CN116768820A - 脂滴靶向检测h2s的荧光探针、制备方法和应用及定量检测外源性h2s的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种脂滴靶向检测H2S的荧光探针、制备方法和应用及定量检测外源性H2S的方法,该荧光探针的具体结构式如下:该荧光探针既可以检测动物细胞内源性H2S、同时也可以检测植物细胞内源性H2S,具有优越的LDs靶向能力,对H2S具有较高的选择性,检测限低(1.563μM),并且不受其它干扰物质的影响。
Description
技术领域
本发明属于有机荧光探针领域,具体涉及一种脂滴靶向检测H2S的荧光探针、制备方法和应用及定量检测外源性H2S的方法。
背景技术
硫化氢(H2S)作为一种重要的生物信号分子,近年来在生物学领域和相关的跨学科研究中得到了广泛的关注。它在哺乳动物和植物系统的各种生理和病理生理过程中起着至关重要的作用。内源性H2S的异常浓度已被证明与多种疾病的产生密切相关,包括阿尔茨海默病(AD)、肺动脉高压、糖尿病和癌症。最近的研究也揭示了在植物系统中H2S对种子萌发、营养生长、器官发生、生殖生长、产量以及衰老等过程具有一定影响。此外,H2S在不同环境条件下还可调节PSⅡ有效光化学量子产量、电子传递速率、叶绿素含量、净光合速率、气孔打开/关闭和蒸腾速率等光合性状。
脂滴不仅与中性脂质储存和脂质代谢高度相关,而且还与信号转导、蛋白质降解、维持细胞能量稳态和细胞凋亡等各种重要的生理过程高度相关。脂滴作为一种生物标志物,脂滴功能障碍可导致多种疾病,包括动脉粥样硬化、癌症、2型糖尿病和神经退行性变等。此外,最近的研究表明,H2S在调节细胞脂滴的大小和数量方面起着重要作用。因此,追踪和定量脂滴中的H2S将有助于揭示相关疾病的发病机制。
荧光成像是目前监测少量H2S最强大的技术之一,作为一种无创技术,具有优异的灵敏度、易于操作、实时检测和高时空分辨率。在近些年的研究中,细胞器靶向探针的发展使亚细胞微环境的实时监测成为可能。这些努力促进了对H2S的生理和病理功能的探索。然而,到目前为止,开发用于检测活性硫物种,尤其是气体发射器H2S的脂滴靶向的探针非常有限。据调研,因为大部分荧光探针为了具有良好的细胞渗透性,提高了脂溶性,导致探针的水溶性较差,致使探针无法成功运用于完全含水的植物系统中。因此,开发灵敏和选择性的脂滴靶向探针来检测动物细胞内H2S、同时也可以检测植物细胞内H2S仍然是一个挑战。
发明内容
本发明首次构建了脂滴靶向既可检测动物细胞内源性H2S、同时也可以检测植物细胞内源性H2S的荧光探针,该荧光探针对H2S表现出显著的选择性和敏感性,具有荧光和脂滴靶向的优势,已成功地应用于肿瘤组织和拟南芥幼苗中H2S的生物成像。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
脂滴靶向检测H2S的荧光探针,该荧光探针的具体结构式如下:
作为本发明的优选,该荧光探针的荧光信号在pH 6-10的环境下增强,λex=488nm、λem=500-600nm。
本发明还提供上述脂滴靶向检测H2S的荧光探针的制备方法,该方法合成途径简洁,操作简单,具体包括以下步骤:
步骤S1:将4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲醛、1-氟-2,4-二硝基苯和碳酸钾溶于溶剂中,在常温常压下搅拌反应;
步骤S2:将步骤S1得到的中间产物与苯并噻唑-2-乙腈溶于溶剂中,加入三乙胺,在氮气保护下常温常压搅拌反应,制备得到荧光探针。
作为本发明的优选,步骤S1中4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲醛和1-氟-2,4-二硝基苯的物质的量之比为1~2:1~10;步骤S1反应所用的溶剂为N,N-二甲基乙酰胺,反应时间为2~36h;反应后需要通过硅胶色谱纯化,硅胶色谱纯化时所用的溶剂为石油醚与乙酸乙酯,石油醚与乙酸乙酯的体积比为1~20:1~2。
作为本发明的优选,步骤S2中步骤S1得到的中间产物与苯并噻唑-2-乙腈的物质的量之比为1~2:1~10;步骤S2反应所用的溶剂为二氯甲烷,反应时间为2~36h;反应后需要通过硅胶色谱纯化,硅胶色谱纯化时所用的溶剂为石油醚与乙酸乙酯,石油醚与乙酸乙酯的体积比为1~20:1~2。
本发明提供的荧光探针可以与活的HeLa细胞兼容,对脂滴具有较高的特异性,可以敏感地监测活细胞内源性H2S的水平,因此可以在制备检测细胞内源性H2S的试剂中应用,所述细胞包括动物细胞、植物细胞。
另外,本发明使用脂滴靶向检测H2S的荧光探针可视化癌细胞,发现癌细胞中的荧光信号明显强于正常细胞,表现出超过三倍的荧光增强,这是因为癌细胞中H2S水平相对较高;因此,脂滴靶向检测H2S的荧光探针可用作区分癌细胞与正常细胞的有效探针。
本发明还使用脂滴靶向检测H2S的荧光探针可视化动物癌组织,发现肿瘤组织表现出明显明亮的荧光信号,而在正常组织中可以检测到非常微弱的荧光,这是因为肿瘤组织中H2S水平明显高于正常组织,因此脂滴靶向检测H2S的荧光探针是癌症特异性的,可以在制备用于癌症诊断的检测试剂和/或试剂盒中应用。
作为本发明的优选,所述癌症包括宫颈癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌。
本发明还使用脂滴靶向检测H2S的荧光探针对作物植株中的H2S进行了监测,将拟南芥幼苗与探针BTDA-H2S共孵育2h后,可以明显地观察到荧光信号,证明该探针可以实现植物组织中H2S水平的成像;因此,可以在制备检测植物组织中H2S的试剂中应用。
本发明还提供一种定量检测外源性H2S的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
步骤S1、将含H2S的水样加入比色皿中,再加入脂滴靶向检测H2S的荧光探针,之后使用荧光手电筒照射比色皿,此时溶液会显示不同颜色;
步骤S2、捕捉彩色图像,并通过颜色识别模块读取彩色图像的RGB值;
步骤S3、根据彩色图像的G/B比值,计算H2S的含量,计算公式如下:
G/B=0.0224CH2S+0.4237
步骤S4、输出检测结果。
本发明的优点和有益效果:
(1)本发明首次构建了一种脂滴靶向既可以检测动物细胞内源性H2S、同时也可以检测植物细胞内源性H2S的荧光探针,该荧光探针具有优越的脂滴靶向能力,对H2S具有较高的选择性,检测限低(1.563μM),并且不受其它干扰物质的影响。
(2)本发明提供的荧光探针的荧光强度在pH 7.0到pH 10.0保持稳定,适合用于生理pH值的成像;另外,该探针的合成途径简洁,操作简单。
(3)本发明提供的荧光探针可用于区分癌细胞/组织与正常细胞/组织,还可用于癌症患者手术标本的诊断,其可以在制备用于癌症诊断的检测试剂和/或试剂盒中应用。
(4)本发明提供的荧光探针可以实现植物组织中H2S水平的成像,因此,可以在制备检测植物组织中H2S的试剂中应用。
(5)本发明提供的荧光探针可以与活细胞兼容,对脂滴具有较高的特异性,可以敏感地监测活细胞内源性H2S的水平,可以在制备检测细胞内源性H2S的试剂中应用。
(6)本发明的BTDA-H2S探针与不同浓度的H2S混合时,可以很容易地监测颜色的变化,且彩色图像的G/B比值与H2S的量呈良好的线性关系,因此可以将BTDA-H2S探针与智能手机的结合定量检测外源性H2S。
(7)本发明首次提出了通过RGB值可视化定量检测外源性H2S的方法,为外源性H2S的检测和定量提供了一种简单、高效、低成本的方法。
附图说明
图1是在PBS/DMSO(1/1,v/v,pH 7.4)中,加入20μM的Na2S时,BTDA-H2S(2.5μM)的紫外-可见光谱变化图。
图2是在PBS/DMSO(1/1,v/v,pH 7.4)中加入Na2S(0-100μM)后,BTDA-H2S(2.5μM)的荧光发射光谱及荧光信号与Na2S之间的线性关系图;其中,(a)是在450nm处激发的荧光发射光谱。(b)是荧光信号(515nm)与Na2S(0-40μM)之间的线性相关关系。
图3是探针的选择性及在不同pH条件荧光发射强度变化;其中,(a)是在PBS/DMSO(1/1,v/v,pH 7.4)中,BTDA-H2S(2.5μM)对每个分析物(100μM)的荧光响应;(b)是不同pH条件下(3-10)加入Na2S(100μM)后的荧光发射光谱。
图4是荧光探针BTDA-H2S与20μM Na2S在激发100分钟内的光稳定性随时间变化图。
图5是利用H2S对BTDA-H2S的传感机制示意图。
图6是荧光探针BTDA-H2S的HRMS分析图。
图7是BTDA-H2S+Na2S的HRMS分析图。
图8是BTDA的HRMS分析图。
图9是用不同浓度的BTDA-H2S(0、1、3、5、10、15、20μM)处理后的HeLa细胞的细胞活力分析图。
图10是5μM BTDA-H2S(a,e和i)与0.3μM Nile Red(b)、1μM LB-NIR(f)或1μMMTDR(j)在活的HeLa细胞中共孵育的荧光图像;(c)是(a)与(b)合并的图像,(g)是(e)与(f)合并的图像,(k)是(i)与(j)合并的图像;(d,h和l)是BTDA-H2S与Nile Red强度(PC=0.81)、LB-NIR强度(PC=0.16)和MTDR强度(PC=0.27)的皮尔逊共定位相关性;BTDA-H2S:λex=488nm,λem=500-600nm;Nile Red:λex=514nm,λem=600-650nm;LB-NIR或MTDR:λex=633nm,λem=650-750nm;比例尺:20μm。
图11是在活的HeLa细胞中H2S的荧光图像;其中,(a)是HeLa细胞与BTDA-H2S孵育(5μM);(b)是HeLa细胞先用NEM(1.0mM)预处理,然后用BTDA-H2S(5μM)孵育;(c)是NEM预处理(1.0mM)HeLa细胞与Na2S(100μM)孵育,然后与BTDA-H2S(5μM)孵育;(d-f)是(a-c)的明亮场图像;(g-i)是(a-c)与(d-f)合并的图像;BTDA-H2S:λex=488nm,λem=500-600nm;比例尺:20μm。
图12中(a-d)是用BTDA-H2S(5μM)孵育的正常细胞和癌细胞的荧光图像;(e-h)是(a-d)的明亮场图像;(i-l)是(a-d)与(e-h)的合并图像;(m)是(a-d)的平均荧光强度(±SD,n=3);BTDA-H2S:λex=488nm和λem=500-600nm,比例尺:20μm。
图13中(a-f)是在荷瘤小鼠的正常组织和肿瘤组织中,BTDA-H2S(20μM)的荧光图像;(g-l)是(a-f)的明亮场图像;(m)是(a-f)的平均荧光强度(±SD,n=3);BTDA-H2S:λex=488nm,λem=500-600nm。比例尺:200μm。
图14中(a-c)是拟南芥幼苗视野,BTDA-H2S(20μM)孵育,Na2S孵育;(d-f)是(a-c)的荧光图像。
图15智能手机辅助RGB响应检测Na2S的线性关系图。
图16是化合物1的1H NMR。
图17是化合物1的13C NMR。
图18是BTDA-H2S的1H NMR。
图19是BTDA-H2S的13C NMR。
图20是BTDA的1H NMR。
图21是BTDA的13C NMR。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明,但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数,可参照常规技术进行。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1荧光探针BTDA-H2S的制备
将4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲醛(50mg,0.26mmol)、1-氟-2,4-二硝基苯(73mg,0.39mmol)和碳酸钾(108mg,0.78mmol)溶于DMF(2mL)中。搅拌5h后反应完成,乙酸乙酯(5mL)稀释混合物,用水(3×5mL)洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥,过滤,真空浓缩,用(PE/EtOAc,5:1,v/v)洗脱纯化,得到化合物1为棕黄色固体(89mg,产率95%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.67(s,1H),8.89(d,J=2.8Hz,1H),8.42(dd,J=9.3,2.8Hz,1H),7.76(d,J=9.0Hz,1H),7.13(d,J=9.3Hz,1H),6.79(dd,J=9.0,2.5Hz,1H),6.59(d,J=2.5Hz,1H),3.45(q,J=7.0Hz,4H),1.12(t,J=7.0Hz,6H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ185.5,153.2,151.8,151.0,149.0,134.0,133.8,132.6,126.7,120.4,116.3,110.3,105.0,45.2,12.4.HRMS(ESI-TOF):calcd.for C17H18N3O6[M+H]+360.1190;found 360.1198.
将化合物1(100mg,0.28mmol)和苯并噻唑-2-乙腈(54mg,0.31mmol)加入到10mL二氯甲烷中,再加入三乙胺(37mL),在氮气下室温搅拌24小时。然后,加入冷水(20mL)猝灭反应,用二氯甲烷(3×20mL)提取混合物。有机相在无水硫酸镁上干燥,过滤,真空浓缩,用柱层析(PE/EtOAc,5:1,v/v)洗脱纯化,得到红色固体BTDA-H2S(79mg,产率55%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.89(d,J=2.7Hz,1H),8.57(d,J=9.2Hz,1H),8.34(dd,J=9.3,2.8Hz,1H),8.19(s,1H),7.99(d,J=8.1Hz,1H),7.81(d,J=7.5Hz,1H),7.48–7.41(m,1H),7.38–7.31(m,1H),7.08(d,J=9.3Hz,1H),6.73(dd,J=9.2,2.6Hz,1H),6.31(d,J=2.6Hz,1H),3.44(q,J=7.1Hz,4H),1.23(t,J=7.1Hz,6H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ155.8,155.2,153.8,152.2,141.8,138.6,134.6,131.1,129.2,126.7,125.7,123.5,122.3,121.5,118.3,117.5,111.7,110.5,102.7,45.1,12.6.HRMS(ESI-TOF):calcd.for C26H22N5O5S[M+H]+515.1336;found 516.1337.
实施例2BTDA的制备
将4-(二乙基胺)-2-羟基苯甲醛(193mg,1mmol)、苯并噻唑-2-乙腈(349mg,2.0mmol)哌啶(300μL,3.2mmol)、乙酸(300μL,5.2mmol)加入到50mL甲苯中,在氮气气氛下回流16h。冷却至室温后,用盐水洗涤混合物,并用二氯甲烷(3×15mL)萃取。有机层在无水硫酸镁上干燥。浓缩后,加入乙醚/二氯甲烷(30:1,v/v),析出沉淀得红色固体BTDA(280mg,93%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.91(s,1H),8.02(d,J=8.0Hz,1H),7.94(d,J=8.0Hz,1H),7.48(d,J=8.8Hz,2H),7.36(t,J=6.8Hz,1H),6.67(dd,J=8.8,2.4Hz,1H),6.56(d,J=2.4Hz,1H),3.45(q,J=7.2Hz,4H),1.25(t,J=7.2Hz,6H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ161.9,161.2,157.1,152.7,152.2,142.1,136.3,130.9,126.2,124.5,122.2,121.7,112.4,110.1,108.7,97.0,45.2,12.7.HRMS(ESI-TOF):calcd.for C20H20N3OS[M+H]+350.1322;found 350.1321.
实施例3BTDA-H2S对H2S的光谱响应
对BTDA-H2S进行紫外-可见光谱测试,结果如图1所示。加入Na2S后,BTDA-H2S的吸光度呈非常轻微的红移。吸收光谱没有显示出BTDA-H2S识别H2S的能力。随后对BTDA-H2S进行了荧光光谱定量实验,结果如图2a所示。在450nm的激发波长下,BTDA-H2S本身几乎没有荧光发射;当加入Na2S时,在515nm处出现了一个新的发射峰,随着Na2S浓度从0到100μM的增加,逐渐增加了32倍以上。同时,荧光颜色由无色变为亮绿色(图2a的插图)。图2b显示了0-40μM的荧光强度与BTDA-H2S浓度之间良好的线性关系(线性方程:F515 nm=19920.66CNa2S+44068.83,R2=0.998),计算出探针BTDA-H2S对Na2S的检测限为0.99μM。
本申请检测的H2S为气体,不利于实验进行,本申请实验时是通过加入Na2S来实现检测H2S,Na2S溶于水,在PBS/DMSO(1/1,v/v,pH 7.4)中电离出Na+与S2-,S2-离子与水发生水解反应(S2-+2H2O→H2S+2OH-),H2S与Na2S的量相等,可以实现原位等量生成H2S,从而实现检测H2S。上述结果可以证明,BTDA-H2S作为检测H2S的荧光探针具有巨大的潜力。
为了测试探针BTDA-H2S对H2S的选择性,本申请记录了BTDA-H2S在其他分析物(包括一些氨基酸和常见离子)存在下的荧光光谱。如图3a所示,加入Na2S后,BTDA-H2S表现出显著的荧光增强,对其他分析物的响应几乎可以忽略不计,说明该探针对H2S具有良好的响应特异性。
本申请进一步探讨了pH对BTDA-H2S对H2S选择性的影响。如图3b所示,BTDA-H2S的荧光强度在3.0~10.0的宽pH范围内几乎保持不变;加入Na2S后,当pH大于6时,荧光强度显著增加,从pH 7~10保持稳定,说明BTDA-H2S在生理pH条件下表现良好。
本申请还进行了光稳定性试验,荧光探针BTDA-H2S与20μM Na2S在激发100分钟内的光稳定性随时间的变化如图4所示,通过图4可以看出,在100min内450nm照射下没有明显的荧光猝灭,说明BTDA-H2S对光漂白的良好抗性,这对实时和长期成像至关重要,适用于生理条件下的成像应用。
实施例4探针BTDA-H2S的检测机制
本申请的荧光探针BTDA-H2S用于荧光增强H2S传感的机制如图5所示。当BTDA-H2S与H2S相互作用时,2,4-二硝基苯基的消除产生苯酸中间体,该中间体快速环化,得到高荧光的苯并噻唑基伊豆素BTDA。为了确定荧光响应机制,利用Na2S对BTDA-H2S的高分辨率质谱数据对消除物种进行了表征,如图6、图7、图8所示。加入Na2S后,游离BTDA-H2S的质量峰m/z=516.1337([BTDA-H2S+H]+,calcd for BTDA-H2S:516.1336)消失,而m/z=350.1315[BTDA-RSS+Na2S]+对应BTDA([BTDA+H]+,BTDA:350.1322),这与本申请合成的BTDA的分子量一致,这个结果表明预测的响应机制的合理性。
实施例5探针BTDA-H2S的细胞实验
细胞培养和细胞毒性试验:将HeLa、4T1、A549、MPC5、PC12和TM3细胞在添加10%胎牛血清和1%抗生素的RPMI1640或DEME培养基中,37℃,5% CO2气氛中培养。BTDA-H2S对活的HeLa细胞的细胞毒性通过标准CCK-8试验进行。将200μL细胞培养基中约1×104个细胞接种于96孔板中,然后更换为含有BTDA-H2S的新鲜培养基,其浓度分别为0μM、1μM、3μM、5μM、10μM、15μM、20μM,培养24h。用新鲜培养基洗涤细胞三次后,将180μL PBS中的20μL CCK-8加载到每个孔中,持续4小时。然后用ELISA酶标仪分析每个孔,并在450nm处检测吸光度。细胞活力以相对于对照细胞的100%代谢活性来表示。结果如图9所示,在不同浓度的BTDA-H2S孵育HeLa细胞24h后,细胞活力保持在96%以上,表明该探针可以与活细胞兼容。
共定位实验:为了研究BTDA-H2S共定位的潜力,我们进一步在活的HeLa细胞中分别用商业脂质染料(Nile Red)、线粒体染料(MitoTracker Deep Red,MTDR)和溶酶体染料(LysoBrite NIR,LB-NIR)进行了共染色实验。HeLa细胞分别与BTDA-H2S(5μM)和Nile Red(0.3μM)、LB-NIR或MTDR(1μM)共孵育30min。使用CLSM捕捉荧光图像。BTDA-H2S:λex=488nm,λem=500-600nm;Nile Red:λex=514nm,λem=600-650nm;LB-NIR:λex=633nm,λem=650-750nm;MTDR:λex=633nm,λem=650-750nm。结果如图10所示,BTDA-H2S与Nile Red有很好的重叠,皮尔逊系数(PC)为0.81。相比之下,BTDA-H2S与MTDR(PC为0.16)和LB-NIR(PC为0.27)的重叠程度较低,说明BTDA-H2S对脂滴具有较高的特异性。
敏感性实验:利用共聚焦荧光显微镜探索了BTDA-H2S在HeLa细胞内源性H2S成像中的潜在应用,结果如图11所示。将HeLa细胞与BTDA-H2S(5μM)孵育30min后,可以观察到明显的荧光信号(图11a),表明活细胞中存在内源性H2S。为了进行比较,用硫醇捕获试剂(1.0mMN-ethylmaleimid,NEM)预培养HeLa细胞,去除游离的硫醇,然后进一步与BTDA-H2S孵育细胞。当H2S值降低后,荧光强度显著降低(图11b)。然后,在NEM预处理过的HeLa细胞中加入Na2S后与BTDA-H2S孵育,再次观察到大的荧光增强(图11c)。这些结果表明,探针BTDA-H2S可以敏感地监测活细胞内源性H2S的水平。
实施例6利用BTDA-H2S对癌症组织/拟南芥幼苗进行成像
通过成像脂滴中H2S的水平,研究了BTDA-H2S在癌症细胞和正常细胞之间分化的潜在能力。为了评价BTDA-H2S的有效性,本申请对各种癌细胞(即HeLa和A549)和正常细胞(MPC5和PC12)进行了治疗和分析。癌细胞的荧光信号明显强于正常细胞,表现出超过三倍的荧光增强,如图12所示。由于癌细胞中H2S水平相对较高,从而证明了BTDA-H2S可以有效地区分正常细胞和癌细胞。
为了深入研究BTDA-H2S在诊断癌症组织方面的潜力,分别收集了荷瘤小鼠的肿瘤和主要重要器官(心、肝、脾、肺、肾),并制备了厚度为5μm的冷冻切片。与BTDA-H2S孵育30分钟后,正常组织和肿瘤组织之间存在显著差异,结果如图13所示,正常组织中绿色荧光信号很弱,说明H2S水平较低,而肿瘤组织中显示出明显的明亮和强烈的绿色荧光,肿瘤组织中H2S水平明显高于正常组织。说明BTDA-H2S探针能够轻松地可视化和区分肿瘤组织和正常组织。
进一步利用BTDA-H2S对作物植株中的H2S进行了监测。本研究选取了一株具有代表性的拟南芥幼苗作为研究对象。将拟南芥幼苗作为材料培养两周,拟南芥幼苗本身几乎没有发出绿色荧光发射,将拟南芥幼苗切片与探针BTDA-H2S(20μL)共孵育2h后,可以明显地观察到荧光信号(图14e)。而将已经与探针BTDA-H2S孵育2h的拟南芥切片与Na2S(200μM)孵育6h后,荧光信号更强(图14f)。这些结果表明,探针BTDA-H2S可以实现植物组织中细胞内H2S水平的成像,可以在制备检测植物组织中H2S的试剂中应用。
实施例7通过RGB值可视化定量检测外源性H2S的含量
本发明的BTDA-H2S探针与不同浓度的Na2S混合时,可以很容易地监测颜色的变化,结果如图15所示。本发明使用智能手机的后置摄像头捕捉加入不同浓度的Na2S时的彩色图像,并使用颜色识别模块读取不同彩色图像的RGB值,发现彩色图像的G/B比值与Na2S在5~40μM之间呈良好的线性关系(G/B=0.0224CNa2S+0.4237,R2=0.9931),LOD为1.563μM;因Na2S的量与H2S的量相等;因此,BTDA-H2S探针与智能手机的结合可以为外源性H2S的检测和定量提供了一种简单、高效、低成本的方法。
本发明将BTDA-H2S探针与智能手机结合起来,开发了一种简单、快速、可靠的检测外源性H2S的分析方法,该方法包括以下步骤:
步骤S1、将含H2S的样品(2mL水)加入比色皿中,再加入脂滴靶向检测H2S的荧光探针(25μM,50μL),之后使用荧光手电筒照射比色皿,此时溶液会显示不同颜色;
步骤S2、捕捉彩色图像,并通过颜色识别模块读取彩色图像的RGB值;
步骤S3、根据彩色图像的G/B比值,计算H2S的含量,计算公式如下:
G/B=0.0224CH2S+0.4237
步骤S4、输出检测结果。
进一步,可以使用智能手机的后置摄像头捕捉彩色图像。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述,只是用于帮助理解本发明,并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员,依据本发明的思想,还可以做出若干简单推演、变形或替换。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.脂滴靶向检测H2S的荧光探针,其特征在于,该荧光探针的具体结构式如下:
2.根据权利要求1所述的脂滴靶向检测H2S的荧光探针,其特征在于,该荧光探针的荧光信号在pH 6-10的环境下增强,λex=488nm、λem=500-600nm。
3.权利要求1所述的脂滴靶向检测H2S的荧光探针的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤S1:将4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲醛、1-氟-2,4-二硝基苯和碳酸钾溶于溶剂中,在常温常压下搅拌反应;
步骤S2:将步骤S1得到的中间产物与苯并噻唑-2-乙腈溶于溶剂中,加入三乙胺,在氮气保护下常温常压搅拌反应,制备得到荧光探针。
4.根据权利要求3所述的脂滴靶向检测H2S的荧光探针的制备方法,其特征在于,步骤S1中4-(二乙基氨基)-2-羟基苯甲醛和1-氟-2,4-二硝基苯的物质的量之比为1~2:1~10;步骤S1反应所用的溶剂为N,N-二甲基乙酰胺,反应时间为2~36h;反应后需要通过硅胶色谱纯化,硅胶色谱纯化时所用的溶剂为石油醚与乙酸乙酯,石油醚与乙酸乙酯的体积比为1~20:1~2。
5.根据权利要求3所述的脂滴靶向检测H2S的荧光探针的制备方法,其特征在于,步骤S2中步骤S1得到的中间产物与苯并噻唑-2-乙腈的物质的量之比为1~2:1~10;步骤S2反应所用的溶剂为二氯甲烷,反应时间为2~36h;反应后需要通过硅胶色谱纯化,硅胶色谱纯化时所用的溶剂为石油醚与乙酸乙酯,石油醚与乙酸乙酯的体积比为1~20:1~2。
6.根据权利要求1所述的脂滴靶向检测H2S的荧光探针在制备检测细胞内源性H2S的试剂中应用,所述细胞包括动物细胞、植物细胞。
7.根据权利要求1所述的脂滴靶向检测H2S的荧光探针在制备用于癌症诊断的检测试剂和/或试剂盒中应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述癌症包括宫颈癌、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌。
9.根据权利要求1所述的脂滴靶向检测H2S的荧光探针在制备检测植物组织中H2S的试剂中应用。
10.一种定量检测外源性H2S的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
步骤S1、将含H2S的水样加入比色皿中,再加入权利要求1所述的脂滴靶向检测H2S的荧光探针,之后使用荧光手电筒照射比色皿,此时溶液会显示不同颜色;
步骤S2、捕捉彩色图像,并通过颜色识别模块读取彩色图像的RGB值;
步骤S3、根据彩色图像的G/B比值,计算H2S的含量,计算公式如下:
G/B=0.0224CH2S+0.4237
步骤S4、输出检测结果。
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