CN106831634A - 一种检测丙氨酸氨肽酶的比率型荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种检测丙氨酸氨肽酶的比率型荧光探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测丙氨酸氨肽酶的荧光探针及其制备方法与应用。所述荧光探针为式Ⅰ所示化合物。本发明所述的荧光探针可应用于生物样品中丙氨酸氨肽酶的检测和成像。该探针作为丙氨酸氨肽酶的特异性探针，仅在丙氨酸氨肽酶存在的条件下，能够水解脱去探针中丙氨酸，生成具有新荧光信号的荧光物质，荧光信号既可以表现为增强也可以表现为比率变化，实现了对该酶的测定及成像。

Description

一种检测丙氨酸氨肽酶的比率型荧光探针及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于分子检测和分子成像领域，具体涉及一种检测丙氨酸氨肽酶的比率型荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
丙氨酸氨肽酶是Ⅱ型膜结合金属蛋白酶，能够特异性的将N-末端的丙氨酸从肽链上切割下来，对于细胞内氨基酸的循环具有重要的意义。更重要的是，丙氨酸氨肽酶在生物体内发挥着非常重要的作用，是研究疾病诊断、治疗的重要指标。丙氨酸氨肽酶是重要的癌症标志物，临床上尿丙氨酸氨肽酶也对肾脏疾病早期诊断有一定价值。由于目前用于丙氨酸氨肽酶检测的荧光探针存在分析波长短、检测灵敏度低等弊端，试剂盒的操作又非常繁冗，因此，发展一种高灵敏的快速检测丙氨酸氨肽酶的荧光探针具有非常大的应用价值。
甲酚紫因具有分析波长长、量子产率高、稳定性好的优点被广泛应用于生物分析中，而基于甲酚紫检测丙氨酸氨肽酶的长波长比率型荧光探针尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测丙氨酸氨肽酶的荧光探针及其制备方法与应用。
本发明提供了一种式Ⅰ所示化合物：
本发明进一步提供了上述式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
1)在偶联剂存在下，将Boc-丙氨酸与甲酚紫进行缩合反应，得到式Ⅱ所示化合物；
其中，Boc-丙氨酸表示叔丁氧羰基保护的丙氨酸；
2)将式Ⅱ所示化合物在酸性条件下水解，得到上述式Ⅰ所示化合物。
上述方法步骤1)中，所述偶联剂具体可为2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)。
所述偶联剂与Boc-丙氨酸的摩尔比可为1-3:1，具体可为1:1。
所述Boc-丙氨酸与甲酚紫的摩尔比可为1:1-3，具体可为1:1.2。
所述缩合反应可在有机溶剂中进行，所述有机溶剂具体可为二氯甲烷。
所述缩合反应的反应温度可为0-50℃，时间可为1-24小时。
上述方法步骤2)中，所述水解具体可在三氟乙酸作用下进行。
所述水解的温度可为0-50℃，时间可为0.5-24小时。
本发明进一步提供了一种检测丙氨酸氨肽酶的试剂盒，包括式Ⅰ所示化合物。
式Ⅰ所示化合物或上述试剂盒可应用于生物样品中丙氨酸氨肽酶的检测及成像。
本发明还提供了一种检测丙氨酸氨肽酶的方法。
本发明所提供的检测丙氨酸氨肽酶的方法，包括下述步骤：
(1)以磷酸盐缓冲液为溶剂配制不同浓度的丙氨酸氨肽酶的标准浓度溶液，向所述不同浓度的丙氨酸氨肽酶的标准浓度溶液中分别加入等量的式Ⅰ所示化合物，反应，测量反应后体系的荧光发射光谱；
(2)提取荧光发射光谱中575nm和626nm处的荧光强度，记为F1、F2，计算荧光强度比值R＝F2/F1，以丙氨酸氨肽酶的浓度C为横坐标，荧光强度比值R为纵坐标，绘制标准曲线；
(3)将待测样品用所述磷酸盐缓冲液稀释，加入式Ⅰ所示化合物，使得体系中的式Ⅰ所示化合物的浓度与步骤(1)中式Ⅰ所示化合物在丙氨酸氨肽酶的标准浓度溶液中的浓度相等，反应，测量反应后体系的荧光发射光谱，计算626nm与575nm处的荧光强度比值R'；根据步骤(2)中的标准曲线，得到所述待测样品中丙氨酸氨肽酶的含量。
上述方法步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲液的pH可为7.4。
所述不同浓度的丙氨酸氨肽酶的标准浓度溶液的浓度分别为0，0.5，1，2，3，4，5，6，8，10，15，30，50和100ng/mL。
式Ⅰ所示化合物在所述标准浓度溶液中的浓度可为0.5-10μM，具体可为5μM。
所述反应的温度为15-42℃，具体可为37℃，时间为15-60分钟，具体可为30分钟。
所述荧光发射光谱测量中，激发波长具体可为525nm。
本发明所述的荧光探针可应用于生物样品中丙氨酸氨肽酶的检测和成像。该探针作为丙氨酸氨肽酶的特异性探针，仅在丙氨酸氨肽酶存在的条件下，能够水解脱去探针中的丙氨酸，生成具有新荧光信号的荧光物质，荧光信号既可以表现为增强也可以表现为比率变化，实现了对该酶的测定及成像。
本发明具有以下优点：
1、本发明荧光探针在溶液中呈浅橙色，与丙氨酸氨肽酶反应后，肉眼即可观察到溶液变为明显的紫红色。
2、本发明荧光探针具有长的荧光激发波长和发射波长。
3、本发明荧光探针所产生的荧光信号既可以表现为荧光增强也可以表现为比率变化，能有效降低生物复杂环境的干扰。
4、本发明对丙氨酸氨肽酶的响应呈线性关系，可以用于该酶的定量测定。
5、本发明对丙氨酸氨肽酶具有高灵敏的响应，可与用于该酶的痕量测定。
6、本发明仅在丙氨酸氨肽酶存在的条件下产生信号，其它常见的无机盐、氨基酸、活性氧，特别其他的氨肽酶等均不产生干扰。
7、本发明化合物溶解性好，可直接用于生物样品中丙氨酸氨肽酶的检测及成像。
8、本发明具有操作简便，成本低，易于推广的优点。
附图说明
图1为本发明式I所示化合物的化学反应方程式与合成路线。
图2为本发明荧光探针对不同浓度丙氨酸氨肽酶的荧光响应图。
图3为本发明荧光探针的荧光比率变化对丙氨酸氨肽酶浓度的标准曲线。
图4为本发明试剂盒对不同物质响应的柱状图。
图5为本发明试剂盒分别用于LO2和HepG2细胞的共聚焦成像图。
图6为本发明试剂盒分别用于正常培养的HepG2细胞以及预先与抑制剂孵育过的HepG2细胞的共聚焦成像图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、丙氨酸氨肽酶检测的荧光探针(式Ⅰ化合物)的制备
按照图1所示的化学反应流程图进行制备。
步骤1)：将1mmol Boc-丙氨酸、1mmol HATU及1mmol N-乙基二异丙胺溶于二氯甲烷中，在冰浴条加下反应30分钟。然后加入1.2mmol甲酚紫，室温下反应过夜后，过滤，然后滤液减压蒸干，得到的粗产品。用柱层析分离提纯得到式Ⅱ所示化合物。
步骤2)：将0.1mmol式Ⅱ所示化合物溶于无水二氯甲烷中，然后加入三氟乙酸，在Ar气保护下搅拌2小时，然后减压蒸干，得到粗产品。用柱层析分离，得到最终产物(式Ⅰ)，产品为橘红色固体。
结构确证结果如下：1H NMR(400MHz,298K,CD3OD):δ8.84(d,1H,J＝8.0Hz),8.38(d,1H,J＝8.0Hz),8.17(s,1H),8.00(t,1H,J＝7.2Hz),7.92(m,2H),7.65(d,1H,J＝8.0Hz),6.92(s,1H),4.25(m,1H,J＝6.8Hz),1.67(d,1H,J＝6.8Hz).13C NMR(100MHz,298K,CD3OD):δ179.9,169.8,162.4,154.8,147.5,143.6,143.0,142.6,133.6,130.5,130.3,129.5,128.8,123.8,120.0,118.1,115.9,114.3,107.4,105.8,53.9,52.2,47.8,41.6,30.2,28.2,25.5,25.0,23.3,22.4,21.9,21.6,11.6.HR-ESI-MS:m/z calcd.(C19H16N4O2 +,M+),333.1273；found,333.1345.
由上述谱图数据，可确认本实施例制备得到的化合物的结构式为式Ⅰ。
实施例2、荧光探针在检测丙氨酸氨肽酶中的应用
1)称取3.33mg实施例1所得式I化合物为荧光探针，溶于10mL溶剂二甲基亚砜，配成荧光探针储备液(又称探针母液，1mM)。
2)制作标准曲线：
配制丙氨酸氨肽酶的标准浓度溶液，浓度分别为0，0.5，1，2，3，4，5，6，8，10，15，30，50和100ng/mL，溶剂为pH 7.4的磷酸盐缓冲液。
取25μL探针母液加入5mL不同浓度的丙氨酸氨肽酶的标准溶液中，于37℃反应30分钟，测量其荧光发射光谱，激发波长为525nm，所得荧光光谱为图2。
提取575nm和626nm处的荧光强度，记为F1、F2，并计算荧光强度比值R＝F2/F1。以丙氨酸氨肽酶的浓度C为横坐标，荧光强度比值R为纵坐标，绘制标准曲线，所得标准曲线如图3所示。
3)检测待测样品中丙氨酸氨肽酶的含量：
将待测样品用pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释至5mL，加入25μL探针母液，于37℃反应30分钟，测量其荧光发射光谱，激发波长为525nm，测量575nm和626nm处的荧光强度比值，记为R'；
将R'代入所述步骤2)所得标准曲线，即得到所述待测样品中丙氨酸氨肽酶的浓度，进而得到待测样品中丙氨酸氨肽酶的含量。
实施例3、荧光探针的选择性研究
本发明荧光探针对不同物质的响应柱状图如图4所示，可见其他物质与荧光探针几乎无响应。检测物质分别为：KCl，150mM；CaCl2，2.5mM；MgCl2，2.5mM；FeCl3，100μM；ZnSO4，100μM；CuSO4，10μM；cysteine，1mM；glutathione，1mM；alanine，1mM；arginine，1mM；glucose，1mM；vitamin C，1mM；urea，20mM；creatinine，10mM；NaOCl，100μM；H2O2，100μM；焦谷氨酸氨肽酶(PGP-1)，200ng/mL；亮氨酸氨肽酶(LAP)，200ng/mL；γ-谷氨酰转肽酶(GGT)，200ng/mL；丙氨酸氨肽酶(APN)，50ng/mL；式Ⅰ所示化合物的浓度为5μM。
实施例4、应用荧光探针检测细胞中的丙氨酸氨肽酶
1)在37℃和5％CO2条件下，用含有10％(v/v)胎牛或小牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL的链霉素的DMEM培养基培养细胞(培养的细胞为人肝癌细胞HepG2和正常肝细胞LO2)。细胞使用之前用DMEM清洗。
2)在细胞中加入1mL DMEM培养液，再加入实施例2中所述探针母液(5μL)孵育50分钟后进行共聚焦荧光成像，激发波长为515nm，收集波段为500-580nm和640-675nm。
如图5所示为本发明荧光探针分别用于人肝癌细胞HepG2(丙氨酸氨肽酶高表达)和正常肝细胞LO2(丙氨酸氨肽酶低表达)的共聚焦成像图。
如图6所示为本发明荧光探针用于丙氨酸氨肽酶抑制剂(贝他定)孵育过的HepG2细胞的共聚焦成像图。由上述结果表明本发明荧光探针可以测定细胞中的丙氨酸氨肽酶。
最后应说明的是：上述实施例仅举出以式Ⅰ为荧光试剂，反应体系中含探针为5μM，缓冲溶液为0.01M磷酸盐且反应时间为30-50分钟的情况。其余荧光试剂浓度和反应时间的结果不一一列出，然而并非用于限定本发明。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，应当可以作出各种修改与变更。

Claims (8)

1.式Ⅰ所示化合物：
2.权利要求1中式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
1)在偶联剂存在下，将Boc-丙氨酸与甲酚紫进行缩合反应，得到式Ⅱ所示化合物；
其中，Boc-丙氨酸表示叔丁氧羰基保护的丙氨酸；
2)将式Ⅱ所示化合物在酸性条件下水解，得到上述式Ⅰ所示化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述偶联剂为2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；
所述偶联剂与Boc-丙氨酸的摩尔比为1-3:1；
所述Boc-丙氨酸与甲酚紫的摩尔比为1:1-3；
所述缩合反应在有机溶剂中进行；
所述缩合反应的反应温度为0-50℃，时间为1-24小时。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述水解在三氟乙酸作用下进行；
所述水解的温度为0-50℃，时间可为0.5-24小时。
5.一种检测丙氨酸氨肽酶的试剂盒，包括式Ⅰ所示化合物。
6.权利要求1中式Ⅰ所示化合物或权利要求5中的试剂盒在丙氨酸氨肽酶检测和成像中的应用。
7.一种检测丙氨酸氨肽酶的方法，包括下述步骤：
(1)以磷酸盐缓冲液为溶剂配制不同浓度的丙氨酸氨肽酶的标准浓度溶液，向所述不同浓度的丙氨酸氨肽酶的标准浓度溶液中分别加入等量的式Ⅰ所示化合物，反应，测量反应后体系的荧光发射光谱；
(2)提取荧光发射光谱中575nm和626nm处的荧光强度，记为F1、F2，计算荧光强度比值R＝F2/F1，以丙氨酸氨肽酶的浓度C为横坐标，荧光强度比值R为纵坐标，绘制标准曲线；
(3)将待测样品用所述磷酸盐缓冲液稀释，加入式Ⅰ所示化合物，使得体系中的式Ⅰ所示化合物的浓度与步骤(1)中式Ⅰ所示化合物在丙氨酸氨肽酶的标准浓度溶液中的浓度相等，反应，测量反应后体系的荧光发射光谱，计算626nm与575nm处的荧光强度比值R'；根据步骤(2)中的标准曲线，得到所述待测样品中丙氨酸氨肽酶的含量。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4；
所述不同浓度的丙氨酸氨肽酶的标准浓度溶液的浓度分别为0，0.5，1，2，3，4，5，6，8，10，15，30，50和100ng/mL；
式Ⅰ所示化合物在所述标准浓度溶液中的浓度为0.5-10μM；
所述反应的温度为15-42℃，时间为15-60分钟；
所述荧光发射光谱测量中，激发波长为525nm。
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