的生物硫醇产生明显的生物发光成像。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，都包含在本发明的保护范围之内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种超快速检测生物硫醇的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针为［2-（7-二乙胺基香豆素）亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-基］-甲基-N，N-二甲基-4（1H）-吡啶亚基碳酸酯，其结构式为：
Figure 576840DEST_PATH_IMAGE001
。
2.一种权利要求1所述的超快速检测生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，3-羟甲基-5-甲基水杨醛的合成：将2，6-双（羟甲基）-对甲酚和MnO2加入丙酮中，室温下搅拌过夜，过滤，滤液浓缩所得残余物，经柱色谱分离，得到白色固体，即3-羟甲基-5-甲基水杨醛；
步骤2，7-(二乙氨基)香豆素的合成：将4-(二乙氨基)水杨醛、丙二酸二乙酯溶于无水乙醇中，搅拌并加入哌啶，75 ~ 100℃进行回流反应6 ~ 10 h，反应结束后旋去有机溶剂，继续加入浓盐酸、冰醋酸，100 ~ 120℃进一步回流反应6 ~ 10 h，冷却至室温，倒入冰水中，并加10 mmol/L的氢氧化钠调至pH=5，搅拌20~30 min后抽滤、水洗，经真空干燥得土黄色固体，即7-(二乙氨基)香豆素；
步骤3，7-(二乙氨基)香豆素-3-醛的合成：将三氯氧磷在冰水浴条件下逐滴加入到N,N-二甲基甲酰胺中，惰性气体氛围下搅拌20~30 min形成混合液，将混合液加入溶有7-(二乙氨基)香豆素的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，55 ~ 80℃搅拌10 ~ 14 h，冷却至室温，倒入冰水中，加入5 mmol/L氢氧化钠调至pH=6，搅拌20~30 min后抽滤、水洗并真空干燥得到粗产物，利用无水乙醇重结晶得到橘黄色晶体，即7-(二乙氨基)香豆素-3-醛；
步骤4，5-(羟甲基)-7-甲基-3, 3a-二氢环戊[b]色满环-1(2H)-酮的合成：将3-羟甲基-5-甲基水杨醛，环戊-2-烯-1-酮和1-H-咪唑溶于四氢呋喃和蒸馏水混合溶液中形成混合物，将混合物在室温搅拌90 ~ 108 h，用1 mol / L 的HCl溶液稀释，用乙酸乙酯萃取三次，滤液浓缩所得残余物，通过硅胶柱层析分离，获得5-(羟甲基)-7-甲基-3, 3a-二氢环戊[b]色满环-1(2H)-酮；
步骤5，2-（7-二乙氨基香豆素）亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-苄醇的合成：将5-(羟甲基)-7-甲基-3, 3a-二氢环戊[b]色满环-1(2H)-酮，7-(二乙氨基)香豆素-3-醛加入无水乙醇中搅拌溶解，逐滴加入哌啶，之后于封管中，55 ~ 65℃加热搅拌2.8 ~ 3.2 h，旋去有机溶剂得粗产物，即2-（7-二乙氨基香豆素）亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-苄醇；
步骤6，2-（7-二乙胺基香豆素）亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-甲氧基甲酰氯的合成：将2-（7-二乙氨基香豆素）亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-苄醇溶解在3 mL二氯甲烷中，在0℃条件下加入三光气，并逐滴加入三乙胺，在惰性气体氛围下搅拌10~30 min后移至室温，继续搅拌3 ~3.5h，TLC点板监测反应至原料反应完，旋去有机溶剂，通过硅胶柱层析分离，得到化合物2-（7-二乙胺基香豆素）亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-甲氧基甲酰氯；
步骤7，探针的合成：将2-（7-二乙胺基香豆素）亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-甲氧基甲酰氯溶解于二氯甲烷，依次加入4-二甲氨基吡啶、三乙胺形成混合液，将混合液于10℃ ~ 30℃搅拌6 h ~ 12 h，旋去有机溶剂，用乙醚洗去杂质，通过硅胶柱层析得到所需探针，即［2-（7-二乙胺基香豆素）亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-基］-甲基-N，N-二甲基-4（1H）-吡啶亚基碳酸酯。
3.根据权利要求2所述的一种超快速检测生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1中2，6-双（羟甲基）-对甲酚和MnO2用量的摩尔比为1：7.5 ~ 8，柱色谱分离为石油醚：乙酸乙酯＝2：1。
4.根据权利要求2所述的一种超快速检测生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2中4-(二乙氨基)水杨醛、丙二酸二乙酯与哌啶的摩尔比为1：1.8 ~ 2.2：1.0~ 1.2，4-(二乙氨基)水杨醛与无水乙醇的摩尔/体积为1：3，无水乙醇与浓盐酸、冰醋酸的体积比为1：1：1。
5.根据权利要求2所述的一种超快速检测生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤3中7-(二乙氨基)香豆素、三氯氧磷与用于溶解三氯氧磷的N,N-二甲基甲酰胺和用于溶解7-(二乙氨基)香豆素的N,N-二甲基甲酰胺的摩尔/摩尔/体积/体积为1：4.5 ~5：0.25：1.5，所述惰性气体为氩气。
6.根据权利要求2所述的一种超快速检测生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤4中3-羟甲基-5-甲基水杨醛、环戊-2-烯-1-酮和1-H-咪唑的摩尔比为1：1.8 ~2.2：1.2 ~ 1.6，3-羟甲基-5-甲基水杨醛与四氢呋喃和蒸馏水混合溶液、HCl溶液的摩尔/体积/体积为1：3：6，所述硅胶柱层析分离为石油醚：乙酸乙酯＝1：2。
7.根据权利要求2所述的一种超快速检测生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤5中5-(羟甲基)-7-甲基-3, 3a-二氢环戊[b]色满环-1(2H)-酮、7-(二乙氨基)香豆素-3-醛、哌啶和无水乙醇的摩尔/摩尔/摩尔/体积为1：1.0 ~ 1.5：1.8 ~ 2.2：3。
8.根据权利要求2所述的一种超快速检测生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤6中2-（7-二乙氨基香豆素）亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-苄醇与三光气、三乙胺的摩尔比为1：1.8 ~ 2.2：1.8 ~ 2.2，所述惰性气体为氩气，硅胶柱层析分离为石油醚/乙酸乙酯/二氯甲烷＝4：1：1。
9.根据权利要求2所述的一种超快速检测生物硫醇的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤7中2-（7-二乙胺基香豆素）亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-甲氧基甲酰氯、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的摩尔比为1：7.26 ~ 10：1.2 ~ 3，2-（7-二乙胺基香豆素）亚甲基-7-甲基-1-氧-3，3a-二氢环戊[b]色满环-5-甲氧基甲酰氯与二氯甲烷的摩尔/体积为1：2 ~ 4。
10.一种权利要求1所述的超快速检测生物硫醇的荧光探针的应用，其特征在于：用于制备小分子生物硫醇Cys、Hcy的超快速检测及成像的试剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116178355B (zh) * 2023-01-19 2024-06-11 昆明理工大学 一种检测硫醇的化学发光试剂、合成方法及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3386399A (en) * 1998-04-08 1999-10-25 Ewald A. Terpetschnig Luminescent compounds
US8981100B2 (en) * 2007-07-27 2015-03-17 Life Technologies Corporation Use of novel coumarins as glutathione and thiol labels
TWI354101B (en) * 2008-08-19 2011-12-11 Univ Nat Taipei Technology Fluorimetric indicator for biosensing and manufact
US8318953B2 (en) * 2010-06-23 2012-11-27 Aat Bioquest, Inc. Reactive coumarin derivatives and their use in cellular analyses
WO2013003815A2 (en) * 2011-06-29 2013-01-03 The Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of Portland State University Near-infrared fluorescent dyes with large stokes shifts
US10544167B2 (en) * 2015-08-26 2020-01-28 Jawaharlal Nehru Centre For Advanced Scientific Research Compounds as stimuli-responsive probes, methods and applications thereof
US11635436B2 (en) * 2017-04-24 2023-04-25 Georgetown University Compositions and methods for analyzing cysteine
CN107235946A (zh) * 2017-06-20 2017-10-10 济南大学 一种谷胱甘肽荧光探针及其制备方法和应用
CN108358906B (zh) * 2018-03-14 2021-04-02 中南大学 一种特异性区分不同硫醇的荧光探针
CN109134441A (zh) * 2018-10-11 2019-01-04 贺州学院 一种检测半胱氨酸的新型荧光探针及其制备方法和应用
CN111393430B (zh) * 2020-03-17 2021-05-14 山西大学 一种百部生物碱类似物近红外荧光探针及其制备方法
CN111978340A (zh) * 2020-09-03 2020-11-24 山西大学 一种同时检测生物硫醇及过氧化氢的探针和制备方法

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