CN107991276A - 金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法 - Google Patents

金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法，涉及以6‑氮杂‑2‑硫代胸腺嘧啶‑金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶测定方法，其特征是通过添加L‑精氨酸显著增强6‑氮杂‑2‑硫代胸腺嘧啶‑金纳米团簇的荧光强度，而精氨酸酶能特异性水解L‑精氨酸，从而减弱由L‑精氨酸引起的荧光增强现象，利用荧光光谱的特征变化，直接用于精氨酸酶及其抑制剂的测定。测定体系的荧光强度变化值∆F与精氨酸酶浓度在0.0625~1.15 U/mL范围内呈良好的线性关系，最低检测限为0.056 U/mL。本发明所构建的方法灵敏度好，选择性高，操作简便，可用于生物样品中精氨酸酶的测定。

Description

金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法
技术领域
本发明涉及以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法，属于分析化学及纳米技术领域。
背景技术
精氨酸酶主要存在于哺乳动物的肝、肾、肠和心肌细胞中。它能催化水解精氨酸生成鸟氨酸与尿素，是鸟氨酸循环重要酶系之一。精氨酸酶活性测定是肝癌、肝硬变及各类肝炎的检测指标之一。在患有肝病患者的血清中，该酶存在较高的活性水平。此外在降低血氨及平衡体内的pH值、辅助心肌梗塞的诊断等方面也具有一定的意义。尽管该酶的测定有着重要的临床价值，但以往报道的测定方法多数操作繁琐，灵敏度低，不适于临床大量标本的实验室应用。其传统测定方法为借助茚三酮反应测定酶促反应所生成的鸟氨酸，或借助Fearon反应检测所生成的尿素。二者灵敏度均较低，并且都是通过比色的方法间接测定反应产物，当复杂生物样品本身存在尿素等物质时，并不能准确的反应精氨酸的真实水平。
金纳米团簇（gold nanoclusters，AuNCs）是一种新型的荧光纳米材料，其具有尺寸小、无毒、水溶性好、光稳定性好、Stokes位移大、比表面积大、制备条件温和、表面易于修饰以及荧光性质随尺寸可调等突出优点，是近年来的研究热点。其已被广泛应用于催化、传感检测、纳米标记、医学成像和光电子学等领域。
本发明以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇作为荧光探针，提供了一种简便、灵敏的精氨酸酶及其抑制剂的检测新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法，其特征是通过添加L-精氨酸显著增强6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇的荧光强度，而精氨酸酶能特异性水解L-精氨酸，从而减弱由L-精氨酸引起的荧光增强现象，利用荧光光谱的特征变化，直接用于精氨酸酶及其抑制剂的测定。
所使用的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇采用6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶直接还原氯金酸的方法制备：15 mL浓度为80 mmol/L的含0.2 mol/L氢氧化钠的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶与15 mL浓度为10 mg/mL的氯金酸溶液混合均匀，室温下磁力搅拌1小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后获得的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液的浓度为3.3 mg/mL，所述的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液为黄色，紫外灯照射下具有绿色荧光；置于冰箱4℃避光保存。
利用6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇在526 nm处的荧光强度变化值ΔF以判断精氨酸酶及其抑制剂的含量，所使用的激发波长为472 nm。
本发明所述的金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶的测定方法，其特征是精氨酸酶的测定过程如下：150 μL浓度为2.0 mg/mL 的溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液加入到150 μL溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的L-精氨酸溶液中，然后再加入100 μL溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的样品溶液，充分混匀后置于15~60℃水浴锅中孵育2小时，反应结束后，以472 nm为激发波长，测定溶液在526 nm处的荧光强度值，并计算荧光强度变化值∆F，通过荧光强度变化值∆F标准曲线进行精氨酸酶的测定。
所使用的L-精氨酸浓度优选为2.5 mmol/L，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH值优选为9.8，反应温度优选为37℃。
所精氨酸酶测定的线性范围为0.0625~1.15 U/mL，最低检测限为0.056 U/mL。
本发明所述的金纳米团簇为荧光探针测定SD大鼠肝脏精氨酸酶的方法，包括如下步骤：取SD大鼠的肝脏组织，剪碎后匀浆处理，分次加入冰冷的蔗糖溶液，离心，取上清液加入pH为9.1的饱和硫酸铵溶液，静置，离心，去除上清后将沉淀用50 mmol/L，pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液溶解，最后用10 KDa分子量的超滤管离心，超滤纯化，得精氨酸酶测定样品溶液；150 μL浓度为2.0 mg/mL 的溶于50 mmol/L 、pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的溶于50mmol/L、 pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的L-精氨酸溶液中，然后再加入100 μL样品溶液，充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时，反应结束后，以472 nm为激发波长，测定反应液的荧光强度值F526，并计算荧光强度变化值∆F，通过荧光强度变化值∆F标准曲线进行定量，获得SD大鼠肝脏样品中精氨酸酶的含量。
所使用的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇采用以下方法制备： 15 mL浓度为80 mmol/L的含0.2 mol/L氢氧化钠的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶与15 mL浓度为10 mg/mL的氯金酸溶液混合均匀，室温下磁力搅拌1小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后获得的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液的浓度为3.3 mg/mL，所述的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液为黄色，紫外灯照射下具有绿色荧光；置于冰箱4℃避光保存。
本发明所述的金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶抑制剂的测定方法，其特征是将均溶于50 mmol/L 、pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的不同浓度的L-戊氨酸溶液与浓度为8 U/mL的精氨酸酶溶液按体积比1：1混合均匀后得到抑制剂测定的样品溶液；将150 μL浓度为2.0 mg/mL 的溶于50 mmol/L 、pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的溶于50 mmol/L 、pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的L-精氨酸溶液中，然后再加入100 μL样品溶液，充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时，反应结束后，以472 nm为激发波长，测定溶液在526 nm处的荧光强度值F526，计算抑制率，通过软件拟合得到L-戊氨酸的IC50值为5.6 mmoL/L。
具体地说，本发明采用以下技术方案：
（一）金纳米团簇荧光材料的制备
以下过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。金纳米团簇荧光材料的制备过程如下：15 mL浓度为80 mmol/L的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶（含0.2mol/L氢氧化钠）与15 mL浓度为10 mg/mL的氯金酸溶液混合均匀，室温下磁力搅拌1小时，得到6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇。所得的金纳米团簇为黄色液体，紫外灯照射下具有绿色荧光。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液（浓度为3.3 mg/mL）置于冰箱4℃避光保存。
（二）精氨酸酶活性的测定
精氨酸酶活性的测定：150 μL浓度为2.0 mg/mL 的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）加入到150 μL浓度为2.5mmol/L的L-精氨酸溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）中，然后再加入100 μL酶样品溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时。反应结束后，以472 nm为激发波长，测定溶液在526 nm处的荧光强度值F526，并计算荧光强度变化值∆F（∆F = F0 – F，其中F0为6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液与L-精氨酸混合液的荧光强度值，F为6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇/L-精氨酸混合液加入精氨酸酶反应后的荧光强度值）。通过荧光强度变化值∆F标准曲线进行精氨酸酶的测定。
（二）精氨酸酶抑制剂的测定
精氨酸酶活性的测定：将不同浓度的L-戊氨酸溶液与浓度为8 U/mL的精氨酸酶溶液（均溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中）按体积比1：1混合均匀后得到抑制剂测定的样品溶液。将150 μL浓度为2.0 mg/mL 的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的L-精氨酸溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）中，然后再加入100 μL样品溶液，充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时。反应结束后，以472 nm为激发波长，测定溶液在526 nm处的荧光强度值F526，通过软件拟合得到抑制剂的半抑制浓度（IC50）。
本发明的优点：
（1）本发明通过添加“钢化剂”L-精氨酸显著增强6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇的荧光强度，而精氨酸酶能特异性水解L-精氨酸，从而减弱由L-精氨酸引起的荧光增强现象，利用荧光光谱的特征变化，直接用于精氨酸酶及其抑制剂的测定。
（2）本发明所使用的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米簇材料制备过程简便、快速，无需任何前修饰步骤。
（3）特异性好、灵敏度高，检测过程简单，无需多步反应。
附图说明
图1为不同反应液在紫外灯下的外观图。图中：对照组A：6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇 + 缓冲液；对照组B：6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇 + L-精氨酸；实验组C：6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇 + L-精氨酸 + 精氨酸酶。
图2为不同反应液的荧光发射光谱图。图中A：6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇 + 缓冲液；图中B：6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇 + L-精氨酸；图中C：6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇 + L-精氨酸 + 精氨酸酶。
图3为L-精氨酸浓度对检测体系荧光强度变化值∆F的影响图。
图4为反应pH值对检测体系荧光强度变化值∆F的影响图。
图5为反应温度对检测体系荧光强度变化值∆F的影响图。
图6为不同浓度精氨酸酶作用下，检测体系的荧光发射光谱图。
图7为检测体系荧光强度变化值∆F与精氨酸酶浓度的线性关系图。
图8为不同酶对检测体系荧光强度的影响图，编号0~13分别为空白、精氨酸酶（1U/mL）、抗坏血酸氧化酶（1 U/mL）、脲酶（2 U/mL）、胃蛋白酶（2 U/mL）、胆碱氧化酶（2 U/mL）、乙酰胆碱酯酶（2 U/mL）、碱性磷酸酶（4 U/mL）、辣根过氧化物酶（4 U/mL）、肌氨酸氧化酶（5 U/mL）、超氧化物歧化酶（8 U/mL）、葡萄糖氧化酶（10 U/mL）、过氧化氢酶（10 U/mL）和溶菌酶（10 U/mL）。
图9为L-戊氨酸的精氨酸酶活性抑制率曲线图。
具体实施方式
实例1：
15 mL浓度为80 mmol/L的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶（含0.2 mol/L氢氧化钠）与15 mL浓度为10 mg/mL的氯金酸溶液混合均匀，室温下磁力搅拌1小时，得到6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇。所得的金纳米团簇为黄色液体，紫外灯照射下具有绿色荧光。反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后的金纳米团簇溶液（浓度为3.3 mg/mL）置于冰箱4℃避光保存。
实例2：
150 μL浓度为2.0 mg/mL的实例1制得的金纳米团簇溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的L-精氨酸溶液（溶于50 mmol/LpH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）中，然后再加入100 μL浓度为6 U/mL精氨酸酶溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时。反应结束后，将溶液置于紫外灯下观察并测定其荧光发射光谱图（激发波长为472 nm）。由图1和图2可知，加入L-精氨酸后，6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液的荧光强度显著增强；而当精氨酸酶存在时，L-精氨酸增强6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇荧光效应被明显抑制。
实例3：
150 μL浓度为2.0 mg/mL的实例1制得的金纳米团簇溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）加入到150 μL不同浓度的L-精氨酸溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）中，然后再加入100 μL浓度为6 U/mL精氨酸酶溶液（溶于50mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时。反应结束后，测定反应液在526 nm的荧光强度值（激发波长为472 nm），并计算荧光强度变化值∆F。由图3可知，随着L-精氨酸浓度的增大，体系的荧光强度变化值∆F不断增加；当L-精氨酸浓度为2.0~2.8 mmol/L时，体系的荧光强度变化值∆F趋于稳定。因此，本发明选择L-精氨酸的最佳浓度为2.5 mmol/L。
实例4：
150 μL浓度为2.0 mg/mL的实例1制得的金纳米团簇溶液（溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的L-精氨酸溶液（溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）中，然后再加入100 μL浓度为6 U/mL精氨酸酶溶液（溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时。反应结束后，测定反应液在526 nm的荧光强度值（激发波长为472 nm），并计算荧光强度变化值∆F。甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH值在8~11.5间变化。由图4可知，当反应pH值为9.8时，体系的荧光强度变化值∆F达到最大。因此，本发明选择甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的最佳 pH值为9.8。
实例5：
150 μL浓度为2.0 mg/mL的实例1制得的金纳米团簇溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的L-精氨酸溶液（溶于50 mmol/LpH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）中，然后再加入100 μL浓度为6 U/mL精氨酸酶溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），充分混匀后置于15~60℃水浴锅中孵育2小时。反应结束后，测定反应液在526 nm的荧光强度值（激发波长为472 nm），并计算荧光强度变化值∆F。由图5可知，当反应温度为37℃时，体系的荧光强度变化值∆F达到最大。因此，本发明选择的最佳反应温度为37℃。
实例6：
150 μL浓度为2.0 mg/mL的实例1制得的金纳米团簇溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的L-精氨酸溶液（溶于50 mmol/LpH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）中，然后再加入100 μL不同浓度的精氨酸酶溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时。反应结束后，以472 nm为激发波长，测定反应液的荧光发射光谱图。由图6可知，随着精氨酸酶浓度的增加，体系的荧光强度值不断降低。由图7可知，在0.0625~1.15 U/mL范围内，荧光强度变化值∆F与精氨酸酶浓度呈线性关系，最低检测限为0.056 U/mL。
实例7：
150 μL浓度为2.0 mg/mL的实例1制得的金纳米团簇溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的L-精氨酸溶液（溶于50 mmol/LpH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）中，然后再加入100 μL浓度为2 U/mL的精氨酸酶溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时。反应结束后，以472 nm为激发波长，测定反应液的荧光强度值F526。重复上述实验步骤10次，得相对标准偏差（RSD）为0.9%，表明本方法重现性良好。
实例8：
150 μL浓度为2.0 mg/mL的实例1制得的金纳米团簇溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的L-精氨酸溶液（溶于50 mmol/LpH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）中，然后再加入100 μL不同酶的干扰溶液（溶于50mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时。反应结束后，以472 nm为激发波长，测定反应液的荧光强度值F526。由图8可知，本发明所构建的测定方法对精氨酸酶具有良好的选择性。
实例9：
SD大鼠肝脏精氨酸酶的测定：取SD大鼠的肝脏组织，剪碎后匀浆处理，分次加入冰冷的蔗糖溶液，离心，取上清液加入pH为9.1饱和硫酸铵溶液，静置，离心，去除上清后将沉淀用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（50 mmol/L，pH=9.8）溶解，最后用10 KDa分子量的超滤管离心，超滤纯化，得精氨酸酶测定样品溶液。150 μL浓度为2.0 mg/mL的实例1制得的金纳米团簇溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的L-精氨酸溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）中，然后再加入100 μL样品溶液，充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时。反应结束后，以472 nm为激发波长，测定反应液的荧光强度值F526，并计算荧光强度变化值∆F，结合实例6计算SD大鼠肝脏样品中精氨酸酶的含量，样品测定回收率为102.8%~118.0%，相对标准偏差为0.5~1.8%。
实例10：
精氨酸酶抑制剂的测定：将不同浓度的L-戊氨酸溶液与浓度为8 U/mL的精氨酸酶溶液（均溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中）按体积比1：1混合均匀后得到抑制剂测定的样品溶液。将150 μL浓度为2.0 mg/mL的实例1制得的金纳米团簇溶液（溶于50mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的L-精氨酸溶液（溶于50 mmol/L pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）中，然后再加入100 μL样品溶液，充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时。反应结束后，以472 nm为激发波长，测定溶液在526nm处的荧光强度值F526，计算抑制率。结果如图9示，通过软件拟合得到L-戊氨酸的IC50值为5.6 mmoL/L。

Claims (9)

1.一种金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法，其特征是通过添加L-精氨酸显著增强6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇的荧光强度，而精氨酸酶能特异性水解L-精氨酸，从而减弱由L-精氨酸引起的荧光增强现象，利用荧光光谱的特征变化，直接用于精氨酸酶及其抑制剂的测定。
2.根据权利要求1所述的金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法，其特征是所使用的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇采用6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶直接还原氯金酸的方法制备：15 mL浓度为80 mmol/L的含0.2 mol/L氢氧化钠的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶与15 mL浓度为10 mg/mL的氯金酸溶液混合均匀，室温下磁力搅拌1小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后获得的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液的浓度为3.3 mg/mL，所述的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液为黄色，紫外灯照射下具有绿色荧光；置于冰箱4℃避光保存。
3.根据权利要求1或2所述的金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶及其抑制剂的测定方法，其特征是利用6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇在526 nm处的荧光强度变化值ΔF以判断精氨酸酶及其抑制剂的含量，所使用的激发波长为472 nm。
4.一种金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶的测定方法，其特征是精氨酸酶的测定过程如下：150 μL浓度为2.0 mg/mL 的溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液加入到150 μL溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的L-精氨酸溶液中，然后再加入100 μL溶于50 mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的样品溶液，充分混匀后置于15~60℃水浴锅中孵育2小时，反应结束后，以472 nm为激发波长，测定溶液在526 nm处的荧光强度值，并计算荧光强度变化值∆F，通过荧光强度变化值∆F标准曲线进行精氨酸酶的测定。
5.根据权利要求4所述的一种金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶的测定方法，其特征是所使用的L-精氨酸浓度优选为2.5 mmol/L，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的pH值优选为9.8，反应温度优选为37℃。
6.根据权利要求4所述的一种金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶的测定方法，其特征是所精氨酸酶测定的线性范围为0.0625~1.15 U/mL，最低检测限为0.056 U/mL。
7.一种金纳米团簇为荧光探针测定SD大鼠肝脏精氨酸酶的方法，包括如下步骤：取SD大鼠的肝脏组织，剪碎后匀浆处理，分次加入冰冷的蔗糖溶液，离心，取上清液加入pH为9.1的饱和硫酸铵溶液，静置，离心，去除上清后将沉淀用50 mmol/L，pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液溶解，最后用10 KDa分子量的超滤管离心，超滤纯化，得精氨酸酶测定样品溶液；150 μL浓度为2.0 mg/mL 的溶于50 mmol/L 、pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的溶于50 mmol/L、 pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的L-精氨酸溶液中，然后再加入100 μL样品溶液，充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时，反应结束后，以472 nm为激发波长，测定反应液的荧光强度值F526，并计算荧光强度变化值∆F，通过荧光强度变化值∆F标准曲线进行定量，获得SD大鼠肝脏样品中精氨酸酶的含量。
8.根据权利要求7所述的一种金纳米团簇为荧光探针测定SD大鼠肝脏精氨酸酶的方法，其特征是所使用的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇采用以下方法制备： 15 mL浓度为80 mmol/L的含0.2 mol/L氢氧化钠的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶与15 mL浓度为10 mg/mL的氯金酸溶液混合均匀，室温下磁力搅拌1小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行纯化处理，纯化后获得的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液的浓度为3.3 mg/mL，所述的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液为黄色，紫外灯照射下具有绿色荧光；置于冰箱4℃避光保存。
9.一种金纳米团簇为荧光探针的精氨酸酶抑制剂的测定方法，其特征是将均溶于50mmol/L 、pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的不同浓度的L-戊氨酸溶液与浓度为8 U/mL的精氨酸酶溶液按体积比1：1混合均匀后得到抑制剂测定的样品溶液；将150 μL浓度为2.0mg/mL 的溶于50 mmol/L 、pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶-金纳米团簇溶液加入到150 μL浓度为2.5 mmol/L的溶于50 mmol/L 、pH=9.8的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的L-精氨酸溶液中，然后再加入100 μL样品溶液，充分混匀后置于37℃水浴锅中孵育2小时，反应结束后，以472 nm为激发波长，测定溶液在526 nm处的荧光强度值F526，计算抑制率，通过软件拟合得到L-戊氨酸的IC50值为5.6 mmoL/L。
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