CN114394977A - 一种用于分别和同时检测硫化氢和一氧化碳的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于分别和同时检测硫化氢和一氧化碳的荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针的结构式如下，具有检测限低(检测H2S和CO的检测限分别为9nM和15nM)，灵敏度高，选择性好的优势。荧光强度与Na2S(0‑40μM)浓度以及CORM‑3(0‑40μM)浓度之间具有良好的线性关系，说明探针适合于生物体内H2S和CO的定量检测；并进一步应用FP‑HSCO实现了HT‑22细胞内H2S和CO的分别和同时的荧光成像。
Figure DDA0003372777740000011

Description

一种用于分别和同时检测硫化氢和一氧化碳的荧光探针及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于荧光探针检测技术领域，具体涉及一种用于分别和同时检测硫化氢和一氧化碳的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
硫化氢(Hydrogen sulfide，H2S)是继一氧化氮和一氧化碳(Carbon monoxide，CO)之后，生物体中第三种内源性气体信号分子。生理水平的H2S参与多种生物学功能，包括神经传导、血管舒张、细胞凋亡、炎症、缺血/再灌注损伤和胰岛素分泌。H2S浓度异常与多种疾病密切相关，如阿尔茨海默病、帕金森病和糖尿病等。CO在生物系统中通过血红素加氧酶(HO-1)分解血红素而产生，是人体内重要的气体信号分子。CO具有抗炎、抗细胞凋亡、抗增殖、细胞保护、血管舒张和神经递质等多种生理功能。CO的异常产生和代谢参与了阿尔茨海默病、帕金森病、心脑血管疾病等多种疾病的发生与发展。研究表明，H2S和CO在多种组织和脏器中共存，两种气体信号分子之间存在着密切的联系。
目前已开发了许多用于检测H2S或用于检测CO的荧光探针，通过使用这些荧光探针，H2S或CO 生物学的研究已经取得了良好的进展。为了检测多种分析物，一种方法是在一个系统中使用多个荧光探针，但这种方法存在较多缺陷：(1)两种探针之间存在干扰；(2)各个探针的定位、代谢及光漂白率不同，会严重影响检测的准确性，不适合进行定量分析。而开发能够识别多种物质的单分子荧光探针可避免上述问题，其是指一个荧光探针可对多个物质产生不同的荧光信号，从而实现多种物质的分别和同时检测。这类探针的设计思路是将多个荧光基团和多个识别基团通过连接基团融合到一个分子中。
目前用于检测多种分析物的单个荧光探针也取得了一定的研究进展，如Lin报道了基于香豆素- 罗丹明结构的可分别识别H2O2、NO以及H2O2/NO的荧光探针FP-H2O2-NO，该探针能够在活细胞内同时检测H2O2和NO。因此，开发一种能够分别和同时检测H2S和CO的单分子荧光探针对于研究两种气体信号分子在疾病中的串联机制具有重要意义。目前，能分别和同时识别H2S和CO的荧光探针尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种基于荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)机理的能够分别和同时检测H2S和CO的荧光探针FP-HSCO，该探针具有检测限低，灵敏度高，选择性好的优势。该探针实现了HT-22细胞内H2S和CO的分别和同时检测，并应用该探针检测Aβ1-42诱导的HT-22细胞中H2S与CO水平变化，发现H2S水平升高，CO水平升高，提示内源性H2S与CO可能参与了阿尔茨海默病的病理进程，并且存在密切关联。
本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针FP-HSCO的制备方法。
本发明的又一发明目的是提供上述荧光探针在硫化氢和/或一氧化碳检测中的应用，该荧光探针可以单独检测硫化氢或一氧化碳；当硫化氢和一氧化碳同时存在时，该荧光探针可以同时检测硫化氢或一氧化碳，在检测的过程中并不产生相互干扰，具有较高的检测灵敏度和选择性。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测硫化氢和/或一氧化碳的荧光探针，其探针的结构式如下所示：
Figure RE-GDA0003548855450000021
本发明提供的荧光探针FP-HSCO的设计主要包括以下几点：(1)要设计小分子FRET(荧光共振能量转移，Fluorescence Resonance Energy Transfer)比例荧光探针，必须构建一个具有良好光物理性质的FRET骨架，能量转移骨架由能量供体，连接基团和能量受体组成，要保证供体和受体之间的距离在
Figure RE-GDA0003548855450000022
其次，供体的发射光谱和受体的吸收光谱之间存在合理的重叠，并且受体的HOMO和 LUMO能级应位于供体的能级范围内，以避免由于光致电子转移(PET)猝灭受体荧光。最后，能量供体和能量受体之间应具有优良的能量转移效率。本发明所构建的探针，选择香豆素作为能量供体，罗丹明作为能量受体，并选择哌嗪基部分作为刚性连接基团，以促进香豆素供体和罗丹明受体之间的能量转移。(2)以叠氮作为H2S的特异性识别基团，叠氮可以被H2S还原成氨基。当探针与H2S反应时，发射出香豆素荧光团的荧光。以吡啶-2-甲醛作为CO的特异性识别基团，吡啶-2-甲醛与CO反应生成具有三元环的中间体，然后再与质子结合形成带有四元环的中间体之后进行异构化，最后与水相互作用从而恢复罗丹明的共轭结构。当探针与CO反应时，发射出罗丹明荧光团的荧光。当探针与H2S 和CO共同反应时，两个特异性识别基团部分均发生相应的反应，此时在能量供体的激发波长下发射出能量受体的荧光，即在香豆素的激发波长下发射出罗丹明的荧光，探针分子的FRET过程开启。
为了验证探针FP-HSCO与H2S的反应原理：将FP-HSCO与Na2S在37℃PBS缓冲液中孵育20 min。结果显示，FP-HSCO与Na2S反应产生蓝色荧光物质，经HRMS证实蓝色荧光物质是FP-1。
为了验证探针FP-HSCO与CO的反应原理：将FP-HSCO与CORM-3在37℃PBS缓冲液中孵育 40min。结果显示，FP-HSCO与CORM-3反应产生红色荧光物质，经HRMS证实红色荧光物质是FP-2。
为了验证探针FP-HSCO同时与H2S和CO的反应原理：将FP-HSCO与Na2S在37℃PBS缓冲液中孵育20min后再向溶液中加入CORM-3孵育40min。结果显示，FP-HSCO与Na2S和CORM-3反应产生的物质经HRMS证实荧光物质是FP-3。
识别硫化氢和/或一氧化碳的荧光探针FP-HSCO的制备方法，它包括如下步骤：
Figure RE-GDA0003548855450000031
Figure RE-GDA0003548855450000041
进一步地，识别硫化氢和/或一氧化碳的荧光探针FP-HSCO的制备方法，它包括如下更加详细的步骤：
第一步：在哌啶存在的条件下，4-溴-2-羟基苯甲醛与丙二酸二乙酯进行化学反应，制备化合物1；
第二步：化合物2在碱性条件下进行水解反应制备化合物2；
第三步：在三氟乙酸存在的条件下，化合物3与化合物4进行化学反应，制备化合物C1；
第四步：化合物C1与水合肼进行化学反应，制备化合物C2；
第五步：化合物C2与吡啶-2-甲醛进行化学反应，制备化合物C3；
第六步：在HOBt和EDCI存在的条件下，化合物C3与所述化合物2进行化学反应，制备化合物 C4；
第七步：在避光条件下，化合物C4与NaN3进行化学反应，制备荧光探针FP-HSCO。
对于本发明而言，在第一步中，4-溴-2-羟基苯甲醛与丙二酸二乙酯的摩尔比为1:1.5～3.5，可以但不局限于1:1.5、1:1.6、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.5、1:3、1:3.2或1:3，为了获得更好的效果，4-溴-2-羟基苯甲醛与丙二酸二乙酯的摩尔比为1:2。
进一步地，4-溴-2-羟基苯甲醛与哌啶的摩尔比为1:2.5～4.5，可以但不局限于1:2.5、1:2.5、1:2.8、 1:2.9、1:3、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.6、1:3.8、1:4、1:4.2或1:4.5，为了获得更好的效果，4-溴-2-羟基苯甲醛与哌啶的摩尔比为1:3.3。
在第三步中，化合物3与化合物4的摩尔比为1:0.8～1.5，可以但不局限于1:0.8、1:0.9、1:0.95、 1:1、1:1.05、1:1.1、1:1.3或1:1.5，为了获得更好的效果，化合物3与化合物4的摩尔比为1:1。
在第四步中，化合物C1与水合肼的摩尔比为1:30～50，可以但不局限于1:30、1:33、1:35、1:38、 1:39、1:40、1:41、1:42、1:45、1:48或1:50，为了获得更好的效果，化合物C1与水合肼的摩尔比为1:40。
在第五步中，化合物C2与吡啶-2-甲醛的摩尔比为1:1～3，可以但不局限于1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.5、 1:1.6、1:1.8、1:2、1:2.3、1:2.5、1:2.8或1:3，为了获得更好的效果，化合物C2与吡啶-2-甲醛的摩尔比为1:1.5。
在第六步中，化合物C3与化合物2的摩尔比为1:0.8～1.5，可以但不局限于1:0.8、1:0.9、1:0.95、 1:1、1:1.05、1:1.1、1:1.3或1:1.5，为了获得更好的效果，化合物C3与化合物2的摩尔比为1:1。
进一步地，化合物C3与HOBt的摩尔比为1:0.8～1.5，可以但不局限于1:0.8、1:0.9、1:0.95、1:1、 1:1.05、1:1.1、1:1.3或1:1.5，为了获得更好的效果，化合物C3与HOBt的摩尔比为1:1。
进一步地，化合物C3与EDCI的摩尔比为1:0.8～1.5，可以但不局限于1:0.8、1:0.9、1:0.95、1:1、 1:1.05、1:1.1、1:1.3或1:1.5，为了获得更好的效果，化合物C3与EDCI的摩尔比为1:1。
进一步地，反应温度为80～100℃，可以但不局限于80℃、83℃、85℃、88℃、89℃、90℃、93℃、 95℃、98℃或100℃，为了获得更好的效果，反应温度为90℃。
在第七步中，化合物C4与NaN3的摩尔比为1:2～5，可以但不局限于1:2、1:2.3、1:2.5、1:2.8、1:2.9、 1:3、1:3.2、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5，为了获得更好的效果，化合物C4与NaN3的摩尔比为1:3。
本发明提供的荧光探针FP-HSCO，能够分别和同时检测H2S和CO的单分子荧光探针，实现细胞内H2S和CO的分别和同时检测，为生物体内H2S和CO的研究提供一种灵敏度高、选择性好、无创的可视化检测方法。采用该荧光探针可以检测Aβ1-42诱导的HT-22细胞中H2S和CO水平的变化，为阿尔茨海默病中H2S和CO的细胞串联机制研究提供有效的检测方法，有助于探索H2S和CO的共生关系和串联机制。由此可见，荧光探针FP-HSCO是可视化和定量检测硫化氢和一氧化碳的有效工具。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供一种基于FRET机理的能够分别和同时检测H2S和CO的单分子荧光探针FP-HSCO，具有检测限低(检测H2S和CO的检测限分别为9nM和15nM)，灵敏度高，选择性好的优势。荧光强度与Na2S(0-40μM)浓度以及CORM-3(0-40μM)浓度之间具有良好的线性关系，说明探针适合于生物体内H2S和CO的定量检测；并进一步应用FP-HSCO实现了HT-22细胞内H2S和CO的分别和同时的荧光成像。
在此基础上，继续探索了Aβ1-42诱导的HT-22细胞中内源性H2S和CO水平变化情况，实验结果表明Aβ1-42诱导的HT-22细胞中H2S水平降低，CO水平增加，提示内源性H2S和CO参与了AD的病理进程，并且存在密切关联。该探针有望为阿尔茨海默病等疾病中H2S和CO的细胞串联提供有效的检测方法，有助于揭示H2S和CO在调节人体生理病理功能方面的作用与机制。由此可见，荧光探针FP-HSCO是可视化和定量检测硫化氢和一氧化碳的有效工具。
附图说明
图1是荧光探针FP-HSCO与H2S和CO的反应原理示意图；
图2是荧光探针FP-HSCO的1H NMR图；
图3是荧光探针FP-HSCO的13C NMR图；
图4是荧光探针FP-HSCO的高分辨质谱:(M+H)+calculated for C44H38N9O5,772.2996；found, 772.2995；
图5是化合物FP-1的高分辨质谱:(M+Na)+calculated for C44H39N7NaO5,768.2910；found,768.2899；
图6是化合物FP-2的高分辨质谱:(M)+calculated for C38H33N6O6 +,669.2456；found,669.2451；
图7是化合物FP-3的高分辨质谱:(M)+calculated for C38H35N4O6 +,643.2551；found,643.2540；
图8是探针FP-HSCO与硫化氢和一氧化碳反应后的紫外吸收光谱，探针FP-HSCO，FP-HSCO+ Na2S，FP-HSCO+CORM-3和FP-HSCO+Na2S+CORM-3在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，30％CH3CN) 中的吸收光谱；在图中，在360nm处，曲线由上至下依次代表FP-HSCO+CORM-3、FP-HSCO+Na2S+ CORM-3、FP-HSCO和FP-HSCO+Na2S；
图9是探针FP-HSCO(10μM)与不同浓度Na2S(0-300μM)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4,30％ CH3CN)孵育20min的荧光响应强度变化，其中，(A)FP-HSCO(10μM)与不同浓度的Na2S(0-300 μM)孵育后的荧光光谱；(B)FP-HSCO(10μM)与不同浓度Na2S(0-300μM)孵育后荧光强度的变化；(C)荧光强度与Na2S浓度(0-40μM)之间的线性关系(λex＝350nm)；
图10是探针FP-HSCO与Na2S孵育不同时间的荧光光谱；其中，(A)FP-HSCO(10μM)和Na2S (160μM)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，30％CH3CN)，在37℃下分别孵育0,5,10,20,30和60min的荧光光谱(λex＝350nm)；(B)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，30％CH3CN)中，FP-HSCO(10μM)与Na2S(160μM)在37℃分别孵育0,5,10,20,30和60min的荧光强度(λex＝350nm)；
图11是pH对FP-HSCO与Na2S反应的影响；其中，(A)FP-HSCO(10μM)和Na2S(160μM)在不同pH的PBS缓冲液(20mM,pH 4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.4,7.5,8.0,8.5,9.0,30％CH3CN) 37℃下孵育20min的荧光谱图(λex＝350nm)；(B)FP-HSCO(10μM)和Na2S(160μM)在不同pH 的PBS缓冲液(20mM,pH 4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.4,7.5,8.0,8.5,9.0,30％CH3CN)37℃下孵育 20min的荧光响应(λex＝350nm)；
图12是探针FP-HSCO对硫化氢的选择性；(A)FP-HSCO(10μM)与Na2S(160μM)和RSS(100μM Na2S4；100μM Na2S2；1mM Cys；1mM GSH；10mM GSH；100μM Hcy；1mM GSSG；500μM S8；500μM S2O3 2-；500μM SO3 2-；500μM S2O4 2-；100mM CH3SSSCH3；500μM HSO3 -)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，30％CH3CN)中于37℃孵育20min的荧光光谱(λex＝350nm)；(B)FP-HSCO 与Na2S(160μM)和RSS孵育20min，红色代表FP-HSCO在450nm处与RSS的荧光强度，黑色代表FP-HSCO在450nm处与RSS和160μM Na2S的混合物的荧光强度；1.Blank+Na2S(160μM)；2. Na2S4(100μM)+Na2S(160μM)；3.Na2S2(100μM)+Na2S(160μM)；4.Cys(1mM)+Na2S(160 μM)；5.GSH(1mM)+Na2S(160μM)；6.GSH(10mM)+Na2S(160μM)；7.Hcy(100μM)+Na2S (160μM)；8.GSSG(1mM)+Na2S(160μM)；9.S8(500μM)+Na2S(160μM)；10.S2O3 2-(500 μM)+Na2S(160μM)；11.SO3 2-(500μM)+Na2S(160μM)；12.S2O4 2-(500μM)+Na2S(160μM)； 13.CH3SSSCH3(100mM)+Na2S(160μM)；14.HSO3 -(500μM)+Na2S(160μM)(λex＝350nm)；
图13是探针FP-HSCO对硫化氢的选择性；其中，(A)FP-HSCO(10μM)与Na2S(160μM)和ROS(100μM H2O2；100μM ClO-；100μM tBuOOH；100μM·OH；100μM 1O2；100μM O2-；100μMNO2 -；100μM NO；100μM NO3 2-；)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，30％CH3CN)中于37℃孵育20min的荧光光谱(λex＝350nm)；(B)FP-HSCO与Na2S(160μM)和ROS孵育20min，红色代表 FP-HSCO在450nm处与ROS的荧光强度，黑色代表FP-HSCO在450nm处与ROS和160μM Na2S 的混合物的荧光强度。1.Blank+Na2S(160μM)；2.H2O2(100μM)+Na2S(160μM)；3.ClO-(100 μM)+Na2S(160μM)；4.tBuOOH(100μM)+Na2S(160μM)；5.OH(100μM)+Na2S(160μM)； 6.1O2(100μM)+Na2S(160μM)；7.O2-(100μM)+Na2S(160μM)；8.NO2 -(100μM)+Na2S(160 μM)；9.ONOO-(100μM)+Na2S(160μM)；10.NO(100μM)+Na2S(160μM)；11.NO3 2-(100μM) +Na2S(160μM)(λex＝350nm)；
图14是探针FP-HSCO对硫化氢的选择性；其中，(A)FP-HSCO(10μM)与Na2S(160μM)和无机盐离子(1mM Na+；1mM K+；1mM Cu2+；1mM Ca2+；1mM Mg2+；1mM Zn2+；1mM Fe3+；1mM Fe2+；1mM CO3 2-；1mM HCO3 -；1mM Cl-；1mM I-；1mM HPO4 2-；1mM H2PO4 -)在PBS缓冲液(20mM， pH＝7.4，30％CH3CN)中于37℃孵育20min的荧光光谱(λex＝350nm)；(B)FP-HSCO与Na2S(160 μM)和无机盐离子孵育20min，红色代表FP-HSCO在450nm处与无机盐离子的荧光强度，黑色代表FP-HSCO在450nm处与无机盐离子和160μM Na2S的混合物的荧光强度。1.Blank+Na2S(160μM)； 2.Na+(1mM)+Na2S(160μM)；3.K+(1mM)+Na2S(160μM)；4.Cu2+(1mM)+Na2S(160μM)； 5.Ca2+(1mM)+Na2S(160μM)；5.Mg2+(1mM)+Na2S(160μM)；7.Zn2+(1mM)+Na2S(160 μM)；8.Fe3+(1mM)+Na2S(160μM)；9.Fe2+(1mM)+Na2S(160μM)；10.CO3 2-(1mM)+Na2S (160μM)；11.HCO3 -(1mM)+Na2S(160μM)；12.Cl-(1mM)+Na2S(160μM)；13.I-(1mM) +Na2S(160μM)；14.HPO4 2-(1mM)+Na2S(160μM)；15.H2PO4 -(1mM)+Na2S(160μM)(λex＝350 nm)；
图15是探针FP-HSCO对硫化氢的选择性；(A)FP-HSCO(10μM)与Na2S(160μM)和氨基酸(空白；1mM Arg；1mM Glu；1mM Gly；1mM His；1mM Lys；1mM Phe；1mM Thr；1mM Trp；1mMTyr；1mM Ala；1mM L-AA)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，30％CH3CN)中于37℃孵育20min 的荧光光谱(λex＝350nm)；(B)FP-HSCO与Na2S(160μM)和氨基酸孵育20min，红色代表FP-HSCO在450nm处与氨基酸的荧光强度，黑色代表FP-HSCO在450nm处与氨基酸和160μM Na2S的混合物的荧光强度。1.Blank+Na2S(160μM)；2.Arg(1mM)+Na2S(160μM)；3.Glu(1mM)+Na2S (160μM)；4.Gly(1mM)+Na2S(160μM)；5.His(1mM)+Na2S(160μM)；6.Lys(1mM)+Na2S (160μM)；7.Phe(1mM)+Na2S(160μM)；8.Thr(1mM)+Na2S(160μM)；9.Trp(1mM)+Na2S (160μM)；10.Tyr(1mM)+Na2S(160μM)；11.Ala(1mM)+Na2S(160μM)；12.L-AA(1mM) +Na2S(160μM)(λex＝350nm)；
图16是探针FP-HSCO(10μM)与不同浓度CORM-3(0-300μM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4, 30％CH3CN)孵育40min的荧光响应；其中，(A)探针FP-HSCO(10μM)与不同浓度的CORM-3 (0-300μM)孵育后的荧光光谱；(B)FP-HSCO(10μM)在575nm处与不同浓度CORM-3(0-300μM) 孵育后荧光强度的变化；(C)荧光强度与CORM-3浓度(0-40μM)之间的线性关系(λex＝520nm)；
图17是探针FP-HSCO与CORM-3孵育不同时间的荧光光谱；其中，(A)FP-HSCO(10μM)和 CORM-3(160μM)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，30％CH3CN)，在37℃下分别孵育0,5,10,20, 30,40和60min的荧光光谱(λex＝520nm)；(B)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，30％CH3CN)中， FP-HSCO(10μM)与CORM-3(160μM)在37℃分别孵育0,5,10,20,30,40和60min的荧光强度变化(λex＝520nm)；
图18是pH对FP-HSCO与CORM-3反应的荧光光谱影响；其中，(A)FP-HSCO(10μM)和CORM-3(160μM)在不同pH的PBS缓冲液(20mM,pH 4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.4,7.5,8.0,8.5, 9.0,30％CH3CN)37℃下孵育40min的荧光光谱(λex＝520nm)；(B)FP-HSCO(10μM)和CORM-3 (160μM)在不同pH的PBS缓冲液(20mM,pH 4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.4,7.5,8.0,8.5,9.0,30％ CH3CN)37℃下孵育40min的荧光强度变化(λex＝520nm)；
图19是探针FP-HSCO对一氧化碳的选择性；其中，(A)FP-HSCO(10μM)与CORM-3(160μM) 和RSS(空白；100μM Na2S4；100μM Na2S2；1mM Cys；1mM GSH；10mM GSH；100μM Hcy；1mMGSSG；500μM S8；500μM S2O3 2-；500μM SO3 2-；500μM S2O4 2-；100mM CH3SSSCH3；500μM HSO3 -)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，30％CH3CN)中于37℃孵育40min的荧光光谱(λex＝520nm)；(B)FP-HSCO与CORM-3(160μM)和RSS孵育40min，红色代表FP-HSCO在575nm处与RSS的荧光强度，黑色代表FP-HSCO在575nm处与RSS和160μM CORM-3的混合物的荧光强度。1.blank+ CORM-3(160μM)；2.Na2S4(100μM)+CORM-3(160μM)；3.Na2S2(100μM)+CORM-3(160μM)；4.Cys(1mM)+CORM-3(160μM)；5.GSH(1mM)+CORM-3(160μM)；6.GSH(10mM)+CORM-3 (160μM)；7.Hcy(100μM)+CORM-3(160μM)；8.GSSG(1mM)+CORM-3(160μM)；9.S8 (500μM)+CORM-3(160μM)；10.S2O3 2-(500μM)+CORM-3(160μM)；11.SO3 2-(500μM)+ CORM-3(160μM)；12.S2O4 2-(500μM)+CORM-3(160μM)；13.CH3SSSCH3(100mM)+CORM-3 (160μM)；14.HSO3 -(500μM)+CORM-3(160μM)(λex＝520nm)；
图20是探针FP-HSCO对一氧化碳的选择性；其中，(A)FP-HSCO(10μM)与CORM-3(160μM) 和ROS(空白；100μM H2O2；100μM ClO-；100μM tBuOOH；100μM·OH；100μM 1O2；100μMO2 .-；100 μM NO2 -；100μM NO；100μM NO3 2-；)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，30％CH3CN)中于37℃孵育40min的荧光光谱(λex＝520nm)；(B)FP-HSCO与CORM-3(160μM)和ROS孵育40min，红色代表FP-HSCO在575nm处与ROS的荧光强度，黑色代表FP-HSCO在575nm处与ROS和160μMCORM-3的混合物的荧光强度。1.Blank+CORM-3(160μM)；2.H2O2(100μM)+CORM-3(160μM)；3.ClO-(100μM)+CORM-3(160μM)；4.tBuOOH(100μM)+CORM-3(160μM)；5.OH(100μM) +CORM-3(160μM)；6.1O2(100μM)+CORM-3(160μM)；7.O2-(100μM)+CORM-3(160μM)； 8.NO2 -(100μM)+CORM-3(160μM)；9.ONOO-(100μM)+CORM-3(160μM)；10.NO(100μM) +CORM-3(160μM)；11.NO3 2-(100μM)+CORM-3(160μM)(λex＝520nm)；
图21是探针FP-HSCO对一氧化碳的选择性，其中，(A)FP-HSCO(10μM)与CORM-3(160μM) 和无机盐离子(空白；1mM Na+；1mM K+；1mM Cu2+；1mM Ca2+；1mM Mg2+；1mM Zn2+；1mM Fe3 +；1 mM Fe2+；1mM CO3 2-；1mM HCO3 -；1mM Cl-；1mM I-；1mM HPO4 2-；1mM H2PO4 -)在PBS缓冲液(20 mM，pH＝7.4，30％CH3CN)中于37℃孵育40min的荧光光谱(λex＝520nm)；(B)FP-HSCO与CORM-3 (160μM)和无机盐离子孵育40min，红色代表FP-HSCO在575nm处与无机盐离子的荧光强度，黑色代表FP-HSCO在575nm处与无机盐离子和160μM CORM-3的混合物的荧光强度。1.Blank+ CORM-3(160μM)；2.Na+(1mM)+CORM-3(160μM)；3.K+(1mM)+CORM-3(160μM)；4. Cu2 +(1mM)+CORM-3(160μM)；5.Ca2+(1mM)+CORM-3(160μM)；5.Mg2+(1mM)+CORM-3 (160μM)；7.Zn2 +(1mM)+CORM-3(160μM)；8.Fe3+(1mM)+CORM-3(160μM)；9.Fe2+ (1mM)+CORM-3(160μM)；10.CO3 2-(1mM)+CORM-3(160μM)；11.HCO3 -(1mM)+CORM-3 (160μM)；12.Cl-(1mM)+CORM-3(160μM)；13.I-(1mM)+CORM-3(160μM)；14.HPO4 2- (1mM)+CORM-3(160μM)；15.H2PO4 -(1mM)+CORM-3(160μM)(λex＝520nm)；
图22是探针FP-HSCO对一氧化碳的选择性；其中，(A)FP-HSCO(10μM)与CORM-3(160μM) 和氨基酸(空白；1mM Arg；1mM Glu；1mM Gly；1mM His；1mM Lys；1mM Phe；1mM Thr；1mMTrp； 1mM Tyr；1mM Ala；1mM L-AA)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，30％CH3CN)中于37℃孵育40min的荧光光谱(λex＝520nm)；(B)FP-HSCO与CORM-3(160μM)和氨基酸孵育40min，红色代表FP-HSCO在575nm处与氨基酸的荧光强度，黑色代表FP-HSCO在575nm处与氨基酸和160μMCORM-3的混合物的荧光强度；1.Blank+CORM-3(160μM)；2.Arg(1mM)+CORM-3(160μM)；3.Glu(1mM)+CORM-3(160μM)；4.Gly(1mM)+CORM-3(160μM)；5.His(1mM)+CORM-3 (160μM)；6.Lys(1mM)+CORM-3(160μM)；7.Phe(1mM)+CORM-3(160μM)；8.Thr(1mM) +CORM-3(160μM)；9.Trp(1mM)+CORM-3(160μM)；10.Tyr(1mM)+CORM-3(160μM)； 11.Ala(1mM)+CORM-3(160μM)；12.L-AA(1mM)+CORM-3(160μM)(λex＝520nm)；
图23是探针FP-HSCO(10μM)与Na2S(200μM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,30％CH3CN) 孵育20min，再与不同浓度的CORM-3(0-200μM)孵育40min后的荧光响应变化(λex＝350nm)；
图24是探针FP-HSCO对细胞存活率的影响；其中，(A)HT-22细胞与FP-HSCO(0,5,10,20,50 μM)孵育24h细胞的存活率；(B)HT-22细胞与FP-HSCO(10μM)孵育不同时间(0,6,12,18,24h) 细胞的存活率；
图25是探针FP-HSCO检测硫化氢的荧光成像；其中，(A)HT-22细胞与FP-HSCO(10μM)在 37℃下孵育10min；(B)细胞用氯化锌(ZnCl2，1mM)预处理10min，然后与FP-HSCO(10μM) 孵育10min；(C)将细胞与FP-HSCO(10μM)孵育10min，然后再与Na2S(10μM)孵育30min；(D)将细胞与FP-HSCO(10μM)孵育10min，然后再与Na2S(20μM)孵育30min；(E)将细胞提前10min给予氯化锌(ZnCl2，1mM)后，与探针孵育，再与Na2S(20μM)孵育30min；(F)以上图片(ABCDE)中细胞的平均荧光强度；###p<0.001vs.(A)column,***p<0.001vs.(C)column,***p<0.001vs.(D)column；
图26是图25中所对应的细胞明场图；
图27是FP-HSCO检测内源性硫化氢的荧光成像；其中，(A)将细胞与L-半胱氨酸(L-Cys，50 μM)预孵育30min，然后在37℃与FP-HSCO(10μM)进一步孵育10min；(B)将细胞与2-(氨基氧基)乙酸(AOAA，200μM)预孵育30min，然后在37℃与L-半胱氨酸(L-Cys，50μM)进一步孵育 30min，然后与FP-HSCO(10μM)孵育10min；(C)以上图片(AB)中细胞的平均荧光强度；##p< 0.01vs.(B)column；
图28是图27中所对应的细胞明场图；
图29是探针FP-HSCO检测一氧化碳的荧光成像；其中，(A)HT-22细胞与FP-HSCO(10μM) 在37℃下孵育10min；(B)细胞用血红蛋白(1mM)预处理10min，然后与FP-HSCO(10μM)孵育10min；(C)将细胞与FP-HSCO(10μM)孵育10min，然后再与CORM-3(10μM)孵育30min； (D)将细胞与FP-HSCO(10μM)孵育10min，然后再与CORM-3(20μM)孵育30min；(E)将细胞提前10min给予血红蛋白(1mM)后，与探针孵育，再与CORM-3(20μM)孵育30min；(F) 以上图片(ABCDE)中细胞的平均荧光强度；#p<0.05vs.(A)column,###p<0.001vs.(A)column,***p<0.001vs.(C)column,***p<0.001vs.(D)column；
图30是图29中所对应的细胞明场图；
图31是FP-HSCO检测内源性一氧化碳的荧光成像；其中，(A)将细胞与血红素(Heme，50μM) 预孵育4h，然后在37℃与FP-HSCO(10μM)进一步孵育10min；(B)将细胞与锌原卟啉(ZnPP， 50μM)预孵育1h，然后在37℃与血红素(Heme，50μM)进一步孵育4h，然后与FP-HSCO(10μM) 孵育10min；(C)以上图片(ABC)中细胞的平均荧光强度；#p<0.05vs.(B)column；
图32是图31中所对应的细胞明场图；
图33是探针FP-HSCO同时检测硫化氢和一氧化碳的荧光成像；其中，(A-D)将细胞与FP-HSCO (10μM)孵育10min，分别为明场，channel 1，channel 2，channel 3的图像；(E)明场，channel 1， channel 2，channel 3的(ABCD)平均荧光强度；(F-I)将细胞与FP-HSCO(10μM)孵育10min，然后再与Na2S(20μM)孵育30min，分别为明场，channel 1，channel 2，channel 3的图像；(J)明场，channel 1，channel 2，channel 3的(FGHI)平均荧光强度；(K-N)将细胞与FP-HSCO(10μM) 孵育10min，然后再与CORM-3(20μM)孵育30min，分别为明场，channel 1，channel 2，channel 3 的图像；(O)明场，channel 1，channel 2，channel 3的(KLMN)平均荧光强度；(P-S)将细胞与FP-HSCO (10μM)孵育10min，然后与Na2S(20μM)孵育30min，再与CORM-3(20μM)孵育30min，分别为明场，channel 1，channel 2，channel 3的图像；(T)明场，channel 1，channel 2，channel 3的 (PQRS)平均荧光强度；
图34是不同浓度的Aβ1-42对细胞存活率的影响；HT-22细胞与Aβ1-42(0,5,10,20,40μM,80μM) 孵育24h细胞的存活率；
图35是探针FP-HSCO在未经Aβ1-42诱导的细胞和Aβ1-42(20μM)诱导的细胞内的荧光成像；其中，(A-D)HT-22细胞与FP-HSCO(10μM)在37℃下孵育10min；(E-H)Aβ1-42诱导的HT-22细胞与FP-HSCO(10μM)在37℃下孵育10min；(I)正常细胞与Aβ1-42诱导的HT-22细胞中channel 1， channel 2，channel 3的平均荧光强度；#p<0.05vs.(Channel 1)column inControl,*p<0.05vs.(Channel 3) column in Control。
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明的荧光探针FP-HSCO作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
一、实施方法
1.溶液的配置
探针溶液的配制：将FP-HSCO(7.72mg，0.01mmol)溶解于乙腈(10mL)中，配成1mM的探针溶液。
Na2S储备液的配制(作为H2S的来源)：在10mL的去离子水中通氮气15min。在氮气条件下，将Na2S·9H2O(24mg，0.1mmol)溶于溶液中，配成10mM Na2S储备液，根据实验需要将Na2S储备液稀释成1.0mM-100μM的溶液备用。
Na2S2储备液的配制(作为H2S2的来源)：在10mL的去离子水中通氮气15min。在氮气条件下，将Na2S2(11.01mg，0.1mmol)溶于溶液中，配成浓度为10mM的Na2S2储备液，根据实验需要将 Na2S2储备液稀释成1.0mM-100μM的溶液备用。
Na2S4储备液的配制：在10mL的去离子水中通氮气15min。在氮气条件下，将Na2S4(17.42mg， 0.1mmol)溶于上述溶液中，配成浓度为10mM的Na2S4储备液，根据实验需要将Na2S4储备液稀释成1.0mM-100μM的溶液备用。
谷胱甘肽(GSH)储备液的配制：将GSH(30.7mg，0.1mmol)溶于去离子水(10mL)中，配成浓度为10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM和10mM的溶液备用。
L-半胱氨酸(L-Cys)储备液的配制：将Cys(12.10mg，0.1mmol)溶于去离子水(10mL)中，配成浓度为10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。
同型半胱氨酸(Hcy)储备液的配制：将Hcy(13.5mg，0.1mmol)溶于去离子水(10mL)中，配成浓度为10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。
其他物质(GSSG，S8，Na2S2O3，CH3SSSCH3，Na2SO4，Na2SO3，Na2S2O3，NaHSO3等)储备液配制方法同上。
H2O2；ClO-；tBuOOH；·OH；1O2；O2 .-；NO2 -；ONOO-；NO,NO3 -；Na+；K+；Cu2+；Ca2+；Mg2+；Zn2+；Fe3+； Fe2+；CO3 2-；HCO3 -；Cl-；I-；HPO4 2-；H2PO4 -；Arg；Glu；Gly；His；Lys；Phe；Thr；Trp；Tyr；Ala；L-AA都以双蒸水做溶剂。·OH通过FeII(EDTA)与H2O2之间的Fenton反应获得[155]。NO从3-(氨基丙基)-1-3-羟基 -3-异丙基-2-氧代-1-三氮烯(NOC-5,50μmol/ml)产生。NO2 -由NaNO2产生。
以上所有配制溶液均现配现用。
2.细胞
种属和品系：小鼠海马神经元细胞HT-22。来源：上海盖宁生物科技有限公司。
二、实施例
2.1荧光探针FP-HSCO的合成
以4-溴-2-羟基苯甲醛为原料，与丙二酸二乙酯在哌啶存在下进行回流反应合成7-溴-2-氧代-2H- 亚甲基-3-羧酸乙酯(化合物1)；在氢氧化钠存在下，7-溴-2-氧代-2H-亚甲基-3-羧酸乙酯(化合物1) 进行水解反应合成7-溴-2-氧代-2H-亚甲基-3-羧酸(化合物2)。以4-二乙氨基酮酸(化合物3)为起始原料，与3-(1-哌嗪基)苯酚(化合物4)进行回流反应合成化合物C1；化合物C1与水合肼反应，生成化合物C2；C2与吡啶-2-甲醛反应生成化合物C3；化合物C3和7-溴-2-氧代-2H-亚甲基-3-羧酸(化合物2)反应生成化合物C4；化合物C4和叠氮化钠反应生成荧光探针FP-HSCO，具体制备过程如下。
2.1.1 7-溴-2-氧代-2H-亚甲基-3-羧酸乙酯(化合物1)的合成
Figure RE-GDA0003548855450000131
将4-溴-2-羟基苯甲醛(1.0g，1mmol)溶于乙醇(20mL)中，加入丙二酸二乙酯(955mg，2mmol) 和哌啶(1.27g，0.3mmol)，回流反应3h。反应完毕后，冷却至室温，过滤，得到浅黄色固体1.40g，产率为95％。TLC(silica，PE:EA，2:1v/v)：Rf＝0.4。
2.1.2 7-溴-2-氧代-2H-亚甲基-3-羧酸(化合物2)的合成
Figure RE-GDA0003548855450000132
将化合物7-溴-2-氧代-2H-亚甲基-3-羧酸乙酯(化合物1，600mg，2mmol)溶解在NaOH溶液(10％， 10mL)中，回流反应2h。反应完毕后，用浓HCl将pH调节至3。析出黄色固体，过滤，用水洗涤三次，得到化合物7-溴-2-氧代-2H-亚甲基-3-羧酸(化合物2)478mg，产率88％。TLC(silica，PE:EA， 2:1v/v)：Rf＝0.5。
2.1.3 化合物C1的合成
Figure RE-GDA0003548855450000133
在三氟乙酸(20ml)中加入4-二乙氨基酮酸(化合物3，3.13g,1mmol)，再加入3-(1-哌嗪基) 苯酚(化合物4，1.78g,1mmol)，在氮气条件下回流8h。反应完毕后，减压浓缩得到红色固体C1 为3.27g，产率72％。TLC(silica，DCM:MeOH，10:1v/v)：Rf＝0.2。
2.1.4 化合物C2的合成
Figure RE-GDA0003548855450000141
在氮气保护下，将化合物C1(455mg，1mmol)溶于甲醇(30mL)中，室温下逐滴加入NH2NH2 (2mL，40mmol)，然后回流反应4h。反应完毕后，减压浓缩除去甲醇。浓缩后得到的物质倒入水 (200mL)中，抽滤，用水洗涤，得到浅黄色固体C2为234.7mg，产率为50％。TLC(silica，DCM:MeOH， 15:1v/v)：Rf＝0.3。
2.1.5 化合物C3的合成
Figure RE-GDA0003548855450000142
将化合物C2(500mg，1mmol)和吡啶-2-甲醛(142μL，1.5mmol)溶解于10mL乙醇中，回流反应4h，反应完毕后，减压浓缩除去乙醇，得到的粗品通过柱层析色谱法纯化(DCM:MeOH，150:1 v/v)，得到黄色固体C3为327mg，产率为55％。TLC(silica，DCM:MeOH，30:1v/v)：Rf＝0.4。1H NMR (400MHz,CDCl3):δ8.44(t,J＝4.0Hz,1H),8.37(d,J＝8Hz,1H),8.00-7.93(m,2H),7.60-7.41(m,4H), 7.13-7.05(m,2H),6.69-6.41(m,5H),6.25-6.21(m,1H),3.29(d,J＝8.0Hz,4H),3.18(s,4H),3.02(s,2H), 2.60(m,2H),1.12(t,J＝8.0Hz,6H).其高分辨质谱:(M+H)+calculated for C34H35N6O2,559.2821；found, 559.2821。
2.1.6 化合物C4的合成
Figure RE-GDA0003548855450000143
将化合物C3(1.0g，1mmol)和7-溴-2-氧代-2H-亚甲基-3-羧酸(化合物2，482mg，1mmol) 溶解在无水N，N-二甲基甲酰胺(15mL)中，然后加入HOBt(242mg，1mmol)和EDCI(343mg， 1mmol)，在90℃反应8h。反应完毕后，加入15mL H2O，并将所得反应液用乙酸乙酯萃取(100×3mL)。将合并的萃取液依次用饱和食盐水(20mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥有机相。减压浓缩除去溶剂，并将固体残留物通过快速色谱柱(DCM:MeOH，120:1v/v)纯化，得到淡黄色固体C4为942mg，产率为65％。TLC(silica，DCM:MeOH，50:1v/v)：Rf＝0.5。其高分辨质谱:(M+H)+calculated for C44H38BrN6O5,809.2087；found,809.2086.
2.1.7 探针FP-HSCO的合成
Figure RE-GDA0003548855450000151
在氮气保护下，将化合物C4(1g，1mmol)溶于无水DMF(15mL)中，加入NaN3(240mg，3mmol)，避光回流反应8h。反应完毕后，将反应溶液倒入水(200mL)中，静置，抽滤，得到粗产物，粗产物通过快速色谱柱(DCM:MeOH，120:1v/v)纯化，得到淡黄色固体FP-HSCO为572mg，产率为60％。TLC(silica，DCM:MeOH，40:1v/v)：Rf＝0.4。相关的谱图如图2-4所示。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.47(d,J＝4.0Hz,1H),8.38(s,1H),8.21(d,J＝8.0Hz,1H),7.95 (d,J＝4.0Hz,1H),7.80-7.75(m,2H),7.70(d,J＝8.0Hz,2H),7.64-7.56(m,3H),7.32(t,J＝8.0Hz,1H), 7.08(d,J＝8.0Hz,1H),6.82(s,1H),6.67-6.64(m,1H),6.54(d,J＝8.0Hz,1H),6.47-6.44((m,2H),6.35 (dd,J＝2.4Hz,1H),3.71(s,2H),3.52(s,2H),3.31-3.28(m,6H),3.19(s,2H),1.06(t,J＝8.0Hz,6H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ164.72,163.19,157.72,154.43,153.72,152.70,152.53,152.13,152.06, 149.96,149.20,146.18,142.40,137.43,134.94,130.95,129.52,128.47,128.07,127.98,127.85,126.06, 125.25,124.97,124.25,123.88,119.84,119.70,118.25,112.33,109.48,108.88,104.97,102.54,97.82,65.38, 49.13,48.19,47.59,46.37,44.16,41.68,12.91.
2.2 探针FP-HSCO识别H2S的机理
FP-HSCO(7.71mg，0.01mmol)溶于CH3CN(3mL)中，加入溶有Na2S(48.036mg，0.2mmol) 的PBS缓冲液(7mL，20.0mM，pH＝7.4)，混合物在37℃下孵育20min。乙酸乙酯(3×10mL)萃取，减压浓缩，将产物进行提取分离，通过HRMS确认反应产物，从而确认探针FP-HSCO与H2S的反应产物结构。相关的谱图如图5所示。
2.3 探针FP-HSCO识别CO的机理
FP-HSCO(7.71mg，0.01mmol)溶于CH3CN(3mL)中，加入CORM-3(58.9mg，0.2mmol)，再加入7mL的PBS缓冲液(20.0mM，pH＝7.4)，混合物在37℃下孵育40min。乙酸乙酯(3×10mL) 萃取，减压浓缩，将产物进行提取分离，通过HRMS确认反应产物，从而确认探针FP-HSCO与CO 的反应产物结构。相关的谱图如图6所示。
2.4 探针FP-HSCO同时识别H2S和CO的机理
FP-HSCO(7.71mg，0.01mmol)溶于CH3CN(3mL)中，加入溶有Na2S(48.036mg，0.2mmol) 的PBS缓冲液(7mL，20.0mM，pH＝7.4)，混合物在37℃下孵育20min。20min之后加入CORM-3 (58.9mg，0.2mmol)再于37℃下孵育40min。乙酸乙酯(3×10mL)萃取，减压浓缩，将产物进行提取分离，通过HRMS确认反应产物，从而确认探针FP-HSCO与H2S和CO的反应产物结构。相关的谱图如图7所示。
2.5 荧光光谱的测定
将探针FP-HSCO溶解于CH3CN中，Na2S(作为H2S来源)和CORM-3(三羰基氯(甘氨酸基)钌，作为CO来源)为被检测物质，按需配制成所需要的浓度(如Na2S的浓度为10mM，CORM-3的浓度为10mM)与FP-HSCO混合，用20.0mM的磷酸盐缓冲液(pH 7.4，20mM)进行稀释，使测试液中水相占比70％，有机相占比30％。将测试液于37℃孵育一段时间后，倒入石英比色皿中并测定其荧光强度。以不含分析物的测试液作为空白对照。每组数据至少平行测定三次，结果以mean±SD表示。荧光分光光度计测试条件：对于探针FP-HSCO与Na2S的反应，激发波长为350nm，激发狭缝宽度 10nm，发射狭缝宽度10nm，扫描速度1200nm/min，发射光谱范围在400-700nm。光电倍增管的电压设为750V；对于探针FP-HSCO与CORM-3的反应，激发波长为520nm，激发狭缝宽度10nm，发射狭缝宽度10nm，扫描速度1200nm/min，发射光谱范围在400-700nm。光电倍增管的电压设为 750V；对于探针FP-HSCO与H2S和CO同时存在时的反应，激发波长为350nm，激发狭缝宽度10nm，发射狭缝宽度10nm，扫描速度1200nm/min，发射光谱范围在400-700nm。光电倍增管的电压设为 750V。
2.6 检测限的测定
探针的荧光发射光谱重复测定10次，并计算其荧光强度的标准偏差。随后将探针FP-HSCO与一定浓度范围的Na2S或CORM-3孵育，获得浓度与荧光强度的线性方程。探针检测限的计算公式为： 3σ/k。k代表荧光强度与Na2S或CORM-3浓度线性方程的斜率，σ代表空白样的标准偏差。
2.7 紫外光谱的测定
紫外光谱采用UV-2401PC紫外-可见分光光度计测定。将探针加入石英比色皿中，加入20.0mM 磷酸盐缓冲液将其稀释后，加入Na2S或CORM-3孵育，测定其吸收光谱。
2.8 探针FP-HSCO细胞毒性的测定
采用MTT法测定探针FP-HSCO的细胞毒性。将HT-22细胞以50,000个细胞/孔的密度接种在96 孔板中，放入5％CO2培养箱进行培养，培养至细胞进入对数生长期，除去培养液，将细胞分别与不同浓度的FP-HSCO孵育24h。以不加入FP-HSCO的细胞作为对照。24h后，每个孔中加入20μL MTT 染料(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物，5mg/mL，溶于PBS缓冲液中)，继续在37℃条件下孵育4h。随后除去剩余的MTT溶液，每孔中加入150μL的DMSO以溶解甲瓒结晶。摇床震荡10min后，用酶标仪测量570nm的吸光度。每个样品重复三次，整个实验重复三次。
2.9 细胞培养与细胞水平荧光成像
将HT-22细胞接种于细胞培养液(DMEM，含有10％的小牛血清、青霉素/链霉素(100μg/mL)，于37℃、5％CO2培养箱中培养。生长至对数期时，用胰酶消化，接种于共聚焦专用皿中。
分为如下几组：(1)生理水平H2S成像组：将探针FP-HSCO(终浓度10μM，1μL DMSO)与 HT-22细胞孵育10min；(2)清除剂组：将细胞提前10min给予氯化锌(ZnCl2，H2S的清除剂，1mM) 后，再与探针孵育10min。(3)生理水平CO成像组：将探针FP-HSCO(终浓度10μM，1μLDMSO) 与HT-22细胞孵育10min；(4)清除剂组：将细胞提前10min给予血红蛋白(CO的清除剂，1mM) 后，再与探针孵育10min。(5)外源性H2S成像组：将探针FP-HSCO(终浓度10μM，1μLDMSO) 与HT-22细胞孵育10min，然后加入Na2S(10μM，20μM，2μL生理盐水)孵育30min。成像前，缓和的用PBS缓冲液冲洗三次。(6)外源性CO成像组：将探针FP-HSCO(终浓度10μM，1μLDMSO) 与HT-22细胞孵育10min，然后加入CORM-3(10μM，20μM，1μL DMSO)孵育30min。成像前，缓和的用PBS缓冲液冲洗三次。(7)外源性H2S和CO共同成像组：将探针FP-HSCO(终浓度10μM， 1μL DMSO)与HT-22细胞孵育10min，然后加入Na2S(20μM，2μL生理盐水)孵育30min，继续加入CORM-3(20μM，1μL DMSO)孵育30min。成像前，缓和的用PBS缓冲液冲洗三次。(8)内源性H2S成像组：将HT-22细胞与L-半胱氨酸(50μM，1μL生理盐水)孵育30min后，再与探针FP-HSCO(10μM，1μL DMSO)孵育10min。成像前，缓和的用PBS缓冲液冲洗三次。抑制剂组：将HT-22细胞与AOAA(200μM，2μL生理盐水)孵育30min后，再与L-半胱氨酸(50μM，1μL 生理盐水)孵育30min，最后与探针FP-HSCO(10μM，1μL DMSO)孵育10min。成像前，缓和的用PBS缓冲液冲洗三次。(9)内源性CO成像组：将HT-22细胞与血红素(Heme，50μM，1μL DMSO) 孵育4h后，再与探针FP-HSCO(10μM，1μL DMSO)孵育10min。成像前，缓和的用PBS缓冲液冲洗三次。抑制剂组：将HT-22细胞与ZnPP(50μM，1μL DMSO)孵育1h后，再与血红素(Heme， 50μM，1μLDMSO)孵育4h，最后与探针FP-HSCO(10μM，1μL DMSO)孵育10min。成像前，缓和的用PBS缓冲液冲洗三次。采用Leica STELLARIS 5激光共聚焦显微镜(63×油镜)进行拍照。
通道1(蓝色荧光通道)的激发波长为405nm，发射波长范围为420-470nm；通道2(红色荧光通道)的激发波长为405nm，发射波长范围为550-600nm；通道3(红色荧光通道)的激发波长为514 nm，发射波长范围为550-600nm。采用徕卡软件(Lecia)进行分析。所有数据均以mean±SD表示 (n＝3)。
2.10 最适Aβ1-42造模条件的筛选
实验步骤同2.8，Aβ1-42的终浓度为0μM，5μM，10μM，20μM，40μM，80μM。根据Aβ1-42对细胞活力的影响，确定最适Aβ1-42造模条件。为了摸索最佳Aβ1-42造模条件，使用预先老化的不同浓度的Aβ1-42溶液(0μM，5μM，10μM，20μM，40μM，80μM)分别培养HT-22细胞24h，实验结果显示，20μM及以上浓度的Aβ1-42溶液培养HT-22细胞24h后，与对照组相比细胞活力明显下降。结合文献报道，使用20μM Aβ1-42培养HT-22细胞24h可以将HT-22细胞存活率降低到50-60％，最终确定Aβ1-42的最佳HT-22细胞造模条件为：20μM Aβ1-42培养24h。
2.11 数据处理
使用SPSS软件进行统计分析。数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05表示差异有统计学意义。
三、效果验证
3.1 荧光探针FP-HSCO与Na2S和CORM-3反应的紫外吸收光谱
首先，我们检测探针FP-HSCO与Na2S和CORM-3反应后的紫外吸收光谱发生的变化。从图8 可以看出，探针FP-HSCO与Na2S反应完后在375nm处有一紫外吸收峰，与CORM-3反应完后最大紫外吸收峰在551nm，与Na2S和CORM-3反应完后最大紫外吸收峰在550nm。
3.2 荧光探针FP-HSCO与Na2S反应的线性关系以及检测限
为了考察探针FP-HSCO能否对生物样本中的H2S进行定量检测，将FP-HSCO与不同浓度的Na2S (0-300μM)孵育，研究荧光强度与Na2S浓度之间的关系。如图9所示，在未加入Na2S孵育之前，探针FP-HSCO几乎无荧光；而当探针FP-HSCO与不同浓度的Na2S(0-300μM)孵育后，在450nm 处的荧光强度随着Na2S浓度的增强而逐渐增强(约20倍)，Na2S的浓度在0-40μM范围内与荧光强度呈现出良好的线性关系，在PBS缓冲液中，探针FP-HSCO检测H2S的检测限为9nM。当FP-HSCO 与Na2S的反应比例为1:16时，荧光强度达到峰值，反应趋于饱和(图9)。上述结果显示探针FP-HSCO 具有较好的检测灵敏度，适用于复杂生物体内H2S的定量检测。
3.3 荧光探针FP-HSCO与Na2S的反应时间
将探针FP-HSCO与Na2S(160μM)孵育不同的时间，荧光强度在20min左右达到峰值，说明 20min左右探针与Na2S(160μM)反应完全(图10)。另外，荧光强度也较稳定，将孵育时间延长至 60min，荧光强度未见减弱。
3.4 pH对荧光探针FP-HSCO与Na2S反应的影响
为了研究pH对探针FP-HSCO与H2S反应的影响，将探针与Na2S在不同pH的PBS缓冲液中进行孵育。探针与Na2S在pH 4.0-9.0时荧光强度比较稳定，荧光响应几乎无变化(图11)。上述结果表明，探针FP-HSCO适用于生理条件下(pH 7.4)H2S的定量检测。
3.5 荧光探针FP-HSCO检测Na2S的选择性
为了检验探针FP-HSCO对H2S具有良好的的选择性，如图12-15所示，将探针与活性硫物质(RSS，包括Na2S4；Na2S2；Cys；GSH；GSH；Hcy；GSSG；S8；S2O3 2-；SO3 2-；S2O4 2-；CH3SSSCH3；HSO3 -)、活性氧物质(ROS，包括H2O2；OCl-；tBuOOH；·OH；1O2；O2 -；)、活性氮物质(RNS，包括NO2 -；ONOO-；NO,NO3 -) 及无机盐离子(Na+；K+；Cu2+；Ca2+；Mg2+；Zn2+；Fe3+；Fe2+；CO3 2-；HCO3 -；Cl-；I-；HPO4 2-；H2PO4 -)及氨基酸(Arg；Glu；Gly；His；Lys；Phe；Thr；Trp；Tyr；Ala；L-AA)孵育20min后测定荧光强度。探针与Na2S 孵育会产生较强的荧光响应，但与其他物质几乎不响应。上述实验结果表明，探针FP-HSCO对H2S 具有良好的选择性而不受其他物质的干扰。
3.6 荧光探针FP-HSCO与CORM-3反应的线性关系以及检测限
为了考察探针FP-HSCO能否对生物样本中的CO进行定量检测，CORM-3是一种一氧化碳释放分子，可以作为外源性CO的来源，将FP-HSCO与不同浓度的CORM-3(0-300μM)孵育，研究荧光强度与CORM-3浓度之间的关系。如图16所示，在未加入CORM-3孵育之前，探针FP-HSCO几乎无荧光；而当探针FP-HSCO与不同浓度的CORM-3(0-300μM)孵育后，575nm处的荧光强度随着CORM-3浓度的增强而逐渐增强(约22倍)，CORM-3的浓度在0-40μM范围内与荧光强度呈现出良好的线性关系，在PBS缓冲液中，探针FP-HSCO检测CO的检测限为15nM。当FP-HSCO与CORM-3 的反应比例为1:16时，荧光强度达到峰值，反应趋于饱和(图16)。上述结果显示探针FP-HSCO具有较好的检测灵敏度，适用于复杂生物体内CO水平的定量检测。
3.7 荧光探针FP-HSCO与CORM-3的反应时间
将探针FP-HSCO与CORM-3(160μM)孵育不同的时间，荧光强度在40min左右达到峰值，说明40min左右探针与CORM-3(160μM)反应完全(图17)。另外，荧光强度也较稳定，将孵育时间延长至60min，荧光强度未见减弱。
3.8 pH对荧光探针FP-HSCO与CORM-3反应的影响
为了研究pH对探针FP-HSCO与CO反应的影响，将探针与CORM-3在不同pH的PBS缓冲液中进行孵育。探针与CORM-3在pH 4.0时荧光强度最高，随着pH值的增加荧光强度逐渐减弱(图18)。推测可能是生成的带有羧基的产物对pH的变化较为敏感，pH值低的时候酸性强，给质子能力越强，从而有利于生成产物的共轭结构，导致荧光更强。当pH值高的时候溶液碱性强，不利于带有羧基产物的存在，导致荧光随pH值的升高而减弱。上述结果表明，探针FP-HSCO适用于生理条件下(pH 7.4) CO的定量检测。
3.9 荧光探针FP-HSCO检测CORM-3的选择性
为了检验探针FP-HSCO对CO具有良好的的选择性，如图19-22所示，将探针与活性硫物质(RSS，包括Na2S4；Na2S2；Cys；GSH；GSH；Hcy；GSSG；S8；S2O3 2-；SO3 2-；S2O4 2-；CH3SSSCH3；HSO3 -)、活性氧物质(ROS，包括H2O2；OCl-；tBuOOH；·OH；1O2；O2 -；)、活性氮物质(RNS，包括NO2 -；ONOO-；NO,NO3 -) 及无机盐离子(Na+；K+；Cu2+；Ca2+；Mg2+；Zn2+；Fe3+；Fe2+；CO3 2-；HCO3 -；Cl-；I-；HPO4 2-；H2PO4 -)及氨基酸(Arg；Glu；Gly；His；Lys；Phe；Thr；Trp；Tyr；Ala；L-AA)孵育40min后测定荧光强度。探针与CORM-3 孵育会产生较强的荧光响应，但与其他物质几乎不响应。上述实验结果表明，探针FP-HSCO对CO 具有良好的选择性而不受其他物质的干扰
3.10 荧光探针FP-HSCO与H2S和CO共同反应的荧光光谱
之后，进一步研究了当H2S和CO同时存在时探针FP-HSCO的荧光响应情况。如图23所示，先向探针FP-HSCO的溶液中加入溶有Na2S·9H2O的PBS缓冲液，并使探针与Na2S的终浓度之比为1： 20，孵育20min之后再进一步向溶液中加入不同浓度的CORM-3(0-20equiv)，继续孵育40min。观察到在450nm处的荧光强度逐渐下降，在575nm处的荧光强度逐渐上升。上述结果说明当H2S和 CO同时存在时探针FP-HSCO的FRET过程开启，适用于生物体内H2S和CO的同时检测。
4 细胞水平荧光成像实验
4.1 细胞毒性测试
在进行细胞荧光成像之前，首先需要进行对探针FP-HSCO的细胞毒性测试。以小鼠海马神经元 HT-22细胞为检测细胞株，以MTT法检测探针FP-HSCO的细胞毒性。将不同浓度的探针FP-HSCO (0μM,5μM,10μM,20μM,50μM)与HT-22细胞孵育24h。结果发现，细胞存活率仍在80％以上 (图24)。将FP-HSCO(10μM)与HT-22细胞孵育0，6，12，18，24h后细胞存活率仍在90％以上。由此说明FP-HSCO对HT-22细胞存活率影响较小，具有低毒性。
4.2 生理水平及外源性H2S的细胞荧光成像
探针FP-HSCO在体外测试条件下具有良好的灵敏度与选择性，随后我们继续探究探针能否检测细胞中的H2S并进行荧光成像。将探针FP-HSCO与细胞在37℃下孵育10min，可见微弱的蓝色荧光 (图25A)。将细胞提前10min给予氯化锌(ZnCl2，H2S的清除剂，1mM)后，再与探针孵育，几乎未见荧光响应(图25B)，说明图24A中的微弱蓝色荧光是由生理浓度的内源性H2S引起的，探针 FP-HSCO可检测生理水平的H2S，具有较高的检测灵敏度。随后，将探针与细胞孵育10min后，再给予不同浓度的Na2S(10μM，20μM)，可见细胞中出现明亮的蓝色荧光(图25C及D)。将细胞提前10min给予氯化锌(ZnCl2，1mM)后，与探针孵育，再与Na2S(20μM)孵育30min，可见蓝色荧光显著降低(图25E)，说明细胞中的蓝色荧光是由外源性H2S的加入引起的。从图26可以看出，拍摄过程中细胞形态良好。综上所述，探针FP-HSCO可以检测生理浓度的内源性H2S以及不同水平的外源性H2S。
4.3 内源性H2S的细胞荧光成像
继续考察探针FP-HSCO能否在活细胞中进行内源性H2S荧光成像。胱硫醚-γ-裂解酶(CBS)是内源性H2S的合成酶，而L-半胱氨酸(L-Cys)可作为前体在CBS的催化下生成内源性H2S。因此，本实验采用L-Cys与细胞孵育的方法来诱导内源性H2S的产生。将HT-22细胞用L-Cys处理，孵育30 min后再与探针孵育10min，可见HT-22细胞显示出明亮的蓝色荧光(图27A)。将细胞用2-(氨基氧基)乙酸(AOAA，CBS合成酶的抑制剂)孵育30min，与L-Cys孵育30min，再与探针FP-HSCO孵育，荧光强度显著降低(图27B)。从图28可以看出，拍摄过程中细胞形态良好。上述实验说明探针 FP-HSCO可以进行细胞内源性H2S荧光成像。
4.4 生理水平及外源性CO的细胞荧光成像
我们继续探究探针能否检测细胞中的CO并进行荧光成像。将探针FP-HSCO与细胞在37℃下孵育10min，可见微弱的红色荧光(图29A)。将细胞提前10min给予血红蛋白(CO的清除剂，1mM) 后，再与探针孵育，几乎未见荧光响应(图29B)，说明图1.40A中的微弱红色荧光是由生理浓度的内源性CO引起的，探针FP-HSCO可检测生理水平的CO，具有较高的检测灵敏度。
随后，将探针与细胞孵育10min后，再给予不同浓度的CORM-3(10μM，20μM)，可见细胞中出现明亮的红色荧光(图29C及D)。将细胞提前10min给予血红蛋白(1mM)后，与探针孵育，再与CORM-3(20μM)孵育30min，可见红色荧光显著降低(图29E)，说明细胞中的红色荧光是由外源性CO的加入引起的。从图30可以看出，拍摄过程中细胞形态良好。综上所述，探针FP-HSCO可以检测生理浓度的内源性CO以及不同水平的外源性CO。
4.5 内源性一氧化碳的细胞荧光成像
本文继续考察探针FP-HSCO能否在活细胞中进行内源性CO荧光成像。血红素加氧酶-1(HO-1) 是内源性CO的合成酶，而血红素(Heme)，是一种HO-1激活剂，可促进内源性CO的产生。因此，本实验采用Heme与细胞孵育的方法来诱导内源性CO的产生。将HT-22细胞用Heme处理，孵育4h 后再与探针孵育10min，可见HT-22细胞显示出明亮的红色荧光(图31A)。将细胞用锌原卟啉(ZnPP， HO-1酶的抑制剂)孵育1h，与Heme孵育4h，再与探针孵育，荧光强度显著降低(图31B)。从图 32可以看出，拍摄过程中细胞形态良好。上述实验说明探针FP-HSCO可以进行细胞内源性CO荧光成像。
4.6 硫化氢和一氧化碳共存时的细胞荧光成像
为了探究探针FP-HSCO对同时检测H2S和CO的可行性，我们向细胞中加入加入外源性的H2S 和CO并进行荧光成像。首先，将探针FP-HSCO与细胞在37℃下孵育10min，可见在通道1中有微弱的蓝色荧光，通道2中无荧光，通道3中有微弱的红色荧光，如图33B、C、D所示。其次，将探针与细胞孵育10min后，再与Na2S(20μM)孵育30min，可见通道1中的蓝色荧光强度显著上升(图 33G)，通道2及通道3中的荧光强度基本无变化。接着，将探针与细胞孵育10min后，再与CORM-3 (20μM)孵育30min，可见通道3中的红色荧光强度显著上升(图33N)，而通道1及通道2中的荧光强度基本无变化。最后，为了验证探针FP-HSCO对同时检测H2S和CO的可行性，将探针与细胞孵育10min后，加入Na2S(20μM)孵育30min，再加入CORM-3(20μM)孵育30min，可见在通道1中的蓝色荧光强度下降(图33Q)，而通道2中有红色荧光出现(图33R)，这是由于当H2S和CO 共存时FRET过程的发生，说明探针FP-HSCO可用于检测H2S和CO共存时的荧光强度变化。上述结果说明探针FP-HSCO可以在三种不同的荧光信号模式下，分别和同时检测细胞内的H2S和CO。
5 检测Aβ诱导的细胞内硫化氢和一氧化碳水平变化
阿尔茨海默病(AD)是一种常见的神经退行性疾病，也是老年性痴呆的主要病因。它是一种进行性年龄依赖性神经退行性疾病，最终导致认知功能障碍。为了摸索最佳Aβ1-42造模条件，使用预先老化的不同浓度的Aβ1-42溶液(0μM，5μM，10μM，20μM，40μM，80μM)与HT-22细胞孵育24h。如图34所示，20μM及以上浓度的Aβ1-42溶液培养HT-22细胞24h后，细胞存活率下降至50％左右。由此说明20μM及以上浓度的Aβ1-42溶液对HT-22细胞存活率影响较大，具有较高的神经毒性。
接着探索Aβ1-42诱导的HT-22细胞中内源性H2S和CO水平的变化。首先进行对照组实验，HT-22 细胞与FP-HSCO孵育10min后进行荧光成像，如图35B和D所示，在通道1中有微弱的蓝色荧光，通道3中有微弱的红色荧光。然后，进行Aβ1-42诱导的HT-22细胞荧光成像，将HT-22细胞加入20μM 的Aβ1-42溶液孵育24h，再加入探针FP-HSCO孵育10min后进行荧光成像，如图35F和H所示，在通道1中有非常微弱的蓝色荧光，通道3中有微弱的红色荧光。
与未经Aβ1-42诱导的HT-22细胞相比，Aβ1-42诱导的HT-22细胞在通道1中的蓝色荧光强度减弱 (图35F)，通道3中的红色荧光强度增加(图35H)，这说明细胞内H2S水平下降，CO水平提高，提示内源性H2S与CO参与了AD的病理进程，并且存在密切关联。结合文献报道，AD患者大脑中 H2S水平降低，海马组织和大脑皮层神经元以及星形胶质细胞中HO-1明显过表达从而导致CO水平增加，可发现专利的实验结果与文献报道一致。综上，该探针可用于检测Aβ1-42诱导的HT-22细胞中 H2S和CO水平的变化，并有望为阿尔茨海默病等疾病中H2S和CO的细胞串联机制研究提供有效的检测方法，有助于揭示H2S和CO在调节人体生理病理功能方面的作用与机制。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种用于分别和同时检测硫化氢和一氧化碳的荧光探针，其探针的结构式如下所示：
Figure FDA0003372777710000011
2.权利要求1所述的用于分别和同时检测硫化氢和一氧化碳的荧光探针，其特征在于，它包括如下步骤：
Figure FDA0003372777710000012
Figure FDA0003372777710000021
3.根据权利要求2所述的用于分别和同时检测硫化氢和一氧化碳的荧光探针，其特征在于，它包括如下步骤：
第一步：在哌啶存在的条件下，4-溴-2-羟基苯甲醛与丙二酸二乙酯进行化学反应，制备化合物1；
第二步：化合物2在碱性条件下进行水解反应制备化合物2；
第三步：在三氟乙酸存在的条件下，化合物3与化合物4进行化学反应，制备化合物C1；
第四步：化合物C1与水合肼进行化学反应，制备化合物C2；
第五步：化合物C2与吡啶-2-甲醛进行化学反应，制备化合物C3；
第六步：在HOBt和EDCI存在的条件下，化合物C3与所述化合物2进行化学反应，制备化合物C4；
第七步：在避光条件下，化合物C4与NaN3进行化学反应，制备荧光探针FP-HSCO。
4.根据权利要求3所述的用于分别和同时检测硫化氢和一氧化碳的荧光探针，其特征在于，在第一步中，所述4-溴-2-羟基苯甲醛与丙二酸二乙酯的摩尔比为1:1.5～3.5，优选为1:2；所述4-溴-2-羟基苯甲醛与哌啶的摩尔比为1:2.5～4.5，优选为1:3.3。
5.根据权利要求3所述的用于分别和同时检测硫化氢和一氧化碳的荧光探针，其特征在于，在第三步中，所述化合物3与化合物4的摩尔比为1:0.8～1.5，优选为1:1；在第四步中，所述化合物C1与水合肼的摩尔比为1:30～50，优选为1:40。
6.根据权利要求3所述的用于分别和同时检测硫化氢和一氧化碳的荧光探针，其特征在于，在第五步中，所述化合物C2与吡啶-2-甲醛的摩尔比为1:1～3，优选为1:1.5。
7.根据权利要求3所述的用于分别和同时检测硫化氢和一氧化碳的荧光探针，其特征在于，在第六步中，所述化合物C3与化合物2的摩尔比为1:0.8～1.5，优选为1:1；所述化合物C3与HOBt的摩尔比为1:0.8～1.5，优选为1:1；所述化合物C3与EDCI的摩尔比为1:0.8～1.5，优选为1:1；反应温度为80～100℃，优选为90℃。
8.根据权利要求3所述的用于分别和同时检测硫化氢和一氧化碳的荧光探针，其特征在于，在第七步中，所述化合物C4与NaN3的摩尔比为1:2～5，优选为1:3。
9.权利要求1所述的用于分别和同时检测硫化氢和一氧化碳的荧光探针作为检测硫化氢和/或一氧化碳的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的荧光探针在细胞水平检测硫化氢和/或一氧化碳的应用。
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