CN116284024B - 能分别和同时检测一氧化氮和二氧化硫的单分子荧光探针 - Google Patents
能分别和同时检测一氧化氮和二氧化硫的单分子荧光探针 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种能分别和同时检测一氧化氮和二氧化硫的单分子荧光探针，它具有如式SNO所示的化学结构。本发明构建了一种基于FRET机理的能够分别和同时检测NO和SO2的荧光探针SNO，该探针具有较低的检测限，较高的灵敏度，良好的选择性。该探针实现了H9C2细胞内NO和SO2的分别和同时检测，并可应用该探针检测了缺血再灌注损伤H9C2细胞中NO和SO2的水平变化，发现了NO和SO2水平均升高。本荧光探针SNO为生物体内NO和SO2的研究提供一种高灵敏度、高选择性、无创的可视化方法，有助于探索NO和SO2的串联机制。
Description
技术领域
本发明属于化学和生物检测领域，具体涉及一种能够分别和同时检测一氧化氮和二氧化硫的单分子荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
一氧化氮(Nitric oxide,NO)是第二种内源性气体信号分子，也是一种重要的内源性神经递质和介质。在免疫系统、神经系统和血管系统中发挥着重要作用。与NO一样，二氧化硫(Sulfur dioxide,SO2)在心血管系统中也是一种内源性的气体信号分子，在心血管疾病中发挥着重要作用。哺乳动物体内可能存在内源性NO和SO2的串扰，SO2可以通过调节eNOS-NO-cGMP途径，参与高血压、内皮功能障碍、动脉粥样硬化等疾病的发生发展。然而关于这些小分子之间的相互作用，尚未阐明。
鉴于NO在生物学领域的重要性，研究NO的产生和运转仍是一个活跃的研究领域。然而该领域进展的一个主要限制是缺乏选择性的工具来成像生物体内的NO。由于低浓度、快速扩散、高反应性以及各种生物分子和其它活性氧氮物种的干扰，活细胞或组织中内源性NO的检测面临着许多挑战，包括灵敏度和选择性有待提高。目前NO荧光探针在活细胞和组织的检测和成像方面也取得了许多显著的进展，但也存在一些局限性，如氧化剂和抗氧化剂的检测干扰、探针自身的荧光、生理条件下探针的pH敏感性和响应时间较长。
基于内源性SO2在生理和病理生理过程中的重要作用，近年来，报道了多种检测SO2及其衍生物(HSO3 -和SO3 2-)的方法，包括电化学、滴定法、色谱法和流动注射分析法、分光光度法和荧光探针法。但是这些SO2检测方法存在许多缺点，如操作复杂、对生物样品有害、成本高、灵敏度低、难以实时监测生物体内SO2含量等。荧光探针因其快速、低损伤、高选择性、高灵敏度、低成本、无创检测、生物相容性好等优点，被广泛应用于细胞中SO2的研究，但是目前报道的诸多与SO2相关的探针，仍存在激发或发射波长较短而不利于组织或体内成像、信噪比低、穿透深度不够、时空成像分辨率不高等问题，内源性SO2探针的开发仍面临许多挑战。
NO和SO2在多种组织和脏器中共存，两种气体信号分子之间存在着密切的联系，在多种疾病中存在着串联机制，例如SO2可以通过增强离体主动脉环对NO的血管舒张反应，增加主动脉组织的NO水平，增加血管舒张；SO2处理可以逆转p-eNOS的下调，通过增加NO浓度来改善D-gal诱导的内皮功能障碍；SO2也可以通过调节NO/NOS途径产生抗动脉粥样硬化作用；而外源性SO2预处理可以通过下调NO/iNOS通路，显著降低I/R诱导的心肌损伤等。然而要阐明NO和SO2之间的具体的串联机制需要建立准确可靠的检测方法。荧光探针通过对其特定分析物的高灵敏度检测，已经大大提高了人们对生物系统中这些小分子的认识。许多最相关的生物学问题与多个小分子的相互作用有关，但应用于生物系统的小分子探针大多数都只能检测单个分析物。
目前虽然已经开发了许多用于检测NO和用于检测SO2的荧光探针，也取得了许多进展。但是目前尚没有能分别和同时识别NO和SO2的荧光探针报道。虽然可以使用多个荧光探针，但这种方法存在一些缺陷，例如，两个探针同时存在时易发生干扰使得获得的信息容易混淆且不准确；由于不同探针具有不同的吸收、定位和代谢方式，会影响检测的准确性，不适合定量分析等。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种能够分别和同时检测一氧化氮和二氧化硫的单分子荧光探针及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一种能分别和同时检测一氧化氮和二氧化硫的单分子荧光探针，它具有如式SNO所示的化学结构，
本发明进一步提供了式SNO化合物的化学合成路线，具体如下：
在制备方法中，以4-二乙氨基酮酸为起始原料，与3-(1-哌嗪基)苯酚反应合成式C1化合物；式C1化合物与式B1化合物7-羟基-3-羧基香豆素反应，生成式CC2化合物；式CC2化合物与1,2-苯二胺在草酰氯作用下缩合反应生成式CC4化合物；式CC4化合物和乙酰丙酸进行缩合反应生成式SNO化合物。
在一种优选方案中，2,4-二羟基苯甲醛和米氏酸在乙醇中回流反应制备式B1化合物7-羟基-3-羧基香豆素，其制备路线如下：
在一种优选方案中，4-二乙氨基酮酸与3-(1-哌嗪基)苯酚在三氟乙酸中，加热反应，制备式C1化合物。
在一种优选方案中，式C1化合物与式B1化合物，以及HOBt和EDCI在DMF中反应，得到式CC2化合物。
在一种优选方案中，式CC2化合物在二氯甲烷中，先加入草酰氯进行反应；然后缓慢加入含有1，2-苯二胺和三乙胺的二氯甲烷溶液反应，得到式CC4化合物。
在一种优选方案中，式CC4化合物与乙酰丙酸、DCC和DMAP在二氯甲烷中回流反应，生成式SNO化合物。
本发明指的加热是指通过常规的加热手段将相关反应体系加热至常温以上、溶剂沸点以下。
本发明指的回流反应是指常规的加热手段使反应液中的一种或多种溶剂蒸发并冷凝回流回反应液的过程，其温度一般在常温以上、溶剂沸点以下。
本发明的式SNO化合物可以应用在对细胞或机体内的一氧化氮和/或二氧化硫进行检测的方面。
本发明的式SNO化合物可以应用在制备检测细胞或机体内一氧化氮和/或二氧化硫的试剂或设备等方面。
本发明的有益效果：
本发明构建了一种基于荧光共振能量转移(FRET)机理的能够分别和同时检测NO和SO2的荧光探针SNO，该探针具有较低的检测限，较高的灵敏度，良好的选择性。该探针实现了H9C2细胞内NO和SO2的分别和同时检测，并可应用该探针检测了缺血再灌注损伤H9C2细胞中NO和SO2的水平变化，发现了NO和SO2水平均升高。本荧光探针SNO为生物体内NO和SO2的研究提供一种高灵敏度、高选择性、无创的可视化方法，有助于探索NO和SO2的串联机制，特别是可以应用该探针检测心肌缺血性再灌注损伤细胞中SO2和NO水平的变化，为缺血性再灌注损伤等心血管疾病中SO2和NO的细胞串联情况提供有效的检测方法。
附图说明
图1为探针SNO与NO反应后的紫外吸收光谱。图中，在300nm处自上而下分别为probe，probe+DEA·NONOate，CC3；
图2为探针SNO与SO2反应后的紫外吸收光谱。图中，在300nm处自上而下分别为CC4，probe，probe+Na2SO3；
图3为探针SNO与NO和SO2反应后的紫外吸收光谱。图中，在300nm处自上而下分别为probe，probe+Na2SO3+DEA·NONOate，CC2；
图4为探针SNO(10μM)与不同浓度DEA·NONOate(0-200μM)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4,20％CH3CN)孵育30min的荧光响应强度变化；
图5为探针SNO与NO孵育不同时间的荧光光谱；
图6为pH对SNO与NO反应的影响；
图7为探针SNO对NO的选择性；
图8为探针SNO对NO的选择性；
图9为探针SNO对NO的选择性；
图10为探针SNO对NO的选择性；
图11为探针SNO(10μM)与不同浓度Na2SO3在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,20％CH3CN)孵育20min的荧光响应；
图12为探针SNO与SO2孵育不同时间的荧光光谱；
图13为pH对SNO与SO2反应的荧光光谱影响；
图14为探针SNO对SO2的选择性；
图15为探针SNO对SO2的选择性；
图16为探针SNO对SO2的选择性；
图17为探针SNO对SO2的选择性
图18为探针SNO(10μM)与Na2SO3(100μM)和不同浓度的DEA·NONOate在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,20％CH3CN)孵育30min后的荧光响应变化(λex＝360nm)；
图19为探针SNO对细胞存活率的影响；
图20是探针SNO检测NO的荧光成像；
图21是图20所对应的细胞明场图；
图22为SNO检测内源性NO的荧光成像；
图23为图22所对应的细胞明场图；
图24为探针SNO检测SO2的荧光成像；
图25为图24所对应的细胞明场图；
图26为SNO检测内源性SO2的荧光成像；
图27为图26所对应的细胞明场图；
图28为探针SNO同时检测NO和SO2的荧光成像；
图29为缺氧复氧时间对细胞存活率的影响；
图30为探针SNO在缺血再灌注损伤H9C2细胞内的荧光成像。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的内容做进一步说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下各实施例。
溶液的配置
探针溶液的配制：称取探针SNO(8.3mg，0.01mmol)，溶解于乙腈(10mL)中，配置成1mM的探针溶液。
Na2SO3储备液的配制(作为SO2的来源)：称取Na2SO3(12.6mg，0.1mmol)用离子水(10mL)溶解，配置成浓度为10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM-100μM的溶液备用。
DEA·NONOate储备液的配制(作为NO的来源)：将DEA·NONOate(15.5mg，0.1mmol)溶于0.01M氢氧化钠溶液(10mL)中，配置成浓度为10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM-100μM的溶液备用。
Na2S储备液的配制：称取Na2S·9H2O(24.0mg，0.1mmol)，在氮气保护下，溶解于10mL的去离子水中，配置成10mM Na2S储备液，再将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。
Na2S2储备液的配制：称取Na2S2(11.0mg，0.1mmol)，在氮气保护下，溶解在10mL的去离子水中，配置成浓度为10mM的Na2S2储备液，再将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。
Na2S4储备液的配制：称取Na2S4(17.4mg，0.1mmol)，在氮气保护下，溶解在10mL的去离子水中配置成浓度为10mM的Na2S4储备液，再将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。
谷胱甘肽(GSH)储备液的配制：称取GSH(30.7mg，0.1mmol)，溶解在去离子水(10mL)中，配置成浓度为10.0mM的储备液，再将储备液稀释成1.0mM和10mM的溶液备用。
L-半胱氨酸(L-Cys)储备液的配制：称取Cys(12.1mg，0.1mmol)溶解在去离子水(10mL)中，配置成浓度为10.0mM的储备液，再将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。
同型半胱氨酸(Hcy)储备液的配制：称取Hcy(13.5mg，0.1mmol)溶解在去离子水(10mL)中，配置成浓度为10.0mM的储备液，再将储备液稀释成1.0mM和100μM的溶液备用。
其它物质(GSSG，S8，Na2S2O3，CH3SSSCH3，Na2SO4，Na2S2O3，NaHSO3等)储备液配制方法同上。
H2O2；ClO-；tBuOOH；·OH；1O2；O2 .-；NO2 -；ONOO-；NO,NO3 -；Na+；K+；Cu2+；Ca2+；Mg2+；Zn2+；Fe3+；Fe2+；CO3 2-；HCO3 -；Cl-；I-；HPO4 2-；H2PO4 -；Arg；Glu；Gly；His；Lys；Phe；Thr；Trp；Tyr；Ala；L-AA都以双蒸水做溶剂。
细胞种属和品系：大鼠心肌细胞H9C2。
实施例1、探针的合成
采用以下方法路线合成探针SNO。
A、7-羟基-3-羧基香豆素的合成
将2,4-二羟基苯甲醛(1.38g，10mmol)溶于乙醇(20mL)中，加入米氏酸(1.44g，10mmol)，回流反应3h。反应完毕后，冷却至室温，过滤，得到浅黄色固体1.95g，产率为95％。
B、化合物C1的合成
将4-二乙氨基酮酸(3.13g,10mmol)溶解在三氟乙酸(20mL)中，加入3-(1-哌嗪基)苯酚(1.78g,10mmol)，在氮气条件下，加热回流8h。反应完毕后，减压浓缩得到红色固体C1为3.27g，产率72％。
C、化合物CC2的合成
将化合物C1(456.5mg，1mmol)溶于DMF(20mL)中，加入7-羟基-3-羧基香豆素(206.1mg,1mmol)，HOBt(135.1mg,1mmol)，EDCI(191.7mg,1mmol)，然后在氮气保护下，回流反应8h。反应完毕后，用水洗涤(30mL)，乙酸乙酯(3×30mL)萃取，减压浓缩得到红色固体CC2为322.3mg，产率为50％。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.11(t,J＝4.0Hz,1H),7.82(s,1H),7.59(t,J＝4.0Hz,2H),7.17-7.14(m,2H),6.90-6.84(m,2H),6.78-6.65(m,3H),6.50-6.46(m,3H),3.86-3.78(m,2H),3.60-3.53(m,2H),3.48-3.38(m,8H),1.17(t,J＝8.0Hz,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ170.46,164.95,164.23,159.02,156.33,155.27,154.77,153.91,152.15,145.24,132.75,132.38,130.48,130.18,129.78,127.43,126.19,118.17,115.03,112.90,112.15,110.75,110.33,109.19,102.84,100.72,96.89,48.04,47.23,46.55,45.14,42.00,12.64.
D、化合物CC4的合成
将化合物CC2(644.7mg，1mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，在0℃下滴加草酰氯(380.7mg，3mmol)，室温反应4h，反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得到红色固体。将1，2-苯二胺(108.4mg，1mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，加入三乙胺(303.5mg，3mmol)，然后在0℃下缓慢滴加得到的红色固体，反应0.5h。粗品通过柱层析色谱法纯化(DCM:MeOH，100:1v/v)，得到白色固体CC4为374.2mg，产率为51％。
1H NMR(400MHz,C3D6O):δ9.69(s,1H),7.99(s,1H),7.89-7.80(m,1H),7.61-7.53(m,3H),7.14-7.02(m,1H),6.89-6.78(m,4H),6.69-6.65(m,2H),6.59-6.43(m,3H),6.29-6.22(m,2H),6.08(d,J＝8.0Hz,1H),3.83-3.75(m,2H),3.61-3.55(m,2H),3.38-3.33(m,4H),3.27(d,J＝12.0Hz,4H),1.13-1.10(t,J＝8.0Hz,J＝4.0Hz,6H).13C NMR(100MHz,C3D6O):δ165.98,163.80,162.18,158.13,156.29,153.55,153.35,153.28,152.08,148.96,145.79,143.27,132.89,131.53,130.45,129.12,128.59,128.33,128.00,124.18,122.92,122.38,120.84,116.86,116.76,113.62,111.81,111.52,108.44,102.37,102.13,97.68,67.49,48.55,47.95,46.46,44.13,41.44,11.98。
E、探针SNO的合成
将化合物CC4(733.8mg，1mmol)溶于二氯甲烷(15mL)中，加入乙酰丙酸(174.1mg，1.5mmol)，DCC(309.8mg，1.5mmol)，DMAP(61.1mg，0.5mmol)，回流反应8h。反应完毕后，减压浓缩得到粗产物，粗产物通过快速色谱柱(DCM:MeOH，100:1v/v)纯化，得到淡黄色固体SNO457.5mg，产率为55％。
(M+H)+calculated for C49H46N5O8,832.3346；found,832.3344.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.02-8.00(m,1H),7.93(s,1H),7.58-7.52(m,3H),7.21-7.19(m,1H),7.16-7.15(m,1H),7.11-7.09(m,1H),6.95-6.91(m,1H),6.75-6.71(m,1H),6.63(d,J＝8.0Hz,1H),6.54-6.48(m,3H),6.41-6.26(m,3H),6.04(d,J＝8.0Hz,1H),3.88(t,J＝4.0Hz,2H),3.51-3.49(m,2H),3.32-3.23(m,8H),2.90-2.81(m,4H),2.22(s,3H),1.15-1.12(t,J＝8.0Hz,J＝4.0Hz,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ206.42,170.86,166.61,163.44,157.83,154.84,154.21,153.79,153.62,152.23,151.64,149.09,144.45,143.41,133.48,132.98,131.74,129.54,129.03,128.94,128.74,128.64,124.54,124.32,124.10,123.65,121.92,119.21,118.38,117.22,116.10,111.91,110.42,102.89,48.76,48.34,46.89,44.50,42.00,37.93,33.99,29.92,28.23,25.04,12.56。
实施例2、探针SNO识别NO和SO2
A、探针SNO识别NO的机理
探针SNO(8.3mg，0.01mmol)溶于CH3CN(2mL)中，加入溶有DEA·NONOate(31.0mg，0.2mmol)的PBS缓冲液(8mL，20.0mM，pH＝7.4)，混合物在37℃下反应30min。二氯甲烷(3×10mL)萃取，减压浓缩，将产物进行分离纯化后，利用高分辨质谱确认产物结构，以此判断探针SNO与NO的反应产物的正确性。
图1为探针SNO(10μM)，化合物CC3(20μM)和探针SNO(10μM)+DEA·NONOate(500μM)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)中孵育30min的的吸收光谱。结果如图1所示，探针SNO在370-600nm之间没有吸收峰；而探针SNO与DEA·NONOate反应完后在550nm处有最大紫外吸收峰，这与化合物CC3的紫外吸收峰基本一致，初步表明探针SNO与NO反应产生荧光的机制可能与预期相符。
B、探针SNO识别SO2的机理
探针SNO(8.3mg，0.01mmol)溶于CH3CN(2mL)中，加入Na2SO3(25.2mg，0.2mmol)，再加入8mL的PBS缓冲液(20.0mM，pH＝7.4)，混合物在37℃下反应30min。二氯甲烷(3×10mL)萃取，减压浓缩，将产物进行分离纯化后，利用高分辨质谱确认产物结构，以此判断探针SNO与SO2的反应产物的正确性。
图2为探针SNO(10μM)，化合物CC4(20μM)和探针SNO(10μM)+Na2SO3(500μM)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)中孵育30min的吸收光谱。从图2可以看出，探针SNO与Na2SO3反应完后在394nm处有最大紫外吸收峰，这与化后物CC4在394nm处的最大紫外吸收峰一致，初步表明探针SNO与SO2反应产生荧光的机制可能与预期相符。
C、探针SNO同时识别NO和SO2的机理
探针SNO(8.3mg，0.01mmol)溶于CH3CN(2mL)中，加入溶有DEA·NONOate(31.0mg，0.2mmol)和Na2SO3(25.2mg，0.2mmol)的PBS缓冲液(8mL，20.0mM，pH＝7.4)，混合物在37℃下反应30min。二氯甲烷(3×10mL)萃取，减压浓缩，将产物进行分离后，利用高分辨质谱确认产物结构，以此判断探针SNO与NO和SO2的反应产物的正确性。
图3为探针SNO(10μM)，化合物CC2(20μM)和探针SNO(10μM)+DEA·NONOate(500μM)和Na2SO3(500μM)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)中孵育30min的吸收光谱。从图3可以看出，探针SNO与DEA·NONOate和Na2SO3反应完后在550nm的最大紫外吸收峰与化合物CC2在550nm处的最大紫外吸收峰一致，初步表明探针SNO与SO2和NO反应产生荧光的机制可能与预期相符。
实施例3、荧光光谱的测定
将探针SNO溶解在CH3CN溶液中，DEA·NONOate(2-(N,N-二乙基氨基)-二氮烯-2-氧-钠盐水合物，作为NO来源)和Na2SO3(作为SO2来源)为被检测物质，配制成需要的浓度(如DEA·NONOate的浓度为10mM，Na2SO3的浓度为10mM)与探针SNO混合，PBS缓冲液(pH 7.4，20mM)制备待测溶液，其中水相占比80％，有机相占比20％。最后将配置好的溶液放于37℃孵育一段时间后，将其倒入石英比色皿中，利用荧光分光光度计测定荧光强度。
其中把未含分析物的溶液作为空白对照。每组数据至少平行测定三次，结果以mean±SD表示。荧光分光光度计测试条件：对于探针SNO与SO2的反应，激发波长设置为360nm，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度都设置为10nm，扫描速度设置为1200nm/min，发射光谱范围设置在400-700nm。光电倍增管的电压设为550V；对于探针SNO与NO的反应，激发波长设置为520nm，激发狭缝宽度、发射狭缝宽度、扫描速度、发射光谱范围及光电倍增管的电压同上；对于探针SNO与NO和SO2同时存在时的反应，激发波长设置为360nm，激发狭缝宽度、发射狭缝宽度、扫描速度、发射光谱范围及光电倍增管的电压同上。
实施例4、荧光探针SNO与DEA·NONOate反应的线性关系以及检测限
重复测定每个样品的荧光发射光谱10次，并计算其荧光强度的标准偏差。将探针SNO与不同浓度的DEA·NONOate或Na2SO3孵育，求得荧光强度与浓度之间的线性方程。利用计算公式为：3σ/k，求得探针的检测限。其中k为DEA·NONOate或Na2SO3浓度与荧光强度线性方程的斜率，σ为空白样的标准偏差。
首先，将探针SNO与不同浓度的DEA·NONOate(0-200μM)孵育，研究荧光强度与DEA·NONOate浓度之间的关系。如图4所示，在未加入DEA·NONOate孵育之前，探针SNO几乎无荧光；而当探针SNO与不同浓度的DEA·NONOate(0-200μM)孵育后，在575nm处的荧光强度随着DEA·NONOate浓度的增加而逐渐增强，可达220倍。同时，荧光强度与0-1μM DEA·NONOate呈现出良好的线性关系。在PBS缓冲液中，探针SNO检测NO的检测限为8nM。结果表明探针SNO具有较高的检测灵敏度，有利于生物体内NO的定量检测。
图4为探针SNO(10μM)与不同浓度DEA·NONOate(0-200μM)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4,20％CH3CN)孵育30min的荧光响应强度变化；图4中，A为SNO(10μM)与不同浓度的DEA·NONOate(0-200μM,0μM,0.2μM,0.4μM,0.8μM,1μM,2μM,4μM,6μM,8μM,10μM,-20μM,30μM,40μM,50μM,60μM,70μM,80μM,90μM,100μM,200μM)孵育后的荧光光谱；B为SNO(10μM)与不同浓度DEA·NONOate(0-200μM)孵育30min后荧光强度的变化；(C)荧光强度与DEA·NONOate浓度(0-1μM)之间的线性关系(λex＝520nm)。
实施例5、荧光探针SNO与DEA·NONOate的反应时间
在上述实施例的基础上，探讨探针SNO的最佳反应时间。
结果如图5所示，将探针SNO与DEA·NONOate(200μM)孵育不同的时间，30min荧光强度达到峰值，说明30min左右探针与DEA·NONOate(200μM)基本反应完全。另外，所产生的荧光强度也较稳定，将孵育至60min后，荧光强度没有明显减弱。上述结果提示，探针SNO与DEA·NONOate产生的荧光响应，具有良好的稳定性，适合长时间成像。
图5为探针SNO与NO孵育不同时间的荧光光谱；图5中，A为SNO(10μM)和DEA·NONOate(200μM)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)，在37℃下分别孵育0,5,10,20,30和60min的荧光光谱(λex＝520nm)；B为在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)中，SNO(10μM)与DEA·NONOate(200μM)在37℃下孵育的荧光强度随时间的变化(λex＝520nm)。
实施例6、测定pH对荧光探针SNO与DEA·NONOate反应的影响
测定pH对荧光探针SNO与DEA·NONOate反应的影响，将探针与DEA·NONOate(200μM)在不同pH的缓冲液中进行孵育。结果如图6所示。探针与DEA·NONOate在pH 4.0时荧光强度最高，随着pH值的增加荧光强度逐渐减弱。推测可能是由于带有羧基的产物对pH的变化较为敏感，pH值低的时候酸性强，给质子能力越强，从而有利于生成产物的共轭结构，导致荧光更强。但是在生理条件(pH 7.4)下，探针与DEA·NONOate反应基本没有影响，因此探针SNO适用于生理条件下NO的检测。
图6为pH对SNO与NO反应的影响；图6中，A为SNO(10μM)和DEA·NONOate(200μM)在不同pH的PBS缓冲液(20mM,pH 4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.4,7.5,8.0,8.5,9.0,20％CH3CN)37℃下孵育30min的荧光谱图(λex＝520nm)；B为SNO(10μM)和DEA·NONOate(200μM)在37℃下孵育30min的荧光强度随不同pH的变化(λex＝520nm)。
实施例7、荧光探针SNO检测DEA·NONOate的选择性
探针对检测物具有高度的选择性，是实现准确检测的重要前提。为了检验探针SNO对NO的选择性，(RSS，包括GSH；Hcy；Cys；GSSG；CH3SSSCH3；S2O3 2-；SO4 2-；Na2S；Na2S4；Na2S2；S8；S2O4 2-)、活性氧(ROS，包括H2O2；OCl-；tBuOOH；·OH；1O2；O2 -；)、活性氮(RNS，包括NO3 -；NO2 -；ONOO-)及无机盐离子(Na+；Mg2+；Ca2+；K+；Al3+；Fe3+；F-；I-；Cl-；H2PO4 -；CO3 2-；Fe2+；HPO4 2-；HCO3 -；Zn2+；Br-；Cu2+)及氨基酸(Val；Trp；Tyr；Lys；Phe；Pro；His；Ser；Arg；Gly；Thr；Ala)及其它干扰物(L-AA；DHA；MGO)孵育30min后测定荧光强度。探针只有与DEA·NONOate孵育会产生较强的荧光响应，但与其它物质几乎不发生反应。具体见图7-10。上述实验结果表明，探针SNO对NO具有良好的选择性而不受其它物质的干扰。
图7为探针SNO对NO的选择性；图7中，A为SNO(10μM)与DEA·NONOate(200μM)和ROS(blank；100μM H2O2；100μM ClO-；100μM tBuOOH；100μM·OH；100μM 1O2；100μM O2 .-；100μMNO3 -；100μM NO2 -；100μM ONOO-；1mM L-AA；1mM DHA；1mM MGO)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)中于37℃孵育30min的荧光光谱(λex＝520nm)。B为SNO与DEA·NONOate(200μM)和ROS孵育30min，红色代表SNO在575nm处与ROS的荧光强度，黑色代表SNO在575nm处与ROS和200μM DEA·NONOate的混合物的荧光强度。1.Blank+DEA·NONOate(200μM)；2.H2O2(100μM)+DEA·NONOate(200μM)；3.ClO-(100μM)+DEA·NONOate(200μM)；4.tBuOOH(100μM)+DEA·NONOate(200μM)；5.·OH(100μM)+DEA·NONOate(200μM)；6.1O2(100μM)+DEA·NONOate(200μM)；7.O2 .-(100μM)+DEA·NONOate(200μM)；8.NO3 -(100μM)+DEA·NONOate(200μM)；9.NO2 -(100μM)+DEA·NONOate(200μM)；10.ONOO-(100μM)+DEA·NONOate(200μM)；11.L-AA(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；12.DHA(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；13.MGO(1mM)+DEA·NONOate(200μM)(λex＝520nm)。
图8为探针SNO对NO的选择性；图8中，A为探针SNO(10μM)与DEA·NONOate(200μM)和RSS(blank；1mM GSH；100μM Hcy；1mM Cys；10mM GSH；1mM GSSG；100μM CH3SSSCH3；500μMS2O3 2-；500μM SO4 2-；100μM Na2S；100μM Na2S4；100μM Na2S2；500μM S8；500μM S2O4 2-；500μMSO3 2-；500μM HSO3 -)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)中于37℃孵育30min的荧光光谱(λex＝520nm)。B为SNO与DEA·NONOate(200μM)和RSS孵育20min，红色代表SNO在575nm处与RSS的荧光强度，黑色代表SNO在575nm处与RSS和200μM DEA·NONOate的混合物的荧光强度。1.Blank+DEA·NONOate(200μM)；2.GSH(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；3.Hcy(100μM)+DEA·NONOate(200μM)；4.Cys(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；5.GSH(10mM)+DEA·NONOate(200μM)；6.GSSG(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；7.CH3SSSCH3(100μM)+DEA·NONOate(200μM)；8.S2O3 2-(500μM)+DEA·NONOate(200μM)；9.SO4 2-(500μM)+DEA·NONOate(200μM)；10.Na2S(100μM)+DEA·NONOate(200μM)；11.Na2S4(100μM)+DEA·NONOate(200μM)；12.Na2S2(100μM)+DEA·NONOate(200μM)13.S8(500μM)+DEA·NONOate(200μM)；14.S2O4 2-(500μM)+DEA·NONOate(200μM)；15.SO3 2-(500mM)+DEA·NONOate(200μM)；16.HSO3 -(500μM)+DEA·NONOate(200μM)(λex＝520nm)。
图9为探针SNO对NO的选择性；图9中，A为SNO(10μM)与DEA·NONOate(200μM)和无机盐离子(blank；1mM Na+；1mM Mg2+；1mM Ca2+；1mM K+；1mM Al3+；1mM Fe3+；1mM F-；1mM I-；1mM Cl-；1mM H2PO4 -；1mM CO3 2-；1mM Fe2+；1mM HPO4 2-；1mM HCO3 -；1mM Zn2+；1mM Br-；1mM Cu2 +)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)中于37℃孵育30min的荧光光谱(λex＝520nm)。B为SNO与DEA·NONOate(200μM)和无机盐离子孵育30min，红色代表SNO在575nm处与无机盐离子的荧光强度，黑色代表SNO在575nm处与无机盐离子和200μMDEA·NONOate的混合物的荧光强度。1.Blank+DEA·NONOate(200μM)；2.Na+(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；3.Mg2+(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；4.Ca2+(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；5.K+(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；5.Al3+(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；7.Fe3+(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；8.F-(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；9.I-(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；10.Cl-(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；11.H2PO4 -(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；12.CO3 2-(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；13.Fe2+(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；14.HPO4 2-(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；15.HCO3 -(1mM)+DEA·NONOate(200μM)16.Zn2+(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；17.Br-(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；18.Cu2+(1mM)+DEA·NONOate(200μM)(λex＝520nm)。
图10为探针SNO对NO的选择性；图10中，A为SNO(10μM)与DEA·NONOate(200μM)和氨基酸(blank；1mM Val；1mM Trp；1mM Tyr；1mM Lys；1mM Phe；1mM Pro；1mM His；1mM Ser；1mM Arg；1mM Gly；1mM Glu；1mM Thr；1mM Ala)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)中于37℃孵育30min的荧光光谱(λex＝520nm)。B为SNO与DEA·NONOate(200μM)和氨基酸孵育30min，红色代表SNO在575nm处与氨基酸的荧光强度，黑色代表SNO在575nm处与氨基酸和200μM DEA·NONOate的混合物的荧光强度。1.Blank+DEA·NONOate(200μM)；2.Val(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；3.Trp(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；4.Tyr(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；5.Lys(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；6.Phe(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；7.Pho(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；8.His(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；9.Ser(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；10.Arg(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；11.Gly(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；12.Glu(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；13.Arg(1mM)+DEA·NONOate(200μM)；14.Arg(1mM)+DEA·NONOate(200μM)(λex＝520nm)。
实施例8、荧光探针SNO与Na2SO3反应的线性关系以及检测限
本例考察了探针SNO对生物样本中的SO2的定量检测，将探针SNO与0-200μM的Na2SO3进行孵育，并研究了荧光强度与不同浓度的Na2SO3之间的关系。结果如图11所示，在未加入Na2SO3孵育之前，探针SNO几乎没有荧光；但是当探针SNO与0-200μM的Na2SO3进行孵育后，发现在450nm处，随着Na2SO3浓度的增加，荧光强度也显著增强，在0-10μM范围内Na2SO3的浓度与荧光强度存在一定的线性关系，在PBS缓冲液中，探针SNO检测SO2的检测限为449nM。说明探针SNO对Na2SO3的检测灵敏，可用于复杂生物体内SO2水平的定量检测。
图11为探针SNO(10μM)与不同浓度Na2SO3(0-200μM；0μM,1μM,2μM,4μM,6μM,8μM,10μM,20μM,30μM,40μM,50μM,60μM,70μM,80μM,90μM,100μM,200μM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,20％CH3CN)孵育20min的荧光响应；图11中，A为探针SNO(10μM)与不同浓度的Na2SO3(0-200μM)孵育后的荧光光谱；B为SNO(10μM)与不同浓度Na2SO3(0-200μM)孵育后荧光强度的变化；C为荧光强度与Na2SO3浓度(0-10μM)之间的线性关系(λex＝360nm)。
实施例9、荧光探针SNO与Na2SO3的反应时间
将探针SNO与Na2SO3(200μM)孵育不同的时间，发现在20min左右可以荧光强度达到平台期，表明探针与Na2SO3(200μM)的最佳反应时间在20min左右。另外，将探针SNO与Na2SO3孵育至60min后，荧光强度也几乎没有降低。上述结果说明探针SNO具有良好的稳定性，适合长时间成像。
图12中，(A)SNO(10μM)和Na2SO3(200μM)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)，在37℃下分别孵育0,5,10,20,30,40和60min的荧光光谱(λex＝360nm)；(B)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)中，SNO(10μM)与Na2SO3(200μM)在37℃下孵育的荧光强度随时间的变化(λex＝360nm)。
实施例10、pH对荧光探针SNO与Na2SO3反应的影响
为了探讨探针SNO能否在生理条件(pH 7.4)下检测NO，本例将探针与Na2SO3在不同pH的PBS缓冲液中进行孵育。探针与Na2SO3在pH 4.0-6.0时，几乎未见荧光响应；当溶液pH高于6时，随着pH值的增加荧光强度逐渐增强。当溶液pH>8时，探针本身也产生一定的荧光强度，这可能是由于探针中的乙酰丙酸基团的酯键在碱性条件下水解造成的。但是，在生理条件下(pH 7.4)，探针没有荧光响应，不会分解；而且探针与SO2也有较强的荧光响应。因此，说明探针SNO可以用于生理条件下SO2的检测。
图13为pH对SNO与SO2反应的荧光光谱影响；图13中，(A)SNO(10μM)和Na2SO3(200μM)在不同pH的PBS缓冲液(20mM,pH 4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.4,7.5,8.0,8.5,9.0,20％CH3CN)37℃下孵育20min的荧光光谱(λex＝360nm)。(B)SNO(10μM)和Na2SO3(200μM)在37℃下孵育20min的荧光强度随pH的变化(λex＝360nm)。
实施例11、荧光探针SNO检测Na2SO3的选择性
为了检验探针SNO能否特异性检测SO2而不受其它物质干扰，本例进行了如下实验，将探针分别与活性硫(RSS，包括GSH；Hcy；Cys；GSSG；CH3SSSCH3；S2O3 2-；SO4 2-；Na2S；Na2S4；Na2S2；S8；S2O4 2-)、活性氧(ROS，包括H2O2；OCl-；tBuOOH；·OH；1O2；O2 -；)、活性氮(RNS，包括NO3 -；NO2 -；NO；ONOO-)及无机盐离子(Na+；Mg2+；Ca2+；K+；Al3+；Fe3+；F-；I-；Cl-；H2PO4 -；CO3 2-；Fe2 +；HPO4 2-；HCO3 -；Zn2+；Br-；Cu2+)及氨基酸(Val；Trp；Tyr；Lys；Phe；Pro；His；Ser；Arg；Gly；Thr；Ala)及其它干扰物(L-AA；DHA；MGO)孵育20min后测定荧光强度。结果发现探针仅与Na2SO3孵育才会产生较强的荧光响应，与其它物质几乎不响应(图14-17)。因此可以说明，探针SNO对SO2具有良好的选择性，可以特异性检测SO2。
图14为探针SNO对SO2的选择性；图14中，(A)探针SNO(10μM)与Na2SO3(200μM)和RSS(blank；1mM GSH；100μM Hcy；1mM Cys；10mM GSH；1mM GSSG；100μM CH3SSSCH3；500μM S2O3 2-；500μM SO4 2-；100μM Na2S；100μM Na2S4；100μM Na2S2；500μM S8；500μM S2O4 2-)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)中于37℃孵育20min的荧光光谱(λex＝360nm)。(B)SNO与Na2SO3(200μM)和RSS孵育20min，红色代表SNO在450nm处与RSS的荧光强度，黑色代表SNO在450nm处与RSS和200μM Na2SO3的混合物的荧光强度。1.Blank+Na2SO3(200μM)；2.GSH(1mM)+Na2SO3(200μM)；3.Hcy(100μM)+Na2SO3(200μM)；4.Cys(1mM)+Na2SO3(200μM)；5.GSH(10mM)+Na2SO3(200μM)；6.GSSG(1mM)+Na2SO3(200μM)；7.CH3SSSCH3(100μM)+Na2SO3(200μM)；8.S2O3 2-(500μM)+Na2SO3(200μM)；9.SO4 2-(500μM)+Na2SO3(200μM)；10.Na2S(100μM)+Na2SO3(200μM)；11.Na2S4(100μM)+Na2SO3(200μM)；12.Na2S2(100μM)+Na2SO3(200μM)13.S8(500μM)+Na2SO3(200μM)；14.S2O4 2-(500μM)+Na2SO3(200μM)(λex＝360nm)。
图15为探针SNO对SO2的选择性。图15中(A)SNO(10μM)与Na2SO3(200μM)和ROS(blank；100μM H2O2；100μM ClO-；100μM tBuOOH；100μM·OH；100μM 1O2；100μM O2 .-；100μMNO3 -；100μM NO2 -；100μM NO；100μM ONOO-；1mM L-AA；1mM DHA；1mM MGO)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)中于37℃孵育30min的荧光光谱(λex＝360nm)。(B)SNO与Na2SO3(200μM)和ROS孵育20min，红色代表SNO在450nm处与ROS的荧光强度，黑色代表SNO在450nm处与ROS和200μM Na2SO3的混合物的荧光强度。1.Blank+Na2SO3(200μM)；2.H2O2(100μM)+Na2SO3(200μM)；3.ClO-(100μM)+Na2SO3(200μM)；4.tBuOOH(100μM)+Na2SO3(200μM)；5.·OH(100μM)+Na2SO3(200μM)；6.1O2(100μM)+Na2SO3(200μM)；7.O2 .-(100μM)+Na2SO3(200μM)；8.NO3 -(100μM)+Na2SO3(200μM)；9.NO2 -(100μM)+Na2SO3(200μM)；10.NO(100μM)+Na2SO3(200μM)；11.ONOO-(100μM)+Na2SO3(200μM)；12.L-AA(1mM)+Na2SO3(200μM)；13.DHA(1mM)+Na2SO3(200μM)；14.MGO(1mM)+Na2SO3(200μM)(λex＝360nm)。
图16为探针SNO对SO2的选择性。图16中，(A)SNO(10μM)与Na2SO3(200μM)和无机盐离子(blank；1mM Na+；1mM Mg2+；1mM Ca2+；1mM K+；1mM Al3+；1mM Fe3+；1mM F-；1mM I-；1mMCl-；1mM H2PO4 -；1mM CO3 2-；1mM Fe2+；1mM HPO4 2-；1mM HCO3 -；1mM Zn2+；1mM Br-；1mM Cu2+)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)中于37℃孵育20min的荧光光谱(λex＝360nm)。(B)SNO与Na2SO3(200μM)和无机盐离子孵育20min，红色代表SNO在450nm处与无机盐离子的荧光强度，黑色代表SNO在450nm处与无机盐离子和200μM Na2SO3的混合物的荧光强度。1.Blank+Na2SO3(200μM)；2.Na+(1mM)+Na2SO3(200μM)；3.Mg2+(1mM)+Na2SO3(200μM)；4.Ca2+(1mM)+Na2SO3(200μM)；5.K+(1mM)+Na2SO3(200μM)；5.Al3+(1mM)+Na2SO3(200μM)；7.Fe3+(1mM)+Na2SO3(200μM)；8.F-(1mM)+Na2SO3(200μM)；9.I-(1mM)+Na2SO3(200μM)；10.Cl-(1mM)+Na2SO3(200μM)；11.H2PO4 -(1mM)+Na2SO3(200μM)；12.CO3 2-(1mM)+Na2SO3(200μM)；13.Fe2+(1mM)+Na2SO3(200μM)；14.HPO4 2-(1mM)+Na2SO3(200μM)；15.HCO3 -(1mM)+Na2SO3(200μM)16.Zn2+(1mM)+Na2SO3(200μM)；17.Br-(1mM)+Na2SO3(200μM)；18.Cu2+(1mM)+Na2SO3(200μM)(λex＝360nm)。
图17为探针SNO对SO2的选择性。图17中，(A)SNO(10μM)与Na2SO3(200μM)和氨基酸(blank；1mM Val；1mM Trp；1mM Tyr；1mM Lys；1mM Phe；1mM Pro；1mM His；1mM Ser；1mMArg；1mM Gly；1mM Glu；1mM Thr；1mM Ala)在PBS缓冲液(20mM，pH＝7.4，20％CH3CN)中于37℃孵育20min的荧光光谱(λex＝360nm)。(B)SNO与Na2SO3(200μM)和氨基酸孵育20min，红色代表SNO在575nm处与氨基酸的荧光强度，黑色代表SNO在450nm处与氨基酸和200μMNa2SO3的混合物的荧光强度。1.Blank+Na2SO3(200μM)；2.Val(1mM)+Na2SO3(200μM)；3.Trp(1mM)+Na2SO3(200μM)；4.Tyr(1mM)+Na2SO3(200μM)；5.Lys(1mM)+Na2SO3(200μM)；6.Phe(1mM)+Na2SO3(200μM)；7.Pho(1mM)+Na2SO3(200μM)；8.His(1mM)+Na2SO3(200μM)；9.Ser(1mM)+Na2SO3(200μM)；10.Arg(1mM)+Na2SO3(200μM)；11.Gly(1mM)+Na2SO3(200μM)；12.Glu(1mM)+Na2SO3(200μM)；13.Arg(1mM)+Na2SO3(200μM)；14.Arg(1mM)+Na2SO3(200μM)(λex＝360nm)。
实施例12、荧光探针SNO与NO和SO2共同反应的荧光光谱
在探针SNO与NO和SO2分别反应的基础上，本例又继续探讨了探针SNO与NO和SO2共同反应的荧光强度变化。如18所示，先向探针SNO的溶液中加入溶有Na2SO3(100μM)的PBS缓冲液，再进一步向溶液中加入不同浓度的DEA·NONOate(0-400μM)，共同孵育30min。结果发现荧光强度在450nm处逐渐下降，在575nm处逐渐上升。由此可以说明，当NO和SO2同时存在时探针SNO的FRET过程开启，可用于生物体内NO和SO2的同时检测。
图18为探针SNO(10μM)与Na2SO3(100μM)和不同浓度的DEA·NONOate(0-400μM；0μM,30μM,80μM,100μM,160μM,200μM,260μM,360μM,400μM)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,20％CH3CN)孵育30min后的荧光响应变化(λex＝360nm)。
实施例13、MTT法测定探针SNO的细胞毒性
用含10％胎牛血清将对数期细胞配成细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL。放入细胞培养箱进行培养，等待细胞生长至对数期后，弃去培养液，加入不同浓度梯度的探针SNO进行孵育。将不加探针SNO的细胞作为对照组。孵育24h后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，用PBS缓冲液配置)，在37℃下继续培养4h。之后去除MTT溶液，每孔加入100μL的DMSO，放置摇床震荡10min后，充分溶解甲瓒结晶。最后用酶标仪测定490nm处的吸光度值。每组设定3复孔，测定三次，整个实验重复三次。
选用大鼠心肌细胞H9C2，将不同浓度的探针SNO(0μM,5μM,10μM,20μM,50μM)与H9C2细胞孵育24h。结果如图19所示，细胞存活率仍都在80％以上。之后，又将探针SNO(10μM)与H9C2细胞孵育0，6，12，18，24h后细胞存活率在90％以上。由此表明探针SNO对H9C2细胞的毒性小，几乎不会影响细胞的存活率。
图19为探针SNO对细胞存活率的影响。图19中，(A)H9C2细胞与探针SNO(0,5,10,20,50μM)孵育24h细胞的存活率。(B)H9C2细胞与探针SNO(10μM)孵育不同时间(0,6,12,18,24h)细胞的存活率。
实施例14、生理水平及细胞荧光成像
将H9C2细胞接种在含有10％的小牛血清、青霉素/链霉素(100μg/mL)的细胞培养液培养中，放于37℃、5％CO2培养箱中进行培养。等细胞生长到对数期时，用胰酶进行消化，接种在共聚焦专用皿中继续培养。
分为如下几组：(1)生理水平NO成像组：将探针SNO(终浓度10μM，1μL DMSO)与H9C2细胞孵育15min；(2)清除剂组：将细胞与2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-3-氧代-1-氧(PTIO，NO的清除剂，1mM，2μL生理盐水)孵育30min后，再与探针(终浓度10μM，1μL DMSO)孵育15min。(3)生理水平SO2成像组：将探针SNO(终浓度10μM，1μL DMSO)与H9C2细胞孵育15min；(4)清除剂组：将细胞与甲醛(FA，SO2的清除剂，终浓度500μM，1μL生理盐水)孵育30min后，再与探针(终浓度10μM，1μL DMSO)孵育15min。(5)外源性NO成像组：将探针SNO(终浓度10μM，1μL DMSO)与H9C2细胞孵育15min，然后加入DEA·NONOate(10μM，20μM，2μL生理盐水)孵育30min。成像前，用PBS缓冲液冲洗三次。(6)外源性SO2成像组：将探针SNO(终浓度10μM，1μL DMSO)与H9C2细胞孵育15min，然后加入Na2SO3(10μM，20μM，1μL DMSO)孵育30min。成像前，用PBS缓冲液冲洗三次。(7)外源性NO和SO2共同成像组：将探针SNO(终浓度10μM，1μL DMSO)与H9C2细胞孵育15min，然后加入DEA·NONOate(20μM，2μL生理盐水)和Na2SO3(20μM，1μL DMSO)孵育30min。成像前，用PBS缓冲液冲洗三次。(8)内源性NO成像组：将H9C2细胞与脂多糖(LPS，20μg/mL，1μL生理盐水)孵育12h后，再与探针SNO(10μM，1μL DMSO)孵育15min。成像前，用PBS缓冲液冲洗三次。抑制剂组：将H9C2细胞与L-NAME(200μM，1μL生理盐水)孵育30min后，再与脂多糖(20μg/mL，1μL生理盐水)孵育12h后，最后与探针SNO(10μM，1μL DMSO)孵育15min。成像前，用PBS缓冲液冲洗三次。(9)内源性SO2成像组：将H9C2细胞与谷胱甘肽(GSH，500μM，1μL生理盐水)和硫代硫酸钠(Na2S2O3，250μM，1μL生理盐水)孵育30min后，再与探针SNO(10μM，1μL DMSO)孵育15min。成像前，用PBS缓冲液冲洗三次。抑制剂组：将H9C2细胞与TNBS(500μM，2μL生理盐水)孵育1h后，再与谷胱甘肽(GSH，500μM，1μL生理盐水)和硫代硫酸钠((Na2S2O3，250μM，1μL生理盐水)孵育30min，最后与探针SNO(10μM，1μL DMSO)孵育15min。成像前，用PBS缓冲液冲洗三次。采用Leica STELLARIS 5激光共聚焦显微镜(63×油镜)进行拍照。
通道1的激发波长为405nm，发射波长范围为420-470nm；通道2的激发波长为405nm，发射波长范围为550-600nm；通道3的激发波长为514nm，发射波长范围为550-600nm。采用徕卡软件(Lecia)进行分析。所有数据均以mean±SD表示(n＝3)。
A、生理水平及外源性NO的细胞荧光成像
将探针SNO与细胞在37℃下孵育15min，细胞中有较弱的红色荧光出现(图20A)。为了探究图19A红色荧光的产生原因，将细胞提前30min给予PTIO(NO的清除剂，1mM)后，再与探针孵育，红色荧光基本消失(图20B)，说明图19A中的红色荧光是由细胞生理水平的NO引起。提示，探针SNO可检测生理水平的NO，检测灵敏度较高。之后，将探针与细胞孵育15min后，再给予不同浓度的DEA·NONOate(10μM，20μM)，细胞中的红色荧光显著增强(图20C及D)。将细胞与PTIO(1mM)孵育30min后，与探针孵育，再与DEA·NONOate(20μM)孵育30min，可见红色荧光显著降低(图20E)，说明细胞中的红色荧光是通过加入外源性的NO引起的。图21是图20所对应的细胞明场图，说明在共聚焦成像过程中，细胞形态正常。由此说明，探针SNO可以在活细胞中检测出生理水平的NO以及不同浓度的外源性NO。
图20是探针SNO检测NO的荧光成像。图20中(A)H9C2细胞与SNO(10μM)在37℃下孵育10min；(B)细胞用PTIO(1mM)预处理30min，然后与SNO(10μM)孵育15min；(C)将细胞与SNO(10μM)孵育15min，然后再与DEA·NONOate(10μM)孵育30min；(D)将细胞与SNO(10μM)孵育15min，然后再与DEA·NONOate(20μM)孵育30min；(E)将细胞提前30min给予PTIO(1mM)后，与探针孵育，再与DEA·NONOate(20μM)孵育30min；(F)以上图片(ABCDE)中细胞的平均荧光强度。###p<0.001vs.(A)column,***p<0.001vs.(D)column.
B、内源性NO的细胞荧光成像
本实验利用LPS来诱导内源性NO的产生。将H9C2细胞先与LPS孵育12h后，再与探针孵育15min，可以发现H9C2细胞中产生较强的红色荧光(图22A)。而将细胞用N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，iNOS合成酶的抑制剂)处理12h后，再与LPS和探针SNO孵育，红色荧光明显降低(图22B)。上述结果表明探针SNO可以实现细胞中内源性NO的荧光成像。
图22为SNO检测内源性NO的荧光成像。图22中，(A)将细胞与脂多糖(LPS，20μg/mL)预孵育12h，然后在37℃与SNO(10μM)进一步孵育15min；(B)将细胞与N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，200μM)预孵育12h，然后在37℃与LPS(20μg/mL)进一步孵育12h，然后与SNO(10μM)孵育15min；(C)以上图片(AB)中细胞的平均荧光强度。###p<0.001vs.(B)column.
C、生理水平及外源性SO2的细胞荧光成像
继续探讨探针对细胞中的SO2的荧光成像。如图24A所示，探针SNO与细胞孵育15min后出现微弱的蓝色荧光。而将细胞加入甲醛(FA，SO2的清除剂，500μM)孵育30min后，再与探针孵育，蓝色荧光消失(图24B)，由此可知图24A中的蓝色荧光是由于细胞中生理水平的SO2产生的，探针SNO可用于生理水平的SO2检测，具有较高的检测灵敏度。然后，将探针与细胞孵育15min后，再加入不同浓度的Na2SO3(10μM，20μM)，发现细胞中出现较强的蓝色荧光(图24C及D)。将细胞加入FA(500μM)后孵育30min后，与探针孵育，再与Na2SO3(20μM)孵育30min，细胞中蓝色荧光显著降低(图24E)，说明细胞中的蓝色荧光是由外源性SO2引起的。结果表明，探针SNO可以实现活细胞中生理浓度的SO2和不同浓度的外源性SO2的检测。
图24为探针SNO检测SO2的荧光成像。图24中，(A)H9C2细胞与SNO(10μM)在37℃下孵育15min；(B)细胞用甲醛(FA，500μM)预处理30min，然后与SNO(10μM)孵育15min；(C)将细胞与SNO(10μM)孵育15min，然后再与Na2SO3(10μM)孵育30min；(D)将细胞与SNO(10μM)孵育15min，然后再与Na2SO3(20μM)孵育30min；(E)将细胞提前30min给予FA(500μM)后，与探针孵育，再与Na2SO3(20μM)孵育30min；(F)以上图片(ABCDE)中细胞的平均荧光强度。###p<0.001vs.(A)column,***p<0.001vs.(D)column.
D、内源性SO2的细胞荧光成像
考察探针SNO在活细胞中的内源性SO2荧光成像。本实验采用GSH和Na2S2O3与细胞孵育的方法来诱导内源性SO2的产生。将H9C2细胞用GSH和Na2S2O3处理，孵育30min后再与探针孵育15min，发现H9C2细胞显示出明亮的蓝色荧光(图26A)。将细胞用2,4,6-三硝基苯磺酸钠(TNBS，TST酶的抑制剂)孵育1h，与GSH和Na2S2O3孵育30min，再与探针孵育，蓝色荧光显著降低(图26B)。表明探针SNO可以实现细胞内源性SO2的荧光成像。
图26为SNO检测内源性SO2的荧光成像。图26中，(A)将细胞与谷胱甘肽(GSH，500μM)和硫代硫酸钠(Na2S2O3，250μM)孵育30min，然后在37℃与SNO(10μM)进一步孵育15min；(B)将细胞与2,4,6-三硝基苯磺酸钠(TNBS，500μM)预孵育1h，然后在37℃与谷胱甘肽(GSH，500μM)和硫代硫酸钠(Na2S2O3，250μM)孵育30min，然后与SNO(10μM)孵育15min；(C)以上图片(ABC)中细胞的平均荧光强度。##p<0.01vs.(B)column.
E、NO与SO2同时存在时的细胞荧光成像
首先，将探针SNO与细胞在37℃下孵育15min，在通道1中有微弱的蓝色荧光，这是生理水平的SO2引起的荧光响应(图28B)；通道2中基本无荧光(图28C)；通道3中有微弱的红色荧光，这是生理水平的NO引起的荧光响应(图28D)。将探针与细胞孵育15min后，再与Na2SO3(20μM)孵育30min，通道1中的蓝色荧光强度显著上升，这是外源性SO2引起的荧光响应(图28G)，通道2及通道3中的荧光强度基本无变化(图28H，图28I)。之后，将探针与细胞孵育15min后，再与DEA·NONOate(20μM)孵育30min，通道3中的红色荧光强度显著增加(图28N)，而通道1及通道2中的荧光强度基本没有变化(图28L，图28M)。最后，为了验证探针SNO对同时检测NO和SO2的可行性，将探针与细胞孵育15min后，加入Na2SO3(20μM)，接着再加入DEA·NONOate(20μM)孵育30min，在通道1中的蓝色荧光强度下降(图28Q)，而通道2中有红色荧光增强(图28R)，这是由于当NO和SO2共存时，发生了FRET，说明探针SNO可用于检测NO和SO2共存时的荧光强度变化。上述结果说明探针SNO可以在三种不同的荧光信号模式下，分别和同时检测细胞内的NO和SO2。
图28为探针SNO同时检测NO和SO2的荧光成像。图28中，(A-D)将细胞与SNO(10μM)孵育15min，分别为明场，channel 1，channel 2，channel 3的图像；(E)channel 1，channel2，channel 3的(BCD)平均荧光强度；(F-I)将细胞与SNO(10μM)孵育15min，然后再与Na2SO3(20μM)孵育30min，分别为明场，channel 1，channel 2，channel 3的图像；(J)channel 1，channel 2，channel 3的(GHI)平均荧光强度；(K-N)将细胞与SNO(10μM)孵育15min，然后再与DEA·NONOate(20μM)孵育30min，分别为明场，channel 1，channel 2，channel 3的图像；(O)channel 1，channel 2，channel 3的(LMN)平均荧光强度；(P-S)将细胞与SNO(10μM)孵育15min，然后与Na2SO3(20μM)孵育30min，再与DEA·NONOate(20μM)孵育30min，分别为明场，channel 1，channel 2，channel 3的图像；(T)channel 1，channel 2，channel 3的(QRS)平均荧光强度。
实施例15、缺血再灌注损伤H9C2细胞内的一氧化氮和二氧化硫水平变化
心肌缺血再灌注损伤(I/R)是心肌组织长时间缺血损伤后恢复血液灌注引起的进一步心肌组织结构和功能上的损伤。心功能不全和心肌酶渗漏是心脏I/R损伤的特征。I/R损伤会引发一系列毒副作用，最终导致细胞死亡和器官衰竭。有研究表明在缺血早期，eNOS活性增强，NO增加，发挥心肌保护作用，随着缺血时间延长，eNOS活性降低，iNOS表达上调，释放大量NO，生成ONOO-，造成严重的氧化应激损伤和细胞凋亡。I/R心肌细胞中的亚硫酸盐含量和GOT活性明显高于心肌细胞。心肌亚硫酸盐含量与心功能呈负相关，心肌亚硫酸盐含量与酶渗漏呈正相关。综上，SO2和NO都参与了心肌缺血再灌注损伤的病理过程。研究显示，用SO2预处理可通过上调H2S/CSE通路，下调NO/iNOS通路，显著减轻I/R诱导的体内心肌损伤，其机制与心肌抗氧化能力增强有关。SO2和NO的异常生成和代谢与心肌缺血再灌注损伤的发生发展有着密切联系，它们相互作用的机制有待于进一步研究。因此，为了探索心肌缺血再灌注损伤中SO2和NO的细胞串联机制，本例应用该探针检测缺血再灌注损伤H9C2细胞中SO2和NO水平的变化，探讨SO2和NO的相互作用和串联机制。
因细胞损伤会随氧糖剥夺及复氧时间的延长而加重，为能迅速而稳定地达到氧糖剥夺复氧目的，较好地模拟体内缺血缺氧/复氧对H9C2细胞造成的损伤，本例采用氧糖剥夺及复氧(OGD/R)法，用无糖培养基代替高糖培养基在三气培养箱中模拟缺血缺氧过程。为了筛选出最佳缺氧复氧时间，将细胞置于含93.8％N2、5％CO2、1.2％O2的三气培养箱中分别进行缺氧培养0h、6h、12h、18h及24h后，用MTT法测定细胞存活率。如图29所示，缺氧6h后细胞存活率在80％左右，存活率较高，没有对细胞造成一定损伤。缺氧18h后细胞存活率在60％左右，存活率较低，不利于细胞进行下一步的复氧实验。缺氧12h后细胞存活率在60％左右，既对细胞造成一定的损伤，又可以进行复氧时间的摸索，因此将缺氧12h作为最佳缺氧时间。
之后，将H9C2细胞缺氧培养12h后，将无糖培养基更换为高糖培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养0h、2h、4h、6h及8h模拟缺血再灌注过程，用MTT法测定不同复氧时间段的细胞存活率。如图29B所示，在缺氧12h复氧2h后，细胞存活率为50％左右，造成了细胞缺血再灌注后的进一步损伤。而在缺氧12h复氧4h后细胞存活率有所改善，细胞存活率为55％左右。可能是由于重新为细胞提供了营养物质及能量供应，促进了心肌细胞的进一步改善和生长。因此，将缺氧12h复氧2h作为最佳造模时间。如图29C所示，与对照组相比I/R组H9C2细胞活性明显降低，细胞凋亡率为50％左右，细胞凋亡程度加重，可作为正式实验建立条件。
图29为缺氧复氧时间对细胞存活率的影响。图29中，(A)H9C2细胞氧糖剥夺0h、6h、12h、18h及24h后细胞的存活率。(B)H9C2细胞氧糖剥夺12h后复氧0h、2h、4h、6h及8h后细胞的存活率。(B)对照组与缺血再灌注后H9C2细胞的存活率。###p<0.001vs.(I/R)column.
接着继续探讨缺血再灌注损伤后H9C2细胞中内源性SO2和NO水平的变化。首先将未造成损伤的H9C2细胞与探针SNO孵育15min后进行荧光成像，如图30B和D所示，在通道1中有微弱的蓝色荧光，通道3中有微弱的红色荧光，这表明探针SNO能够检测出H9C2细胞生理水平的SO2和NO。然后，进行缺血再灌注损伤后H9C2细胞中细胞荧光成像，如图30F和H所示，在通道1中的蓝色荧光强度增强，通道3中的红色荧光强度增加，这说明缺血再灌注损伤后H9C2细胞内SO2水平和NO水平均增加，提示内源性SO2和NO可能参与了I/R的病理进程。有研究报道缺血再灌注损伤心肌细胞中GOT活性增强，SO2水平增加；iNOS表达增强，生成大量NO。可发现本文的实验结果与文献报道趋势一致[79,80,110]。缺血再灌注损伤可能导致心肌细胞中GOT酶活性增强和iNOS酶的表达上调，从而使得SO2和NO水平升高。综上所述，该探针可用于检测缺血再灌注损伤后H9C2细胞中SO2和NO水平的变化，并有望为心肌缺血再灌注损伤等心血管疾病中SO2和NO的细胞串联机制研究提供有效的检测方法。
图30为探针SNO在缺血再灌注损伤H9C2细胞内的荧光成像。图30为(A-D)H9C2细胞与探针SNO(10μM)在37℃下孵育15min；(E-H)缺血再灌注损伤的H9C2细胞与探针SNO(10μM)在37℃下孵育15min；(I)在缺血再灌注损伤前后H9C2细胞channel 1，channel 2，channel3的平均荧光强度。##p<0.001vs.(Channel 1)column in Control,*p<0.05vs.(Channel 3)column in Control.
Claims (6)
1.一种能分别和同时检测一氧化氮和二氧化硫的单分子荧光探针，其特征在于它具有如式SNO所示的化学结构，
2.权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于以4-二乙氨基酮酸为起始原料，与3-(1-哌嗪基)苯酚反应合成式C1化合物；式C1化合物与式B1化合物7-羟基-3-羧基香豆素反应，生成式CC2化合物；式CC2化合物在二氯甲烷中，先加入草酰氯进行反应；然后缓慢加入含有1，2-苯二胺和三乙胺的二氯甲烷溶液反应，得到式CC4化合物；式CC4化合物与乙酰丙酸、DCC和DMAP在二氯甲烷中回流反应，生成式SNO化合物，其化学合成路线如下：
其中2,4-二羟基苯甲醛和米氏酸在乙醇中回流反应制备式B1化合物7-羟基-3-羧基香豆素，其制备路线如下：
3.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于4-二乙氨基酮酸与3-(1-哌嗪基)苯酚在三氟乙酸中，加热反应，制备式C1化合物。
4.根据权利要求2所述荧光探针的制备方法，其特征在于式C1化合物与式B1化合物，以及HOBt和EDCI在DMF中反应，得到式CC2化合物。
5.权利要求1所述荧光探针在对细胞或机体内的一氧化氮和/或二氧化硫进行检测方面的应用，所述检测方面的应用不包含疾病的诊断方法。
6.权利要求1所述荧光探针在制备检测细胞或机体内一氧化氮和/或二氧化硫的试剂方面的应用。
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