CN110143931A - 一种靶向溶酶体检测硫化氢的荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测硫化氢的荧光探针：。所述荧光探针可以用于检测溶液、细胞中硫氢根离子或硫离子。本发明所述的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。本发明所述的荧光探针具有溶酶体靶向性好和灵敏度高等优点，具有良好的荧光发射光谱特性（415‑600 nm），可通过绘制标准曲线进行细胞溶酶体内H₂S的定量测定，实现对细胞溶酶体内H₂S快速准确检测的目的。本发明所述荧光探针具有高特异性，在进行相应H₂S检测过程中不易受其他组分的干扰，可用于活细胞溶酶体内H₂S的实时测定，具有广阔的应用前景。

Description

一种靶向溶酶体检测硫化氢的荧光探针及其应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测硫化氢的荧光探针及其应用。

背景技术

硫化氢（H₂S）是一种具有特殊气味的气体，对环境的毒性污染已经得到深入的研究。另外，H₂S是一种重要的气体信号分子，与许多重要的生理病理过程息息相关。同时，H₂S是继一氧化碳和一氧化氮之后第三种可在生命体内发挥生理作用的内源性气体信号分子。在生理浓度水平下，H₂S参与一系列的生理调控过程，例如调节血管张力、心肌收缩、神经传导和胰岛素分泌等。细胞如果不能维持其正常的H₂S浓度，便会引起动脉和肺动脉高压、阿尔茨海默氏症、胃粘膜损伤和肝硬化等疾病。因此，选择性识别和高灵敏检测生物体内的H₂S具有十分重要的生物医学意义。溶酶体（lysosome）是细胞内主要的代谢场所，参与细胞的代谢、胞内运输、细胞膜循环和细胞凋亡等多种生理功能。因此，对细胞溶酶体内H₂S的检测对理解H₂S生物生理和病理关系，乃至疾病早期诊断具有潜在的应用价值。

传统检测H₂S的方法有质谱分析法、毛细管电泳法、高效液相色谱法和电化学分析法等，但这些方法所需的检测设备复杂，成本较高，易损伤样品。近年来灵敏度高、选择性好的荧光探针备受关注，荧光探针检测成本低廉，操作简便；荧光成像技术实现了对分析物的可视化检测，几乎不损伤样品。相比于传统检测方法，荧光探针性质优良，目前已广泛应用于临床医学和诊断学等多个领域。然而大多数检测H₂S的探针主要针对于体外以及细胞质中的H₂S的检测，很难实现细胞器水平上的内源性H₂S的检测，尤其是溶酶体靶向的H₂S的检测。且现有的制备方法存在反应步骤多以及反应条件不温和等问题。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明提供一种检测硫化氢的荧光探针，响应速度快、抗干扰能力强。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针在检测溶液中或生物细胞内硫化氢的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种检测硫化氢的荧光探针，简称CMDN，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

（1）1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基乙胺存在下，香豆素-3-羧酸和N-(2-氨基乙基)吗啉在N,N-二甲基甲酰胺中常温反应，结束后加入乙醇后有沉淀析出，减压抽滤，将所得固体旋干，旋干后得到的化合物1：

；

（2）化合物1和2,4-二硝基苯磺酰氯在碳酸钠存在下于四氢呋喃中75 ℃反应，抽滤后的固体，进行纯化，得到荧光探针。

合成路线如下：

。

一种上述荧光探针在检测溶液、细胞中硫氢根离子或硫离子的应用。

本发明的机理如下：

本发明所述的荧光探针由于硝基苯磺酰基的作用下，使得探针本身的荧光强度很弱；在HS^-或S^2-存在的环境下，诱导2,4-二硝基苯磺酰基和吗啉香豆素之间的硫醚键断裂，此时荧光探针可以发射香豆素荧光团的蓝色荧光，通过检测不同的荧光强度来测定细胞中的H₂S。

本发明具有以下优点：

本发明所述的荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。本发明所述的荧光探针具有溶酶体靶向性好和灵敏度高等优点，实现对溶酶体中H₂S的快速荧光信号响应及其实时可视化监测。检测细胞溶酶体内H₂S的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（415-600 nm），通过绘制标准曲线进行细胞溶酶体内H₂S的测定，可以实现对细胞溶酶体内H₂S快速准确检测的目的。本发明所述荧光探针具有高特异性，在进行相应H₂S检测过程中不易受其他组分的干扰，可用于活细胞溶酶体内H₂S的实时测定，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1探针CMDN的质谱图；

图2探针CMDN对不同浓度S^2-的荧光扫描图；

图3探针CMDN对S^2-的选择性分析图；

图4探针CMDN对S^2-的时间响应图；

图5探针CMDN对HeLa细胞的MTT图；

图6探针CMDN与商业探针在溶酶体中共定位的荧光成像图；

图7探针CMDN对HeLa细胞中S^2-的荧光成像图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 荧光探针的合成

（1）将香豆素-3-羧酸（1 mmol）、N-(2-氨基乙基)吗啉（1 mmol）、1-羟基苯并三唑（0.5mmol）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（3 mmol）、N,N-二异丙基乙胺（0.1 mL）和N,N-二甲基甲酰胺（5 mL）加入到25 mL单口烧瓶中，常温下搅拌5 h。使用水-二氯甲烷进行萃取，旋干后得到的化合物1；

（2）化合物1（0.6 mmol）与2,4-二硝基苯磺酰氯（1 mmol）在四氢呋喃（5 mL）条件下75℃搅拌2.5 h，抽滤，烘干。将所得固体进行柱层析（二氯甲烷:甲醇= 25:1/v:v）纯化，得到白色产物即为荧光探针CMDN，产率72%，其HRMS图谱见图1。

实施例2 荧光探针对S^2-的响应

预先准备13份5 mL的10 μM探针缓冲溶液，含20% DMSO。然后加入Na₂S溶液，使其浓度依次为0、10、20、50、80、100、150、180、200、250、300、350、400和450 μM。然后进行荧光扫描（λ_ex = 405 nm）；计算各体系中荧光强度，扫描结果如图2：随着浓度升高荧光峰值逐渐增加。

实施例3 荧光探针对不同离子的选择性

预先准备30份2 mL的10 μM探针缓冲溶液（含20% DMSO，pH = 5），然后分别向该体系中依次加入20 μL浓度为10 μM的氨基酸（Ser、Ala、Thr、Glu、Gln、Val、Asp、Leu、LLe、His、Gly和Arg），生物硫醇（Cys、GSH和Hcy）和其它离子（NaF、NaCl、NaBr、NaI、AlCl₃、KNO₃、BaCl₂、CaCl₂、H₂O₂、HClO、MgCl₂、Na₂SO₃和Na₂S）等的PBS溶液。然后进行荧光检测（λ_ex = 405 nm，λ_em= 455 nm）；计算各体系中荧光强度，以上述物质的荧光强度为纵坐标作柱状图，如图3所示，其中1-30分别为PBS、AlCl₃、BaCl₂、CaCl₂、Ser、Ala、KCl、KI、KNO₃、Thr、Glu、Gln、Val、Asp、Leu、LLe、His、Gly、Arg、 NaF、NaCl、NaBr、NaI、MgCl₂、Na₂SO₃ 、Cys、GSH、Hcy、Na₂S。结果表明，荧光探针对Na₂S的选择性远高于其它物质，表明荧光探针对S^2-的检测不仅具有高敏感性，同时也具有专一检测S^2-的特性。

实施例4 荧光探针对S^2-的响应动力学

为了测定探针与Na₂S的响应时间，我们进行了动力学实验。准备测试溶液体系：PBS 缓冲液（pH 5，20 %二甲基亚砜）中加入探针CMDN（10 µM），向溶液中加入Na₂S 100 μM，测试455 nm处溶液荧光强度随时间的变化情况。如图 4所示，前10分钟内溶液荧光强度变化明显，荧光强度在15 min内基本趋于稳定，之后荧光强度不再增强。说明探针CMDN 与S^2-的响应时间为15 min，响应速度较快。

实施例5 荧光探针对细胞的毒性

在96孔板中将HeLa细胞进行接种，使每个小孔中细胞数量均等，培养24小时。分别加入浓度为（0、2、5、10、20 μM）的探针，将HeLa细胞在37℃继续培育24小时。24小时后，加入 10μL MTT（5 mg/mL，DMSO 溶液）并孵育4小时。然后，除去培养基，向培养皿中加入100 μLDMSO，持续振荡超过10分钟，通过酶标仪测量570 nm处的吸光度。如图5所示，在探针浓度为20 μM时，细胞存活率仍然大于90%，说明探针毒性低。

实施例6 荧光探针与商业探针的共定位

将HeLa细胞放在培养基（DMEM培养液和10%胎牛血清）中，放置于条件为37℃、5% CO₂和20% O₂的培养箱中培养24-48 h。将实施例1所述的荧光探针（所述荧光探针的浓度为10 μM）和商用溶酶体定位染料Lyso-Tracker Green（所述溶酶体定位染料的浓度为1 μM）加入到HeLa细胞中，培养30 min后，进行激光共聚焦成像。蓝色通道的激发波长是405 nm。收集的波长范围是425-475 nm；绿色通道的激发波长是405 nm，收集的波长范围是500-550 nm。成像结果如图6所示，本发明的荧光探针与商用溶酶体在细胞中的荧光信号重叠系数高达0.96，说明该探针为溶酶体靶向探针。表明该荧光探针能够定位溶酶体。

实施例7 荧光探针在活细胞中的成像应用

将HeLa细胞放在培养基（DMEM培养液和10%胎牛血清）中，放置于条件为37℃、5% CO₂和20% O₂的培养箱中培养24-48 h。用微量进样器吸取本发明所述荧光探针CMDN（10 μM）注入含有HeLa细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30 min。如图7中的探针组所示，直接将荧光探针加入细胞中培养30 min后，能够观测到的蓝色荧光。这表明本发明的荧光探针能够直接检测细胞中内源性生物H₂S分子。为了验证细胞中的荧光信号确实来源于荧光探针对H₂S的响应。用H₂S的清除剂NEM（N-乙基顺丁烯二酰亚胺）预先处理细胞30 min，随后加入荧光探针再孵育30 min后进行荧光成像。如图7中的NEM+探针组所示，在细胞中几乎观察不到荧光，表明细胞中的荧光信号确实来源于荧光探针对细胞内源性H₂S的响应。最后，用NEM预先处理的细胞，加入100 μM Na₂S溶液，继续培养30 min，再加荧光探针进行培养30 min，进行荧光成像。如图7中的NEM+探针+Na₂S组所示，显示细胞中能观察到明亮的蓝色荧光。

Claims (3)

1.一种检测硫化氢的荧光探针，其化学结构式如式（I）所示：

式（I）。

2.一种如权利要求1所示的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基乙胺存在下，香豆素-3-羧酸和N-(2-氨基乙基)吗啉在N,N-二甲基甲酰胺中常温反应，结束后加入乙醇后有沉淀析出，减压抽滤，将所得固体旋干，得到的化合物1：

；

（2）化合物1和2,4-二硝基苯磺酰氯在碳酸钠存在下于四氢呋喃中75 ℃反应，抽滤后的固体，进行纯化，得到荧光探针。

3.一种如权利要求1所示的荧光探针在检测溶液、细胞中硫氢根离子或硫离子的应用。