CN107501221A - 一种对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针及其制备方法和用途,其中对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针,是一种香豆素衍生物荧光探针,以羟基香豆素类染料作为荧光母体,在母体分子结构上分别引入二硝基苯和烷基二胺侧链,其结构如式I所示:其中n=1‑5;R1和R2为H或C1‑6烷基;R1和R2可以相同也可以不同。本发明荧光探针对硫化氢具有高灵敏性和选择性,能快速穿越各种生物膜屏障,实现细胞及活体动物内自发性硫化氢的荧光成像。该荧光探针对硫化氢的检测范围宽,可实现对生物体内硫化氢的定量化检测,在生物领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针及其制备方法和用途,属于合成与技术应用领域。
背景技术
硫化氢(H2S)是广泛存在于哺乳动物各种组织和器官中的活性物质,在维持生物体的正常生理功能中发挥重要的作用,包括信号传导、能量产生、细胞保护、心血管调节和免疫反应等。内源性硫化氢具有很强的组织依赖性,在不同组织和器官中其含量差别很大,从纳摩尔至上百个微摩尔。生物体内异常水平的硫化氢与多种疾病相关,例如阿尔茨海默病、肝硬化、糖尿病和唐氏综合症等。
硫化氢的传统检测技术主要包括色谱分析法、比色法、原子荧光光谱法和电化学分析法等。这些检测方法需要破碎组织和细胞才能实现活体内硫化氢的微量检测,因此极大程度上限制了其在活体内硫化氢的检测中的应用。然而,荧光方法是一种高灵敏性、非侵害式和可视化的检测手段,可实现生物体内硫化氢的实时和原位成像。目前,由于多数探针膜透性差、荧光背景高和灵敏性低,限制了它们在生物体内源性硫化氢检测领域的应用。
发明内容
本发明为了解决现有检测手段中存在的技术问题,旨在提供一种对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针及其制备方法和用途。本发明荧光探针是一种荧光背景低、跨膜能力强的分子荧光探针,对硫化氢具有专一性和高灵敏性,可实现对全细胞水平及动物器官内自发性硫化氢的荧光成像。该探针用于细胞和动物培养后,无需清洗,可直接用于激光共聚焦成像。
本发明设计合成了一系列具有荧光背景低、灵敏性高和膜透性好的香豆素衍生物荧光探针。该探针分子能够快速跨越多种生物膜到达细胞各区域,并与自发性硫化氢发生反应。通过荧光成像,该探针不仅能够同时检测和定量化不同细胞器及不同细胞系中内源性硫化氢,同时还能对活动物器官中内源性硫化氢进行成像。目前,这种从亚细胞水平、全细胞到动物器官水平对自发性硫化氢的实时成像还未见报道。
本发明对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针,是一种香豆素衍生物荧光探针,以羟基香豆素类染料作为荧光母体,在母体分子结构上分别引入二硝基苯和烷基二胺侧链,其结构如式I所示:
其中n=1-5;
R1和R2为H或C1-6烷基;R1和R2可以相同也可以不同。
本发明中使用的术语:“烷基”包括直链烷基和支链烷基。
本发明对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
步骤1:羟基香豆素类染料、烷基二胺和碱依次加入到5-100mL醇中,回流下搅拌反应6-24h;反应液冷却至室温后抽滤,洗涤,得粗产品,纯化后得中间产物,其结构如式II所示:
步骤1中,羟基香豆素类染料、烷基二胺和碱的摩尔比为1:1.5:3-1:3:5。
步骤1中,所述羟基香豆素类染料的结构式如式III所示:
步骤1中,所述烷基二胺的结构式如式IV所示:
步骤1中,所述碱为三乙胺或碳酸钾;
步骤1中,所述醇为甲醇(回流温度为70℃)或乙醇(回流温度为80℃);
步骤1中,所述纯化是指通过柱色谱分离的方式纯化,洗脱剂为二氯甲烷和甲醇按体积比5:1-15:1构成。
步骤2:将中间产物和碱溶于1-100mL有机溶剂中,在N2保护、室温条件下反应0.5-2h;反应结束后加入2,4-二硝基氟苯,室温下反应过夜,抽滤,得浅黄色固体,洗涤后真空干燥,纯化后得到目标产物。
步骤2中,中间产物和碱的摩尔比为1:1-1:3,中间产物和2,4-二硝基氟苯的摩尔比为1:1-1:3。
步骤2中,所述碱为K2CO3、NaOH或KOH。
步骤2中,所述有机溶剂为DMF或THF。
步骤2中,所述纯化是指通过柱色谱分离的方式纯化,洗脱剂为二氯甲烷和甲醇按体积比10:1-50:1构成。
本发明对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针的用途,是用于水体系中硫化氢的定性或定量检测。
本发明对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针的用途,是用于人体细胞或动物体内自发性硫化氢的定性或定量检测。
所述人体细胞包括正常细胞和肿瘤细胞,具体包括人成纤维细胞、人正常乳腺上皮细胞、人包皮成纤维细胞、人正常肝细胞、人肺癌细胞、人口腔表皮样癌细胞、子宫颈癌细胞和神经母细胞等。
所述动物为野生型幼年斑马鱼。
将本发明荧光探针加入到细胞中,使其最终浓度为0.1-10μM,在37℃、5%CO2条件下培养1-100min后,进行激光共聚焦成像。
将本发明荧光探针加入到喂养斑马鱼的水中,使探针浓度为1-60μM,喂养1-300min后,用0.2-5%的琼脂糖固定后,进行激光共聚焦成像。
与现有的技术相比,本发明具有以下突出的优点和技术效果:
1、本发明合成的荧光探针是通过氨解反应和亲核取代反应获得的,反应步骤少、用料便宜、合成简单、反应条件温和。
2、本发明合成的荧光探针结构中的烷基二胺侧链可大幅度提高探针在水中的溶解度,并使其具有快速跨越细胞膜屏障的能力;高效荧光猝灭基团2,4-二硝基苯使探针具有非常弱的荧光背景,极大程度上提高了探针的检测灵敏度(检测下限为1.8×10-7M)。
3、本发明合成的荧光探针首次实现全细胞内自发性硫化氢的检测,并能区分细胞核、细胞质和溶酶体中硫化氢的差异性。
4、本发明合成的荧光探针能对不同细胞系中自发性硫化氢的差异性进行定量化检测和区分。
5、本发明合成的荧光探针成功用于斑马鱼内不同器官中内源性硫化氢的分区检测和定量化。
6、在未添加外源性H2S和刺激药物产生H2S的条件下,该荧光探针可实现从亚细胞结构到全细胞到动物器官范围内自发性H2S的检测,为真正实现自然状态下细胞和动物器官内自发性H2S的检测和生物学成像奠定基础。
附图说明
图1A为本发明荧光探针对H2S的荧光响应;图1B为探针对其它阴离子、活性氧或生物硫醇的选择性。从图1A中可以看出,探针具有很低的荧光背景,随后向探针溶液中加入不同浓度的NaHS,随其浓度增加,荧光强度逐渐增强。当加入50μM NaHS时,荧光强度增加120倍,表明探针对H2S具有很高的灵敏性,并且荧光强度与NaHS浓度之间具有很好的线性关系(R2=0.9950)。加入NaHS后,在紫外灯照射下探针溶液的颜色由无色变为亮蓝色。从图中1B中可以看出,向探针溶液中加入其它阴离子、活性氧或生物硫醇后,并没有引起明显的荧光增强,表明探针对H2S具有很好的选择性。
图2为本发明荧光探针从全细胞水平检测H2S。其中细胞核、溶酶体和线粒体定位染料分别使用的是Reddot、MitoTracker Deep Red和LysoTracker Deep Red。从图2中可以看出,来自于三种定位染料的红色荧光能够完全被源于探针的蓝色荧光覆盖,表明探针能够同时进入细胞核(图2a)、溶酶体(图2b)和线粒体(图2c)并与这些区域中的H2S发生反应。
图3A为本发明荧光探针对细胞核、细胞质和溶酶体内自发性H2S的荧光成像;图3B为图3A中红色方框中的放大图;图3C为溶酶体、细胞质和细胞核对应的平均荧光强度。溶酶体定位染料使用的是LysoTracker Deep Red。从图3B中可以看出,细胞中荧光最亮的区域是细胞核(红色圆圈所示),并且在细胞核的周围分散着许多暗点(白色箭头所示)。通过与商业定位染料的共定位实验证明这些暗点是分散在细胞质中的溶酶体,从图3B中可以看出,溶酶体中的内源性H2S的含量比细胞质(绿色方框所示)和细胞核中的低。图3C统计了溶酶体、细胞质和细胞核三个区域的平均荧光强度,这些区域之间荧光强度的差异进一步证明了细胞核中H2S的含量最多,溶酶体中的最少。
图4为本发明荧光探针对不同细胞系内自发性H2S差异性的荧光成像。从图4中可以看出,在四种正常细胞和四种肿瘤细胞中均出现了明亮的荧光,表明探针适用于多种细胞内源性H2S的检测。当这些细胞荧光强度相近时所需探针的浓度不同,证明不同细胞中内源性H2S的含量不同。
图5A为本发明荧光探针对斑马鱼内不同器官中自发性H2S的实时荧光成像;图B斑马鱼肝脏和肠道中时间依赖的平均荧光强度;图5C斑马鱼喂养硫化氢清除剂后的荧光成像(图5C-b)。从图5A中可以看出,用探针喂养斑马鱼20min后,在斑马鱼的肠道和肝脏中观察到了荧光,随着观测时间的延长,斑马鱼肠道和肝脏中荧光强度逐渐增强,60min左右达到平台期。从图5B中可以看出,肠道中的荧光强度高于肝脏,说明肠道中内源性H2S的含量高于肝脏,这可能是因为肠道在消化食物的过程中释放较多的H2S。从图5C中可以看出,先用硫化氢清除剂喂养斑马鱼,再用探针喂养后,在共聚焦显微镜下未能观察到荧光,证明斑马鱼内的荧光来源于斑马鱼器官中的内源性H2S。
具体实施方式
实施例1:
本实施例中对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针的制备方法如下:
1、含(N,N-二甲基乙二胺)侧链香豆素的合成
在装有回流冷凝管的100mL圆底烧瓶中,将1.0g 7-羟基-3-香豆素羧酸乙酯、500μL N,N-二甲基乙二胺和710μL三乙胺溶于20mL乙醇中,搅拌回流反应8h;待反应液冷却后抽滤,滤饼依次用蒸馏水、冰乙醇各洗涤三遍,得黄色固体0.4g;滤液旋干,以二氯甲烷:甲醇=9:1(v/v)作为洗脱剂,得0.2g目标产物Cda-OH。
1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ8.77(s,2H),7.79(d,J=8.4Hz,1H),6.84(d,J=8.5Hz,1H),6.75(s,1H),3.41(d,J=4.9Hz,2H),2.49-2.41(m,2H),2.23(s,6H).13C NMR(100MHz,d6-DMSO):δ164.42,161.52,161.04,156.42,147.98,131.91,114.61,112.94,110.79,101.80,57.67,44.91,40.14,36.78.HR-MS(m/z,ESI):计算值C14H15N2O4m/z=275.1032[M-H]-;实际值m/z=275.1040.
2、含(N,N-二甲基乙二胺)侧链荧光探针的合成
向150mL的三口烧瓶中依次加入0.5g化合物Cda-OH、0.37g碳酸钾及5mL DMF(除水),在N2保护、室温条件下反应1h,然后加入337μL 2,4-二硝基氟苯,室温下反应过夜,抽滤,得浅黄色固体,用水和乙醇(3×20mL)各洗涤三遍,真空干燥,二氯甲烷:甲醇=100:3(v/v)作为洗脱剂得目标产物Cda-DNP。
1H NMR(400MHz,d6-DMSO):δ8.95(d,J=2.8Hz,1H),8.92(s,1H),8.76(t,J=5.3Hz,1H),8.55(dd,J=9.2,2.8Hz,1H),8.12(d,J=8.7Hz,1H),7.52(d,J=9.2Hz,1H),7.44(d,J=2.4Hz,1H),7.32(dd,J=8.6,2.4Hz,1H),3.45-3.39(m,2H),2.42(t,J=6.2Hz,2H),2.19(s,6H).13C NMR(100MHz,d6-DMSO):δ160.79,160.18,158.82,155.36,152.82,147.06,142.97,140.45,132.50,129.92,122.18,112.08,117.68,116.35,115.94,106.64,57.61,45.05,37.08.HR-MS(m/z,ESI):计算值C20H19N4O8m/z=443.1203[M+H]+;实际值m/z=443.1227.
(探针通式(式I)中各个化合物的合成,可按照上述探针Cda-DNP的合成方法进行合成。)
3、荧光探针在水体系中的应用
取本实施例制备的荧光探针Cda-DNP溶于四氢呋喃(THF)中,配置成浓度为1mmol/L的储备液。取储备液60μL加入到100mL的锥形瓶中,用HEPES缓冲溶液(10mM,pH=7.4)与THF的体积比为7:3的混合溶液稀释至60mL,使探针的最终浓度为1μM。
a、向探针溶液中加入不同浓度的(0-100μM)NaHS标准液,以405nm为激发光,在狭缝宽均为5nm的条件下,测量探针对硫化氢的荧光响应。在365nm紫外灯下,用数码相机拍下了加入H2S前后的荧光照片。荧光光谱及荧光照片如图1A所示。
b、向探针溶液中加分别加入浓度为1mM的其它阴离子(F-、Cl-、Br-、I-、CO3 2-、HCO3 -、NO2 -、NO3 -、SO4 2-、HSO4 -、SCN-)和活性氧(H2O2和ClO-)和200μM生物硫醇(Cys、Hcy和GSH),以405nm为激发光,在狭缝宽均为5nm的条件下,测量探针对硫化氢的荧光响应,其中一组为空白对照组。在365nm紫外灯下,用数码相机拍下了加入其它阴离子、活性氧和生物硫醇前后的荧光照片。荧光光谱及荧光照片如图1B所示。
实施例2:
本实施例中对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针的制备方法如下:
步骤1及步骤2同实施例1。
3、荧光探针在人肺癌细胞成像中的应用
a、将细胞核、溶酶体和线粒体定位染料4μL Reddot、1μM LysoTracker和5μMMitoTracker分别加入到不同组人肺癌细胞中,于37℃、5%CO2条件下培养30min后,用培养基或(PBS)洗涤一次。随后将实施例1制备的荧光探针Cda-DNP加入到肺癌细胞中使其最终浓度5μM,培养30min后,进行激光共聚焦成像。成像结果见图2。
b、将溶酶体定位染料Lyso Tracker加入到肺癌细胞中使其浓度1μM,于37℃、5%CO2条件下培养30min后,用培养基或(PBS)清洗一次。随后将实施例1制备的荧光探针Cda-DNP加入到肺癌细胞中使其最终浓度3μM,培养30min后,进行激光共聚焦成像。成像结果见图3。
实施例3:
本实施例中对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针的制备方法如下:
步骤1及步骤2同实施例1。
3、荧光探针在其它细胞系成像中的应用
a、将实施例1制备的荧光探针Cda-DNP分别加入到人乳腺表皮细胞、人肺成纤维细胞、人表皮成纤维细胞、正常肝细胞、肺癌细胞、人口腔表皮样癌细胞、子宫颈癌细胞、神经母细胞使其最终浓度分别为4μM、1μM、0.7μM、0.5μM、5μM、2μM、0.8μM、0.5μM,然后在37℃、5%CO2条件下各培养30min后,进行激光共聚焦成像。成像结果见图4。
实施例4:
本实施例中对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针的制备方法如下:
步骤1及步骤2同实施例1。
3、探针在动物成像中的应用
a、取实施例1制备的荧光探针Cda-DNP加入到培养皿中使其最终浓度为20μM,随后将数条斑马鱼转至培养皿中喂养1-200min,用1.5%的琼脂糖固定,进行激光共聚焦成像。成像结果及平均荧光强度见图5A和5B。
b、先将数条斑马鱼在含有100μM硫化氢清除剂(N-甲基马来酰胺,NMM)的清水中,喂养30min后,将其转移至含20μM实施例1制备的荧光探针Cda-DNP的水溶液中继续喂养60min,用1.5%的琼脂糖固定,进行激光共聚焦成像。成像结果见图5C。
实施例5:
本实施例中对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针的制备方法如下:
1、含N-甲基丙二胺侧链香豆素的合成
在装有回流冷凝管的100mL圆底烧瓶中,将1.0g 7-羟基-3-香豆素羧酸乙酯、450μL N-甲基丙二胺和800μL三乙胺溶于20mL乙醇中,搅拌回流反应10h;待反应体系冷却至室温后抽滤,滤饼用蒸馏水、冰乙醇各洗三遍,得黄色固体;滤液旋干,以二氯甲烷:甲醇=6:1(v/v)作为洗脱剂,得目标产物Cta-OH。
2、含N-甲基丙二胺基侧链荧光探针的合成
向150mL的三口烧瓶中依次加入0.5g化合物Cta-OH、0.37g碳酸钾及5mL DMF(除水),在N2保护、室温条件下反应1h,然后加入220μL 2,4-二硝基氟苯,室温下反应过夜,抽滤,得浅黄色固体,用水洗涤三遍,真空干燥,二氯甲烷:甲醇=20:1(v/v)作为洗脱剂得目标产物Cta-DNP。
实施例6:
本实施例中对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针的制备方法如下:
1、含N,N-二乙基乙二胺侧链香豆素的合成
在装有回流冷凝管的100mL圆底烧瓶中,将1.0g 7-羟基-3-香豆素羧酸乙酯、735μL N,N-二乙基乙二胺和600μL三乙胺溶于20mL乙醇中,搅拌回流反应6h;待反应体系冷却至室温后抽滤,滤饼用蒸馏水、冰乙醇各洗三遍,得黄色固体;滤液旋干,以二氯甲烷:甲醇=8:1(v/v)作为洗脱剂,得目标产物Cma-OH。
2、含N,N-二乙基乙二胺侧链荧光探针的合成
向150mL的三口烧瓶中依次加入0.5g化合物Cma-OH、0.37g碳酸钾及5mL DMF(除水),在N2保护、室温条件下反应1h,然后加入205μL 2,4-二硝基氟苯,室温下反应过夜,抽滤,得浅黄色固体,用水洗涤三遍,真空干燥,二氯甲烷:甲醇=30:1(v/v)作为洗脱剂得目标产物Cma-DNP。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述,但并非是对发明保护范围的限制。对本发明所属技术领域的技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,所做出的若干简单的推演和替换,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针,其特征在于其结构如式I所示:
其中n=1-5;
R1和R2为H或C1-6烷基;R1和R2相同或不同。
2.一种权利要求1所述的对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
步骤1:羟基香豆素类染料、烷基二胺和碱依次加入到5-100mL醇中,回流下搅拌反应6-24h;反应液冷却至室温后抽滤,洗涤,得粗产品,纯化后得中间产物,其结构如式II所示:
步骤2:将中间产物和碱溶于1-100mL有机溶剂中,在N2保护、室温条件下反应0.5-2h;反应结束后加入2,4-二硝基氟苯,室温下反应过夜,抽滤,得浅黄色固体,洗涤后真空干燥,纯化后得到目标产物。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
步骤1中,羟基香豆素类染料、烷基二胺和碱的摩尔比为1:1.5:3-1:3:5。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
步骤1中,所述羟基香豆素类染料的结构式如式III所示:
所述烷基二胺的结构式如式IV所示:
所述碱为三乙胺或碳酸钾;
所述醇为甲醇或乙醇。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
步骤2中,中间产物和碱的摩尔比为1:1-1:3,中间产物和2,4-二硝基氟苯的摩尔比为1:1-1:3。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:
步骤2中,所述碱为K2CO3、NaOH或KOH;所述有机溶剂为DMF或THF。
7.一种权利要求1所述的对生物体内硫化氢快速响应的荧光探针的用途,其特征在于:是用于水体系中硫化氢的定性或定量检测。
8.根据权利要求7所述的用途,其特征在于:是用于人体细胞或动物体内自发性硫化氢的定性或定量检测。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于:
所述人体细胞包括正常细胞和肿瘤细胞。
10.根据权利要求8所述的用途,其特征在于:
所述动物为野生型幼年斑马鱼。
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